馮夢(mèng)珂，王星博，林璐璐，崔明仙，顏焰，周繼勇*

（1.浙江大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)中心，浙江 杭州 310058；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310058）

非洲豬瘟（African swine fever, ASF）是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus, ASFV）引起的一種豬急性、出血性、烈性傳染病，死亡率極高[1]。自20 世紀(jì)20 年代首次在肯尼亞被發(fā)現(xiàn)以來，ASF先后在非洲和亞歐大陸迅速傳播，2018 年8 月我國(guó)遼寧省沈陽(yáng)市報(bào)道首例ASF疫情，隨后ASF在全國(guó)范圍內(nèi)大規(guī)模暴發(fā)流行[2]。由于缺乏有效的治療手段和安全的疫苗，ASF對(duì)動(dòng)物健康、食品安全、國(guó)民經(jīng)濟(jì)乃至生態(tài)環(huán)境都構(gòu)成了持續(xù)的威脅[3]。

ASFV 基因組由一個(gè)170～190 kb 的雙鏈DNA分子組成，病毒粒子呈現(xiàn)對(duì)稱的二十面體結(jié)構(gòu)，成熟病毒粒子包含多達(dá)68 種結(jié)構(gòu)蛋白和100 多種非結(jié)構(gòu)蛋白，其中結(jié)構(gòu)蛋白對(duì)病毒感染研究及疫苗、診斷試劑研制的意義重大[4]。病毒粒子自外而內(nèi)包括外囊膜、衣殼、內(nèi)膜、核衣殼和基因組5 個(gè)部分[5]，外囊膜由EP402R基因編碼的CD2v 蛋白組成。CD2v是一種與T淋巴細(xì)胞表面黏附受體CD2相似的蛋白，由信號(hào)肽（1～16 個(gè)氨基酸）、胞外區(qū)（17～207個(gè)氨基酸）、跨膜區(qū)（208～228個(gè)氨基酸）和胞內(nèi)區(qū)（229～375 個(gè)氨基酸）4 部分組成[6]，CD2v 參與ASFV 宿主免疫應(yīng)答、免疫逃逸和病毒復(fù)制等生理生化過程，是病毒診斷和疫苗研發(fā)的重要靶點(diǎn)蛋白[7]。用桿狀病毒表達(dá)的CD2v 蛋白免疫可保護(hù)豬免于致死性感染[8]，而且用CD2v蛋白免疫還可誘導(dǎo)豬產(chǎn)生特異性T細(xì)胞免疫反應(yīng)[9]。

真核細(xì)胞和原核細(xì)胞均可用于外源基因的表達(dá)。真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的重組蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上更接近天然蛋白[10]。已有研究利用昆蟲桿狀病毒及CHO等真核表達(dá)系統(tǒng)對(duì)CD2v蛋白進(jìn)行表達(dá)[11-13]，其純化蛋白能與臨床ASFV抗體陽(yáng)性血清反應(yīng)。大腸埃希菌原核表達(dá)系統(tǒng)具有操作簡(jiǎn)單方便、表達(dá)周期短且成本低、蛋白表達(dá)水平高等優(yōu)點(diǎn)，缺點(diǎn)在于所表達(dá)蛋白大多為包涵體，無法形成正確的三維結(jié)構(gòu)，往往無生物學(xué)活性[14-16]。多個(gè)研究小組嘗試?yán)迷吮磉_(dá)系統(tǒng)來表達(dá)CD2v蛋白，但表達(dá)蛋白主要以包涵體形式存在[17-20]，對(duì)包涵體進(jìn)行溶解及鎳柱親和層析后，CD2v純化蛋白與ASFV抗體陽(yáng)性血清的免疫反應(yīng)性較差[19]；而純化的CD2v 可溶性蛋白能夠被ASFV 抗體陽(yáng)性血清識(shí)別，具有良好的反應(yīng)原性[18]；蛋白質(zhì)印跡法分析結(jié)果表明，表達(dá)的可溶性CD2v胞外區(qū)蛋白與ASFV抗體陽(yáng)性血清具有良好的免疫反應(yīng)性[17]。

