張麗芳 馬瑞欣 鄭百芹 宋 旺 周 鑫

(1. 唐山市食品藥品綜合檢驗(yàn)檢測(cè)中心,河北 唐山 063000;2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)評(píng)價(jià)與營養(yǎng)健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北 唐山 063000;3. 河北省水產(chǎn)技術(shù)推廣總站,河北 石家莊 050000)

抗寄生蟲藥物屬于獸藥,種類眾多,且作用機(jī)制各不相同,往往根據(jù)感染寄生蟲的類別或動(dòng)物種類用藥[1-3],但不科學(xué)不規(guī)范的藥物施用方式會(huì)帶來一些負(fù)面作用,如土壤、水文等環(huán)境中藥物殘留的積累和遷移[4-5],寄生蟲、微生物等生物體產(chǎn)生耐藥性[6-7],藥物殘留隨食物鏈由食用性動(dòng)物產(chǎn)品轉(zhuǎn)移到人體[8]等。為此,一些國際組織和國家紛紛制定了食品中獸藥殘留限量,并不斷更新和增補(bǔ)相關(guān)內(nèi)容。中國制定的GB 31650—2019《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了267種(類)獸藥在畜禽產(chǎn)品、水產(chǎn)品、蜂產(chǎn)品中的2 191項(xiàng)殘留限量及使用要求,依據(jù)藥物的安全性及其對(duì)食品安全的影響程度將獸藥(包括部分化學(xué)物質(zhì))進(jìn)行了分類,但仍有一些常見的抗寄生蟲藥物種類不在標(biāo)準(zhǔn)名錄之中,需要進(jìn)一步完善和修訂。

目前在抗寄生蟲藥物殘留研究中,較多集中在畜禽等陸地動(dòng)物源性食品中,且藥物種類比較單一,而水產(chǎn)品中抗寄生蟲藥物殘留研究的報(bào)道相對(duì)較少。研究人員對(duì)水產(chǎn)品和環(huán)境中的獸藥[9-11]、農(nóng)藥(包括抗菌劑)[12]等藥物做過相應(yīng)的監(jiān)測(cè)和評(píng)估,而以不同類型的抗寄生蟲藥物作為藥物殘留研究對(duì)象的報(bào)道并不多見,但是抗寄生蟲藥物作為畜禽養(yǎng)殖常用藥物通過環(huán)境遷移到水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)中并在水產(chǎn)動(dòng)物中富集應(yīng)予以重視。

由于凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖場(chǎng)很多為非工廠化封閉養(yǎng)殖,養(yǎng)殖過程中可能通過排污、降水等形式受到附近周圍畜牧養(yǎng)殖場(chǎng)用藥污染和其他形式的藥物遷移,出于風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)控和排查的考慮需對(duì)凡納濱對(duì)蝦進(jìn)行抗寄生蟲藥物殘留的測(cè)定。研究擬選取27種抗寄生蟲藥物作為凡納濱對(duì)蝦的藥物監(jiān)測(cè)對(duì)象,使用QuEChERS對(duì)樣品進(jìn)行提取和凈化,超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜定性定量分析,建立實(shí)驗(yàn)室對(duì)凡納濱對(duì)蝦中抗寄生蟲藥物殘留測(cè)定方法,并對(duì)市場(chǎng)上銷售的凡納濱對(duì)蝦進(jìn)行測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)試劑與耗材

甲醇、乙腈、甲酸:色譜純,美國Thermo Fisher公司;

甲酸銨:色譜純,美國Sigma-Aldrich公司;

氯化鈉:分析純,福晨(天津)化學(xué)試劑有限公司;

C18粉、乙二胺-N-丙基硅烷(primary secondary amine,PSA)粉、中性氧化鋁粉(Al2O3):北京迪馬科技有限公司;

0.22 μm濾膜:北京迪馬科技有限公司;

抗寄生蟲藥物液態(tài)標(biāo)準(zhǔn)品溶液(化合物名稱見表1):天津阿爾塔科技有限公司;

表1 化合物離子對(duì)信息及其對(duì)應(yīng)質(zhì)譜參數(shù)?

