張安紅 ， 肖娟麗 ， 趙戰(zhàn)勝 ， 王志安 ， 劉圓 ， 羅曉麗

1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)棉花研究所，山西 運(yùn)城 044000；2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第六師農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，新疆 五家渠 831300

我國棉花的生產(chǎn)和消費(fèi)在國民經(jīng)濟(jì)中占有舉足輕重的地位。然而，棉花在整個生長發(fā)育階段易受到多種害蟲的危害。利用植物基因工程和遺傳育種技術(shù)手段培育的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉為控制棉鈴蟲的危害提供了新手段。轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉花自種植以來，能有效地控制棉鈴蟲的種群數(shù)量，減少農(nóng)藥使用，在生產(chǎn)上取得了顯著的經(jīng)濟(jì)、生態(tài)和社會效益。隨著抗蟲棉的廣泛種植與田間農(nóng)藥用量的大幅度減少，棉田的生態(tài)系統(tǒng)也隨之發(fā)生了很大的變化，棉鈴蟲的危害得到了有效防治。然而，種植過程中棉蚜、盲蝽蟓、煙粉虱等非靶標(biāo)類害蟲數(shù)量有大幅度增加的趨勢，尤其是盲蝽類昆蟲，對棉花的生產(chǎn)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失［1-2］。

隨著基因工程技術(shù)的快速發(fā)展，為了維持轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的抗蟲穩(wěn)定性，延緩棉鈴蟲對抗蟲棉的抗性，并對棉田次要害蟲進(jìn)行有效防治，廣大轉(zhuǎn)基因抗蟲棉研究工作者做了大量的研究，轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的研究得到了迅猛發(fā)展。目前，國內(nèi)外已在防治棉盲蝽的轉(zhuǎn)Bt基因棉花、營養(yǎng)殺蟲蛋白Vip3棉花、RNAi轉(zhuǎn)基因抗蟲棉花以及通過基因編輯創(chuàng)制抗蟲棉花等多個方面取得了進(jìn)展。

1 轉(zhuǎn)外源蘇云金芽孢桿菌殺蟲晶體蛋白系列抗蟲棉

1981年，Schnepft和Whiteley首次克隆了編碼Bt殺蟲晶體蛋白的基因。截至目前，研究者已分離出40000多個Bt菌株，發(fā)現(xiàn)并登記的這類基因大約有190種，但已完成轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的僅有cry1Ac、cry1F、cry2Ab及cry2Ae等。經(jīng)過密碼子優(yōu)化的Bt基因已被成功地導(dǎo)入棉花，獲得了一大批具有良好抗蟲性的轉(zhuǎn)基因棉花種質(zhì)資源和品種，在生產(chǎn)上顯示出良好的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益［3］。