綜上所述，原核表達(dá)系統(tǒng)主要以包涵體形式表達(dá)CD2v 蛋白，包涵體蛋白的免疫反應(yīng)性較差且純化、復(fù)性難度較大，不利于蛋白的功能研究及應(yīng)用。因此，把CD2v 蛋白與適宜的標(biāo)簽蛋白進(jìn)行融合表達(dá)，篩選促進(jìn)蛋白可溶性表達(dá)的載體，對(duì)CD2v蛋白的可溶性表達(dá)具有重要意義[21]。本研究基于5種不同的原核表達(dá)載體，篩選能促進(jìn)CD2v 蛋白可溶性表達(dá)的最佳表達(dá)載體，通過臨床ASFV 抗體陽(yáng)性血清檢測(cè)并比較可溶性CD2v 蛋白和包涵體CD2v 蛋白的免疫反應(yīng)性，為原核表達(dá)可溶性CD2v 蛋白及探究其免疫原性奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

高保真酶（貨號(hào)P510-01）購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；異丙基硫代-β-D-半乳糖苷[isopropylthio-β-D-galactoside（IPTG），貨 號(hào)15529019]、DNA 標(biāo)志物（貨號(hào)01112376）購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction, PCR）產(chǎn)物清潔回收試劑盒（貨號(hào)2101050）、DNA 凝膠回收試劑盒（貨號(hào)2003050）購(gòu)自杭州新景生物試劑開發(fā)有限公司；DH5α和BL21（DE3）大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室制備；原核表達(dá)載體pET-28a、pET32a、pGEX-4T-1、pMAL-C6T 和pCold-TF 由本實(shí)驗(yàn)室保存；二辛可酸（bicinchoninic acid, BCA）蛋白濃度測(cè)定試劑盒（貨號(hào)C503021-0500）購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；鎳-氨三乙酸（nickelnitrilotriacetic acid, Ni-NTA）瓊脂糖（貨號(hào)30210）購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司；辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP）標(biāo)記的羊抗鼠IgG（貨號(hào)074-1806）、HRP標(biāo)記的羊抗豬IgG（貨號(hào)14-14-06）購(gòu)自美國(guó)KPL公司；質(zhì)粒小提試劑盒（貨號(hào)DP103-02）購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；其他生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。臨床ASFV 抗體陽(yáng)性血清（病毒被滅活）和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

根據(jù)GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的非洲豬瘟病毒HLJ-2018 株（登錄號(hào)MK333180.1）的序列信息，由杭州尚亞科技有限公司合成去除信號(hào)肽和跨膜區(qū)的非洲豬瘟病毒CD2v 蛋白（CD2vΔSP-TM）序列。將序列插入原核表達(dá)載體pET-28a，構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a-CD2vΔSP-TM。根據(jù)不同的原核表達(dá)載體設(shè)計(jì)引物，以pET28a-CD2vΔSP-TM 原核表達(dá)質(zhì)粒為模板，通過PCR擴(kuò)增CD2v序列后，將目的片段分別插入pCold-TF、pMAL-C6T、pGEX-4T-1 和pET-32a 原核表達(dá)載體，得到原核表達(dá)質(zhì)粒pCold-TF-CD2vΔSP-TM、pMAL-C6T-CD2vΔSP-TM、pGEX-4T-1-CD2vΔSP-TM 和pET32a-CD2vΔSPTM。將上述原核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DH5α大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞中，涂板并挑選單克隆菌落，將PCR鑒定為陽(yáng)性的菌液送至杭州尚亞科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，對(duì)測(cè)序正確的陽(yáng)性菌液進(jìn)行質(zhì)粒抽提，用于后續(xù)原核表達(dá)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 CD2v 蛋白的原核表達(dá)與鑒定

將鑒定正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞中，涂板培養(yǎng)后，挑取單克隆菌落接種至LB 培養(yǎng)基中，于37 ℃活化，將活化后的菌液按照體積比1∶100 轉(zhuǎn)接至含抗生素（100 μg/mL）的LB 液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、200 r/min 條件下培養(yǎng)約4 h，待菌液在600 nm 處的吸光度值達(dá)0.6 時(shí)，向菌液中加入終濃度為1.0 mmol/L 的IPTG，于16 ℃、120 r/min 條件下培養(yǎng)16 h，誘導(dǎo)結(jié)束后離心收集菌液，在冰浴條件下超聲破碎，離心后分別吸取上清液并保留沉淀，制備樣品，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE）后，用考馬斯亮藍(lán)R250進(jìn)行染色，以檢測(cè)重組蛋白的表達(dá)情況及存在形式。各載體標(biāo)簽及CD2v重組蛋白分子量如表1所示。