試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀:Triple Quad 5500+型 (配ESI離子源),美國AB SCIEX公司;

離心機(jī):SORVALL LYNX 4000型,美國Thermo Fisher公司;

電子天平:BT 25 S型,德國Sartorius公司;

氮吹儀:EFAA-DC24-RT型,安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司;

多位渦旋儀:KN-026S型,北京科德諾思技術(shù)有限公司。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

吸取適量體積的27種抗寄生蟲藥物標(biāo)準(zhǔn)品溶液于容量瓶中,甲醇稀釋并定容,得到混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,-20 ℃保存。

1.4 樣品前處理

稱取勻漿處理的蝦肉樣品2 g(精確至0.01 g),先后加入1 g氯化鈉和10 mL 80%乙腈水溶液,充分渦旋混合,超聲波提取10 min,于4 ℃下6 000 r/min離心5 min,準(zhǔn)確吸取上層有機(jī)清液2 mL,加入C18和中性Al2O3粉末各100 mg,渦旋1 min充分吸附,取上清液過0.22 μm濾膜,待上機(jī)測(cè)定。

1.5 基質(zhì)效應(yīng)

配制溶劑稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線系列梯度和空白基質(zhì)提取液稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線系列梯度,分別進(jìn)樣上機(jī)測(cè)定并進(jìn)行線性回歸分析,得到溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線和基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線,按式(1)計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)(matrix effect,ME)。

(1)

式中:

ME——基質(zhì)效應(yīng)數(shù)值;

km——基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率;

k——溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率。

1.6 儀器分析條件

1.6.1 液相色譜條件 色譜柱:Thermo Hypersil Gold aQ (100×2.1 mm, 1.9 μm);柱溫:40 ℃;進(jìn)樣量:2 μL;流速:0.4 mL/min。流動(dòng)相:A,10 mmol/L甲酸銨(含0.1%甲酸)溶液;B,0.1%甲酸—乙腈。采用梯度洗脫:0.0～1.0 min,95% A,1.0～5.0 min,95%～5% A,5.0～8.0 min,5% A,8.0～8.1 min,5%～95% A,8.1～11.0 min,95% A。

1.6.2 質(zhì)譜條件 離子源:電噴霧離子源(ESI);掃描模式:正負(fù)離子同步掃描模式;監(jiān)測(cè)方式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM);噴霧電壓(IS):正掃描5 000 V,負(fù)掃描-4 000 V;離子源溫度550 ℃;氣簾氣(CUR):172 368.9 Pa;霧化氣(GS1):344 737.9 Pa;輔助氣(GS2):344 737.9 Pa;碰撞氣:7模擬單位?；衔镫x子對(duì)信息和相應(yīng)其他質(zhì)譜信息見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

圖1 不同母離子選擇下多拉菌素的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)響應(yīng)強(qiáng)度比較

2.2 液相條件優(yōu)化

2.2.1 色譜柱的選擇 選取Waters BEH C18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)、Thermo Hypersil Gold aQ(100 mm×2.1 mm,1.9 μm)和phenomenex Kinetex F5(100 mm×2.1 mm,2.6 μm)3種長度相同的色譜柱,在相同的條件下對(duì)目標(biāo)化合物的分離情況進(jìn)行考察。由圖2可知,Thermo Hypersil Gold aQ在物質(zhì)分離程度和峰高的表現(xiàn)優(yōu)于其他兩種,與劉開等[15]在色譜柱上的選擇不同,可能是由于化合物種類和數(shù)量以及所用的洗脫流動(dòng)相不同所導(dǎo)致。研究選取Thermo Hypersil Gold aQ色譜柱作為分離用色譜柱,并進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖2 化合物在不同色譜柱上的分離情況