1.1 防治鱗翅目害蟲棉花

目前，我國種植的轉(zhuǎn)基因棉花主要表達(dá)cry1Ab/Ac基因。1992年，郭三堆等［4］利用分子設(shè)計技術(shù)人工合成了具有高殺蟲活性的Bt殺蟲基因GFM Cry1A。隨后，在1994年與山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所合作將該基因?qū)朊藁?，選育出晉棉26轉(zhuǎn)基因抗蟲棉品種，之后又選育出GK1、GK12、GK19、GKZ1國產(chǎn)單價轉(zhuǎn)基因抗蟲棉品種，并進(jìn)行大面積推廣應(yīng)用，使中國成為繼美國之后世界上第二個成功研制轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的國家。為了提高抗蟲棉的殺蟲效率，延緩棉鈴蟲等害蟲對殺蟲蛋白產(chǎn)生抗性，郭三堆等［4］將具有不同殺蟲機(jī)理的2個抗蟲基因GFM Cry1A和Cpti同時導(dǎo)入棉花，創(chuàng)制了雙價轉(zhuǎn)基因棉花新種質(zhì)。通過與國內(nèi)多家育種單位合作，成功選育出sGK321（1998年）、中棉所41（2001年）和中棉所45（2003年）等雙價轉(zhuǎn)基因抗蟲棉品種。劉志等［5］將Cry1A和雪花蓮凝集素基因GNA導(dǎo)入棉花，選育獲得轉(zhuǎn)Cry1A+GNA雙基因抗蟲棉純合株系TBG，其在苗期、蕾期、開花期和結(jié)鈴期主莖葉都對棉鈴蟲幼蟲具有很高的殺蟲活性。吳家和等［6］將人工設(shè)計合成的Cry1Ac、Bt29K和慈菇蛋白酶抑制劑基因API-B導(dǎo)入棉花，培育出9個抗蟲性好、農(nóng)藝性狀優(yōu)良的轉(zhuǎn)基因棉品系，對棉鈴蟲抗性均達(dá)到90%以上。張林水等［7］將Cry1Ac3和Cpti的融合基因與GNA共轉(zhuǎn)入棉花中，獲得了同時含有3個抗蟲基因的轉(zhuǎn)基因棉花新材料，該材料對棉鈴蟲具有較高的抗性。自1997年轉(zhuǎn)基因棉花開始商業(yè)化種植以來，種植規(guī)模逐年快速增長，由當(dāng)年的10萬hm2增長到390萬hm2，占棉花總種植面積的92%以上。其中，長江流域棉區(qū)和黃河流域棉區(qū)所種棉花幾乎全部為轉(zhuǎn)基因棉。到2002年，國產(chǎn)抗蟲棉的種植面積達(dá)轉(zhuǎn)基因棉總種植面積的52%，首次超過國外品種；到2005年，這一比率超過了73%。目前，國產(chǎn)抗蟲棉品種已超過98%，在我國市場中占絕對主導(dǎo)地位［4］。

在開發(fā)新的Bt系列基因方面，湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)棉花研究所采用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)與花粉管通道方法相結(jié)合，將來源于蘇云金芽孢桿菌的另外一株革蘭氏陽性菌株的Cry5b抗蟲基因轉(zhuǎn)入岱字棉品系晉1中，并育成了抗蟲棉品系JX0010和JX0020。Cry5b抗蟲基因與目前國內(nèi)外推廣應(yīng)用的Bt抗蟲基因Cry1a/1c不同。趙世浩［8］對Cry5b轉(zhuǎn)基因品系進(jìn)行了表達(dá)驗證和生物安全性評價，鑒定結(jié)果表明JX0020對棉鈴蟲有較高的抗性，這為新型抗蟲基因在棉花育種及品種推廣上的應(yīng)用提供了數(shù)據(jù)支撐。獲得美國國家環(huán)境保護(hù)局［9］（Environmental Protection Agency，EPA）批準(zhǔn)的拜耳作物科學(xué)研究所研發(fā)的轉(zhuǎn)基因棉花品種Twinlink，含有2種蛋白毒素，分別是T304-40品系的蘇云金芽孢桿菌Cry1Ab和GHB119品系的Cry2Ae，該品種可有效防治鱗翅目的棉鈴蟲、煙青蟲、草地夜蛾等害蟲。目前，轉(zhuǎn)基因棉花品種Twinlink在澳大利亞、新西蘭、巴西和加拿大等國家都獲得了批準(zhǔn)并進(jìn)行商業(yè)化種植。此外，Bhupendra等［10］利用分子生物學(xué)技術(shù)從印度蘇云金芽孢桿菌中分離并克隆了Cry52Co1基因，毒力試驗結(jié)果表明其對棉鈴蟲幼蟲的LC50為36.66 μg·mL-1，可作為新型抗蟲蛋白基因用于轉(zhuǎn)基因作物。以上研究為轉(zhuǎn)基因抗蟲棉花產(chǎn)業(yè)的持續(xù)穩(wěn)步發(fā)展奠定了堅實的基礎(chǔ)。