表1 不同原核表達(dá)載體標(biāo)簽及重組蛋白分子量Table 1 Different prokaryotic expression vector tags andmolecular weights of recombinant proteins

1.2.3 CD2v 蛋白的純化與鑒定

離心收集經(jīng)低溫誘導(dǎo)后的pCold-TFCD2vΔSP-TM菌體沉淀，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution, PBS）重懸后，在冰浴條件下超聲破碎，離心收集上清液。將上清液與Ni-NTA瓊脂糖混合，以4 ℃低溫翻轉(zhuǎn)孵育4 h，隨后用20 mmol/L咪唑去除雜蛋白，用50 mmol/L 咪唑洗脫CD2v-TF 重組蛋白。同樣，離心收集經(jīng)低溫誘導(dǎo)后的pET28a-CD2vΔSP-TM菌體沉淀，用尿素溶液（8 mol/L尿素，20 mmol/L NaH2PO4·2H2O，300 mmol/L NaCl，pH 8.0）重懸后，在冰浴條件下超聲破碎，離心收集上清液。將上清液與Ni-NTA 瓊脂糖混合，以4 ℃低溫翻轉(zhuǎn)孵育4 h，隨后用緩沖液A（8 mol/L 尿素，20 mmol/L NaH2PO4·2H2O，300 mmol/L NaCl，10 mmol/L咪唑，pH 8.0）、緩沖液B（8 mol/L尿素，20 mmol/L NaH2PO4·2H2O，300 mmol/L NaCl，10 mmol/L 咪唑，pH 6.3）、緩沖液C（8 mol/L 尿素，20 mmol/L NaH2PO4·2H2O，300 mmol/L NaCl，pH 5.9）依次去除雜蛋白，用緩沖液D（8 mol/L 尿素，20 mmol/L NaH2PO4·2H2O，300 mmol/L NaCl，pH 4.5）洗脫CD2v-His重組蛋白。收集每次被洗脫的樣品，用BCA法測(cè)定CD2v-TF和CD2v-His重組蛋白濃度，并將這2種重組蛋白保存于－40 ℃冰箱中。

純化蛋白通過考馬斯亮藍(lán)R250 染色和蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）進(jìn)行鑒定。在蛋白質(zhì)印跡法中，將經(jīng)過SDS-PAGE后的純化蛋白分別轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉封閉1 h（37 ℃），加入按體積比1∶1 000稀釋的多聚組氨酸標(biāo)簽（His-Tag）的鼠源單抗作為一抗，37 ℃孵育1 h后，用含吐溫-20 的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution with Tween-20, PBST）洗滌3次，每次5 min，然后加入按體積比1∶5 000 稀釋的HRP 標(biāo)記的羊抗鼠二抗，37 ℃孵育1 h，用PBST洗滌后，利用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光（enhanced chemiluminescence, ECL）試劑進(jìn)行顯色。

1.2.4 2 種CD2v 重組蛋白的免疫反應(yīng)性比較

采用間接酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）方法比較2種CD2v重組蛋白的免疫反應(yīng)性。將純化后的2 種CD2v 重組蛋白用0.05 mmol/L PBS（pH 9.6）稀釋至2 μg/mL，然后以100 μL/孔包被96 孔酶標(biāo)板，每塊96 孔酶標(biāo)板于4 ℃過夜包被12 h，棄包被液，用200 μL/孔PBST 清洗3 次后，每孔加入200 μL 5%脫脂奶粉，37 ℃封閉1 h，然后用200 μL/孔PBST 重復(fù)清洗3次。臨床ASFV 抗體陽(yáng)性血清（n=5）和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清（n=5）分別用5% 脫脂奶粉按體積比1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800、1∶25 600 稀釋后，每孔加入100 μL 稀釋后的溶液，37 ℃孵育1 h，每個(gè)稀釋度設(shè)3個(gè)重復(fù)。用PBST洗滌3 次后，按100 μL/孔加入經(jīng)1∶2 000 稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗豬IgG，37 ℃孵育45 min，再用PBST 洗滌3 次后，每孔加入100 μL 3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺（3, 3′, 5, 5′-tetramethylbenzidine, TMB）顯色液，37 ℃避光顯色10 min 后，每孔立即加入50 μL 2 mol/L H2SO4，終止顯色。用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔在450 nm 波長(zhǎng)處的吸光度值，采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)分析相同稀釋度下2種蛋白的免疫反應(yīng)性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定結(jié)果