2.2.2 流動(dòng)相的選擇 選取甲醇、乙腈、0.1%甲酸—乙腈作為有機(jī)相分別與作為水相流動(dòng)相的水、0.1%甲酸水溶液、2 mmol/L甲酸銨溶液、2 mmol/L 甲酸銨溶液(含0.1%甲酸)、10 mmol/L甲酸銨溶液、10 mmol/L甲酸銨溶液(含0.1%甲酸)進(jìn)行組合比較。作為有機(jī)相的甲醇和乙腈,乙腈更能夠?qū)O性較弱的化合物從色譜柱中洗脫下來,而酸化流動(dòng)相溶液可以促進(jìn)咪唑類等藥物的離子化程度[16],與此同時(shí),流動(dòng)相中加入甲酸并未抑制負(fù)掃描化合物的離子化,響應(yīng)信號(hào)未見明顯的降低。待測(cè)化合物中包含有阿維菌素類藥物,在母離子選擇上選取[M+NH4]+的母離子形式,流動(dòng)相中加入銨鹽可以增強(qiáng)該類物質(zhì)的離子化水平,并且可以改善色譜峰型。流動(dòng)相中適宜的酸度和離子強(qiáng)度對(duì)于提高檢測(cè)靈敏度能起到積極作用[14],研究結(jié)合多種化合物性質(zhì)和實(shí)際洗脫效果,最終選擇0.1%甲酸—乙腈和10 mmol/L 甲酸銨溶液(含0.1%甲酸)分別作為有機(jī)相和水相,采用梯度洗脫的形式對(duì)化合物進(jìn)行分離。

2.3 前處理?xiàng)l件優(yōu)化

2.3.1 提取試劑優(yōu)化 選取甲醇、乙腈、80%乙腈水溶液、0.2%甲酸—乙腈對(duì)蝦肉中的抗寄生蟲藥物進(jìn)行提取。通過試驗(yàn)回收率對(duì)4種提取試劑進(jìn)行考察,結(jié)果見圖3。由圖3可知,以甲醇作為抗寄生蟲藥物殘留的提取試劑時(shí),雖然其中位值回收率最接近100%,但是各種藥物的提取效果呈現(xiàn)出分散的態(tài)勢(shì),而且回收率大于120%或低于60%的藥物較多;以0.2%甲酸—乙腈作為提取試劑,藥物的回收率均低于100%,整體回收率過低,并且有9種藥物的回收率低于60%;以80%乙腈水溶液作為提取試劑時(shí),各藥物回收率比較集中,主要分布在80%～100%。因此,選取80%乙腈水溶液作為提取試劑。

圖3 提取試劑對(duì)回收率的影響

2.3.2 凈化條件優(yōu)化 C18、GCB(graphitic carbon)、PSA、Al2O3粉等是最常用的吸附劑[4]。PSA可以利用活性基上的氨基去除基質(zhì)樣品中的糖、脂肪酸、有機(jī)酸、脂類、極性色素和金屬離子,C18對(duì)樣品中的脂肪和非極性成分具有良好的吸附作用;氧化鋁可以吸附脂肪酸等物質(zhì)。試驗(yàn)比較了C18、PSA和Al2O3粉對(duì)提取液的凈化效果。通過比較不同的吸附劑、吸附劑用量以及吸附劑的配伍應(yīng)用,可以得出C18100 mg+Al2O3100 mg聯(lián)合應(yīng)用吸附雜質(zhì)的效果最佳,結(jié)果見圖4。