1.2 防治棉盲蝽棉花

Cry51A是一類特殊的Bt伴孢晶體毒素，其晶體結(jié)構(gòu)與傳統(tǒng)的Cty毒素不同，屬于氣單胞溶菌素型β穿孔蛋白。鞘翅類和半翅類昆蟲具有特異性的毒蛋白，通過顯微鏡觀察和免疫熒光染色法2種組織學(xué)手段闡明了植物血凝素對牧草盲蝽蟓的致死效應(yīng)、靶組織和結(jié)合位點［11-12］。秦文強(qiáng)等［11］通過定點突變技術(shù)對已有原蛋白基因Cry51Aa1進(jìn)行定向改造，將獲得的突變體基因所表達(dá)的蛋白飼喂綠盲蝽并進(jìn)行體外毒力試驗，篩選出的新型突變蛋白基因Cry51Aa1.C006對綠盲蝽具有很強(qiáng)的毒殺效果。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法將Cry51Aa1和Cry51Aa1.C006基因轉(zhuǎn)入屬于陸地棉品種的中棉所24中，轉(zhuǎn)化體材料中Cry51Aa1.C006基因表達(dá)量在不同組織均高倍量表達(dá)?？瓜x鑒定表明，11個轉(zhuǎn)化體材料中有2個轉(zhuǎn)化體對綠盲蝽的抗性表現(xiàn)最強(qiáng)。

為了挖掘潛在的外源抗蟲基因，合成對刺吸式口器害蟲有抗性的棉花轉(zhuǎn)基因材料，李亞軍等［12］選擇Cry51Aa2.83416、Cry51Aa2.834CG、（E）-β Farnesene和Tma12這4個來源于蘇云金芽孢桿菌的外源抗蟲基因，通過構(gòu)建抗綠盲蝽、蚜蟲、煙粉虱4個基因的超表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將它們分別導(dǎo)入棉花基因組中，并獲得性狀優(yōu)良的轉(zhuǎn)基因株系。綠盲蝽、煙粉虱取食經(jīng)過改造的Cry51A轉(zhuǎn)基因植株后，出現(xiàn)了不同比例的死亡，以此達(dá)到控制盲蝽蟓、煙粉虱的目的。2016年，Gowda等［13］通過定點突變技術(shù)對基因進(jìn)行定向改造，獲得了對西部牧草盲蝽和美國牧草盲蝽均具有一定殺蟲活性的13種突變蛋白，其中Cry51Aa2.834-16蛋白的殺蟲效果與Cry51Aa2蛋白相比增加了200多倍。通過棉花遺傳轉(zhuǎn)化獲得了4個轉(zhuǎn)化體材料，田間試驗鑒定表明，GH-A767631轉(zhuǎn)化體對西部牧草盲蝽抗性增加了30多倍，其余轉(zhuǎn)化體抗性也顯著提升，有效地減少了西部牧草盲蝽和美國牧草盲蜷的危害。以上研究為現(xiàn)階段棉田減少農(nóng)藥使用，棉花次要害蟲的防治以及棉花抗蟲分子育種提供了一個新的途徑和基礎(chǔ)。

1.3 廣譜抗蟲棉花

Vip3是蘇云金芽孢桿菌的另一種營養(yǎng)期殺蟲蛋白（vegetative insecticidal proteins，VIPs），與Bt作用機(jī)制完全不同，Vip3是在蘇云金芽孢桿菌營養(yǎng)生長對數(shù)期分泌的殺蟲蛋白。Vip3蛋白具有廣譜的殺蟲效果，可毒殺小地老虎等對Bt蛋白非敏感害蟲，在防治抗性害蟲及擴(kuò)大抗蟲譜上可作為一種新的策略［14-19］。