以合成CD2v基因的質(zhì)粒為模板，通過PCR 擴(kuò)增得到去除信號(hào)肽和跨膜區(qū)的CD2v 序列片段，將其分別構(gòu)建到pET-28a、pET32a、pGEX-4T-1、pMAL-C6T、pCold-TF 5 個(gè)原核表達(dá)載體中，獲得原核表達(dá)質(zhì)粒，然后將這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到DH5α大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)過對(duì)應(yīng)抗性的LB 平板篩選，挑取單克隆菌落接種于對(duì)應(yīng)抗性的LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。以特異性引物（上游引物CD2v-F，5′-ATTGATTATTGGGTTAGTTTTAATAAAA-3′；下游引物CD2v-R，5′-TTAAATAATTCTATCTACA TGAATAAGCGA-3′）對(duì)菌液進(jìn)行PCR 鑒定。結(jié)果（圖1）表明，在969 bp長(zhǎng)度附近出現(xiàn)目的條帶。通過核酸測(cè)序確定CD2v基因序列、插入位置及開放閱讀框都正確后，抽提質(zhì)粒進(jìn)行后續(xù)原核表達(dá)實(shí)驗(yàn)。

圖1 重組質(zhì)粒的PCR鑒定結(jié)果Fig.1 PCR identification results of recombinant plasmids

2.2 CD2v 蛋白的原核表達(dá)與鑒定結(jié)果

將鑒定正確的原核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)后，通過SDS-PAGE 和考馬斯亮藍(lán)R250 染色確定不同重組蛋白的表達(dá)形式。結(jié)果（圖2）表明：pET28a-CD2vΔSP-TM 重組質(zhì)粒（圖2A）和pGEX-4T-1-CD2vΔSP-TM重組質(zhì)粒（圖2C）主要表達(dá)包涵體蛋白；pET32a-CD2vΔSP-TM重組質(zhì)粒（圖2B）未表達(dá)CD2v重組蛋白；pMAL-C6T-CD2vΔSP-TM重組質(zhì)粒（圖2D）同時(shí)表達(dá)包涵體和可溶性蛋白，其中以包涵體蛋白居多；pCold-TF-CD2vΔSP-TM 重組質(zhì)粒（圖2E）以表達(dá)可溶性蛋白為主。

圖2 5種不同原核表達(dá)載體對(duì)CD2v重組蛋白表達(dá)的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of CD2v recombinant protein expression by five different prokaryotic expression vectors

2.3 CD2v 蛋白的純化與鑒定結(jié)果

將低溫誘導(dǎo)表達(dá)的CD2v-TF、CD2v-His重組蛋白通過超聲破碎、鎳柱親和層析及洗脫等過程進(jìn)行純化，并用SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡法驗(yàn)證其純化情況。結(jié)果表明，在預(yù)期的85 kDa附近有CD2v-TF重組蛋白陽(yáng)性條帶（圖3），在預(yù)期的42 kDa 附近有CD2v-His重組蛋白陽(yáng)性條帶（圖4）。

圖3 CD2v-TF重組蛋白純化結(jié)果Fig.3 Purification results of CD2v-TF recombinant protein

圖4 CD2v-His重組蛋白純化結(jié)果Fig.4 Purification results of CD2v-His recombinant protein

2.4 2 種CD2v 重組蛋白的免疫反應(yīng)性比較分析

利用間接ELISA 方法檢測(cè)（圖5）顯示，隨著抗體濃度降低，抗原抗體免疫反應(yīng)性呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)分析在相同稀釋度下2 種蛋白的免疫反應(yīng)性差異，以在450 nm波長(zhǎng)處的吸光度值表示。結(jié)果（圖5）表明，在體積比1∶200和1∶400稀釋度下，ASFV 抗體陽(yáng)性血清與CD2v-TF 重組蛋白的免疫反應(yīng)性顯著高于與CD2v-His重組蛋白的免疫反應(yīng)性（P＜0.05）。