Syngenta公司對轉(zhuǎn)Vip基因抗蟲棉進(jìn)行了多年的田間抗蟲試驗，結(jié)果表明該抗蟲棉能夠較好地控制棉鈴蟲種群［19］。哥斯達(dá)黎加（2009）、韓國（2016）等國已先后獲得轉(zhuǎn)Vip3的棉花品種，并在田間進(jìn)行了廣泛的種植。張安紅等［20］構(gòu)建了植物表達(dá)載體pBin438-Vip3A，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化棉花品種‘冀合713’，將新型抗蟲基因Vip3A轉(zhuǎn)入棉花植株，室內(nèi)抗蟲性鑒定表明，與對照相比轉(zhuǎn)基因植株對棉鈴蟲的抗性顯著提高，并獲得了2株高抗和3株抗棉鈴蟲的轉(zhuǎn)Vip3A基因株系。Southern blotting結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因株系BV01為單拷貝。ELISA檢測表明，外源Vip3A基因在BV01的根、莖、葉、花、種子中都有表達(dá)。該研究創(chuàng)制出的新型抗蟲轉(zhuǎn)基因棉花材料，為培育棉花新型抗蟲品種提供了種質(zhì)資源。

2 RNAi轉(zhuǎn)基因抗蟲棉花

植物介導(dǎo)的RNAi抗蟲新技術(shù)，可以有效、特異地干擾昆蟲靶基因的表達(dá)，從而抑制害蟲生長，該技術(shù)適用于包括咀嚼式和刺吸式在內(nèi)的多種昆蟲，為農(nóng)業(yè)害蟲的防治提供了特異性更強(qiáng)且環(huán)境安全的新思路。Luo等［21］經(jīng)過大量的室內(nèi)顯微注射實驗最終以影響中黑盲蝽卵巢發(fā)育的基因作為最佳靶標(biāo)，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化得到了高量表達(dá)靶標(biāo)基因dsRNA的轉(zhuǎn)基因棉花。連續(xù)2年的室外抗蟲鑒定表明，該轉(zhuǎn)基因棉花對中黑盲蝽表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗性，降低了棉花被危害程度，實現(xiàn)了對中黑盲蝽的有效防控。中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所朱禎研究組與南京農(nóng)業(yè)大學(xué)張?zhí)煺鎸嶒炇液献髋嘤丝杀磉_(dá)阻斷棉鈴蟲激素合成dsRNA的轉(zhuǎn)基因棉花，該轉(zhuǎn)基因棉表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗蟲性，尤其對于Bt耐受性棉鈴蟲系有很好的防治效果［22］。分子檢測結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因棉花成功表達(dá)了高量dsRNA，受試?yán)ハx體內(nèi)靶基因表達(dá)明顯下調(diào)，保幼激素本身合成被顯著抑制。同時聚合上述RNAi和Bt的轉(zhuǎn)基因棉花抗蟲效果進(jìn)一步增強(qiáng)。此外，分析多年抗蟲生測數(shù)據(jù)表明，RNAi抗蟲棉可明顯延緩棉鈴蟲抗性的產(chǎn)生。例如，昆蟲保幼激素RNAi抗蟲棉及RNAi+Bt的聚合棉能夠克服棉鈴蟲對單一策略轉(zhuǎn)基因棉易產(chǎn)生耐受性的難題，同時為下一代抗蟲作物的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。羅曉麗等［23］利用棉蚜腺苷三磷酸酶E亞基基因構(gòu)建RNA干擾載體，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化棉花，對獲得的22個轉(zhuǎn)基因陽性再生株的農(nóng)藝性狀和dsRNA表達(dá)量進(jìn)行分析，并結(jié)合網(wǎng)棚和大田抗蚜鑒定結(jié)果篩選出4個轉(zhuǎn)基因株系，其中CZ1、CZ2和CZ33個株系具有較高的抗蚜性，2015年和2016年蚜害減退率分別達(dá)70%和60%以上，為棉花抗蚜育種提供了新種質(zhì)和新方法。梁思佳［24］利用植物介導(dǎo)的RNAi技術(shù)，以影響中黑盲蝽生殖能力的AsFAR基因為靶標(biāo)，創(chuàng)制了能夠高量表達(dá)AsFAR基因dsRNA的轉(zhuǎn)基因棉花。研究結(jié)果表明，AsFAR轉(zhuǎn)基因棉花可以成功抑制中黑盲蝽的生殖能力，導(dǎo)致其種群數(shù)量顯著下降，有效減少中黑盲蝽在棉田的危害。岳臻［25］對調(diào)控取食的神經(jīng)肽NPF、NPY基因進(jìn)行了分子克隆和功能研究，并對轉(zhuǎn)干擾載體NPF2-pCAMBIA3301的棉花進(jìn)行Northern blot和Southern blot檢測，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株均能夠表達(dá)NPF基因，同時棉鈴蟲取食轉(zhuǎn)基因棉花后NPF表達(dá)量下降，取食量減少，生長減慢。王傳鵬［26］利用RNAi技術(shù)對細(xì)胞色素P450基因CYP6CY19進(jìn)行干擾，并觀察干擾后蚜蟲對棉花和黃瓜的適應(yīng)性差異，結(jié)果顯示棉花型棉蚜的RNAi干擾效率高于黃瓜型棉蚜，干擾CYP6CY19基因后，影響了棉蚜的產(chǎn)仔量和存活率，且對棉花型棉蚜的影響大于黃瓜型棉蚜，主要表現(xiàn)為產(chǎn)仔量減少和存活率降低，研究結(jié)果為探索棉蚜寄主專化型形成的分子機(jī)制提供了重要信息。

3 基因編輯創(chuàng)制抗蟲棉花研發(fā)動態(tài)

基因編輯是一種能對生物體基因組特定目標(biāo)基因進(jìn)行修飾的基因工程技術(shù)，給基因定向修飾提供了新的途徑。CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)具有周期短、效率高、成本低等優(yōu)勢，在生物育種上潛力巨大［27］。

Lin等［28］利用棉鈴蟲抗性和易感種群間的全基因組關(guān)聯(lián)分析、精細(xì)遺傳作圖和DNA序列比較等方法，發(fā)現(xiàn)在棉鈴蟲四跨膜蛋白基因HaTSPAN1中一個顯性突變可以使棉鈴蟲對Cry1Ac蛋白產(chǎn)生抗性。利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除HaTSPAN1基因可以恢復(fù)棉鈴蟲抗性個體的敏感性，而插入突變卻可以使易感個體產(chǎn)生125倍的抗性。金雙俠等［29］利用構(gòu)建sgRNA文庫的方法對500多個棉花內(nèi)源的抗蟲相關(guān)基因進(jìn)行飽和敲除，對獲得的突變體庫進(jìn)行抗蟲鑒定，發(fā)現(xiàn)有10%的突變體抗蟲性發(fā)生了變化，通過對sgRNA的靶標(biāo)位點信息進(jìn)行分析，獲得了這些突變的靶標(biāo)基因的信息，直接合成了靶標(biāo)信息明確且有抗蟲功能的突變體材料。Muhammad［30］為了研究棉花與煙粉虱之間的分子互作，選擇2個內(nèi)源棉花抗蟲基因GhMLP423和GhPR10，利用CRISPR/Cas9技術(shù)和超表達(dá)技術(shù)分別敲除和超表達(dá)這2個基因，研究結(jié)果表明，過表達(dá)GhMLP423和GhPR10的材料抗煙粉虱性能使基因編輯敲除的材料抗性降低，這2個基因在調(diào)控棉花抗煙粉虱調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中起著重要的作用。這些研究結(jié)果為棉花通過基因編輯進(jìn)行抗蟲育種研究開辟了一條新途徑。目前，由于CRISPR/Cas9技術(shù)在棉花這類多倍體作物中普遍存在的脫靶問題在棉花抗蟲研究中的應(yīng)用和成功范例不多，主要集中于棉花棉鈴蟲易感基因的挖掘。未來研究中，隨著對CRISPR/Cas9系統(tǒng)不斷優(yōu)化，相信CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)會在棉花優(yōu)良性狀改良和綜合性狀的提高方面帶來新的突破［31］。