圖5 利用間接ELISA方法檢測(cè)2種CD2v重組蛋白的免疫反應(yīng)性Fig.5 Immunoreactivity of two CD2v recombinant proteins detected by indirect ELISA

3 討論

ASF 對(duì)生豬養(yǎng)殖行業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，由于尚無有效的疫苗和藥物進(jìn)行預(yù)防或治療，目前只能依靠嚴(yán)格的生物安全措施進(jìn)行防控[22]。CD2v是第一個(gè)被證實(shí)對(duì)ASFV致死性攻擊具有保護(hù)作用的ASFV 蛋白，已成為DNA 疫苗、病毒載體疫苗等研究的重要靶點(diǎn)，在ASFV 疫苗研發(fā)中具有重大潛力[23-25]。

大腸埃希菌原核表達(dá)系統(tǒng)具有操作簡(jiǎn)單方便、表達(dá)量高、周期短、成本低等優(yōu)點(diǎn)，但其表達(dá)的CD2v蛋白多以包涵體的形式存在，經(jīng)尿素溶解后，蛋白空間結(jié)構(gòu)被破壞而呈變性狀態(tài)，空間表位丟失，導(dǎo)致免疫原性較差[11,26-27]，影響了其在低成本疫苗研制中的應(yīng)用。本研究系統(tǒng)比較了5種原核表達(dá)載體不同重組標(biāo)簽對(duì)CD2v 蛋白可溶性表達(dá)的影響。結(jié)果表明：作為被廣泛應(yīng)用的pET表達(dá)系統(tǒng)中的2 個(gè)代表性載體，pET28a 和pET32a 均未能促進(jìn)CD2v的可溶性表達(dá)；pGEX-4T-1載體雖然具有促進(jìn)蛋白可溶性表達(dá)的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（glutathioneS-transferase, GST）標(biāo)簽[28]，但其仍表達(dá)以包涵體形式為主的CD2v 重組蛋白；pMAL-C6T 載體具有麥芽糖結(jié)合蛋白（maltose binding protein, MBP）標(biāo)簽，該標(biāo)簽不僅能提高重組蛋白表達(dá)量，而且能減少蛋白降解并促進(jìn)其可溶性表達(dá)[29]，在本研究中該標(biāo)簽雖然可提高CD2v 蛋白的可溶性表達(dá)，但在非變性親和純化過程中雜蛋白較多，影響了CD2v 蛋白的純度；而pCold-TF 載體表達(dá)的CD2v 重組蛋白均以可溶性的方式存在，且可純化獲得純度較高的可溶性重組蛋白。pCold-TF是一種冷休克載體，帶有觸發(fā)因子（trigger factor, TF）標(biāo)簽，而TF是原核細(xì)胞中與核糖體相關(guān)的分子伴侶蛋白，可促進(jìn)多肽進(jìn)行共翻譯折疊表達(dá)，并通過提高蛋白的正確折疊來促進(jìn)可溶性表達(dá)[30]。

4 結(jié)論

本研究構(gòu)建了5 種原核表達(dá)重組質(zhì)粒，比較了CD2v蛋白的可溶性表達(dá)情況，并利用臨床ASFV抗體陽(yáng)性血清比較了在可溶性和包涵體形式下CD2v蛋白的免疫反應(yīng)性。結(jié)果表明，TF標(biāo)簽可有效促進(jìn)CD2v蛋白的可溶性表達(dá)，且可溶性CD2v蛋白的免疫反應(yīng)性顯著高于包涵體蛋白，表明蛋白的可溶性表達(dá)可能在空間表位層面影響蛋白的免疫反應(yīng)性。因此，選擇合適的表達(dá)載體是CD2v 蛋白在原核表達(dá)系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)正確折疊和可溶性表達(dá)的一種有效策略。本研究為ASFV CD2v 蛋白的可溶性表達(dá)提供了參考載體，為CD2v 蛋白功能與免疫原性研究及亞單位疫苗研制奠定了基礎(chǔ)。