4 轉(zhuǎn)次生代謝物基因與棉花抗蟲性的相關(guān)研究

植物次生代謝物能抵御外界不良的環(huán)境影響，植物防御病蟲害的主要次生代謝物有酚類、萜類、生物堿等，其中5-羥色胺是生物堿類色氨酸途徑中產(chǎn)生的次生代謝物。孫佩瑤［32］研究發(fā)現(xiàn)棉花體內(nèi)5-羥色胺的表達(dá)與其對綠盲蝽的抗性存在負(fù)相關(guān)，但與煙粉虱的抗性無關(guān)。胡琴［33］從棉花原生質(zhì)體細(xì)胞壁重建的抑制消減雜交文庫中克隆了1個能夠促進(jìn)細(xì)胞壁合成的基因GhLac1，并對其在介導(dǎo)棉花廣譜抗性中的作用機(jī)制進(jìn)行了研究，結(jié)果表明超量表達(dá)GhLac1能夠促進(jìn)木質(zhì)素合成并增強(qiáng)棉花的廣譜抗性，提高了轉(zhuǎn)基因棉花對黃萎病菌、棉鈴蟲和棉蚜的抗性。張肖麗［34］對不同棉酚含量棉花品種的抗蟲性進(jìn)行了鑒定，結(jié)果顯示棉酚可影響棉鈴蟲、甜菜夜蛾的生長發(fā)育，這與棉花防御酶、昆蟲解毒酶及乙酰膽堿酯酶相關(guān)，且棉酚含量越高，棉花抗蟲性越強(qiáng)。

5 展望

單價抗蟲棉只對以棉鈴蟲為主的鱗翅目和鞘翅目害蟲有抗殺作用，對棉蚜、紅蜘蛛、棉盲蝽、煙飛虱等害蟲沒有作用或效果甚微。長期種植轉(zhuǎn)基因抗蟲棉，雖有效防治了棉鈴蟲的發(fā)生，但由于農(nóng)藥施用量大大減少，一些次要害蟲，如盲蝽象、蚜蟲等危害日益突出，逐漸上升成為棉花主要害蟲；同時，抗蟲棉本身也存在生長發(fā)育后期抗蟲性下降、可能發(fā)生抗性棉鈴蟲等綜合問題，所以需要加大力度尋找新型有效的抗蟲基因資源。采用RNA干擾、基因編輯等新型生物技術(shù)手段研發(fā)轉(zhuǎn)新型雙基因、多基因的抗蟲棉，有利于提高轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的綜合抗蟲能力。

目前，發(fā)現(xiàn)并登記的cry1～cry67基因大約有190種，但獲得轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的Bt基因僅有幾種，如cry1A、cry1Ab、cry1Ac、cry1F、cry2Ab及cry2Ae等。挖掘新的Bt基因，培育和現(xiàn)有Bt棉花不同作用機(jī)制的新抗蟲棉花品種，或者研發(fā)針對同一害蟲進(jìn)行多種Bt毒素疊加的抗蟲棉，對棉鈴蟲等靶標(biāo)害蟲的抗性治理具有十分重要的意義。此外，為了延緩抗性害蟲的產(chǎn)生和延長轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的使用年限，可以將不同殺蟲機(jī)理的Bt基因同時導(dǎo)入棉株，利用不同基因的互補(bǔ)作用來增加抗蟲范圍和抗性水平。如Vip3與Cry蛋白具有不同的殺蟲機(jī)制且它們的殺蟲譜互補(bǔ)性很強(qiáng)，采取這2類基因疊加的策略來研發(fā)新型轉(zhuǎn)基因抗蟲棉花，有望得到更廣譜的抗蟲品種。