圖4 吸附劑對(duì)藥物提取回收率的影響

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

在應(yīng)用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜特別是配有電噴霧離子源(ESI)對(duì)待測(cè)物進(jìn)行分析時(shí),進(jìn)樣液中的雜質(zhì)可能對(duì)分析物產(chǎn)生干擾,產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng),嚴(yán)重影響方法的精密度、準(zhǔn)確度,所以要對(duì)基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行分析和評(píng)估[17]?；|(zhì)效應(yīng)消除或補(bǔ)償?shù)霓k法很多,常用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液校準(zhǔn)方法[18]。研究涉及27種抗寄生蟲藥物在凡納濱對(duì)蝦基質(zhì)中的定性定量分析測(cè)定,藥物種類較多,且基質(zhì)中的蛋白、脂肪等雜質(zhì)容易產(chǎn)生基質(zhì)抑制或增強(qiáng)效應(yīng)[19]。由圖5可知,馬度米星胺和環(huán)丙氨嗪顯示出基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng),數(shù)值達(dá)到148.4%和128.8%,而其余25種化合物顯示出基質(zhì)抑制效應(yīng),除硝碘酚腈外均小于80%?；|(zhì)、前處理方法、化合物濃度都是影響基質(zhì)效應(yīng)的因素,為了抵消或補(bǔ)償基質(zhì)效應(yīng)帶來的影響,采取空白基質(zhì)標(biāo)液對(duì)線性關(guān)系、回收率、精密度等進(jìn)行考察和實(shí)際樣品測(cè)定。

2.5 線性范圍、檢出限和定量限

用空白樣品提取液對(duì)27種抗寄生蟲藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行稀釋,配制成0.5,1.0,2.0,5.0,10,50,100,200 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)曲線系列并上機(jī)分析。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),化合物定量離子峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸擬合,得到回歸方程和相應(yīng)的皮爾森相關(guān)系數(shù)r[20]。方法檢出限(limit of detection,LOD)和定量限(limit of quantitation,LOQ)分別以3倍和10倍信噪比結(jié)合前處理過程中的稀釋倍數(shù)以及稱樣質(zhì)量進(jìn)行計(jì)算,結(jié)果見表2。

表2 抗寄生蟲藥物的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)以及檢出限和定量限

2.6 回收率和重復(fù)性

稱取凡納濱對(duì)蝦空白樣品2 g(精確至0.01 g)并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.3)空白基質(zhì)添加(如表3所示),制備成低、中、高(5,10,50 μg/kg)3個(gè)水平的凡納濱對(duì)蝦陽性添加樣品,每個(gè)添加水平進(jìn)行6次平行試驗(yàn)。陽性添加樣品在處理前靜置0.5 h,然后按照1.4進(jìn)行提取、凈化,上機(jī)分析后計(jì)算方法加標(biāo)回收率和批內(nèi)變異系數(shù);重復(fù)3 d,以計(jì)算和分析批間變異系數(shù),見表3。結(jié)果表明,方法回收率為61.90%～118.54%,批內(nèi)變異系數(shù)為0.57%～12.56%,批間變異系數(shù)為1.29%～16.47%。

表3 凡納濱對(duì)蝦在不同添加水平下的回收率和變異系數(shù)

2.7 實(shí)際樣品測(cè)定

應(yīng)用該方法對(duì)市場(chǎng)中購買的凡納濱對(duì)蝦樣品進(jìn)行抗寄生蟲藥物殘留檢測(cè)。共測(cè)定凡納濱對(duì)蝦樣品56批,其中1批樣品有阿苯達(dá)唑檢出,1批樣品有地克珠利檢出,但均未達(dá)到該方法的定量限。阿苯達(dá)唑和地克珠利的檢出,說明已經(jīng)有抗寄生蟲藥物滲透、污染到了南美白對(duì)蝦等水產(chǎn)品養(yǎng)殖環(huán)境中并在水產(chǎn)品中存在藥物存留的情況,數(shù)值雖然未達(dá)到該方法的定量限值,但也不應(yīng)該忽視這一現(xiàn)實(shí)問題。這可能不是常規(guī)藥物施用而導(dǎo)致的藥物在飼養(yǎng)動(dòng)物體內(nèi)的藥物殘留問題,可能涉及到了畜產(chǎn)水產(chǎn)養(yǎng)殖、藥物遷移、養(yǎng)殖排棄物處置等系列問題,應(yīng)予以關(guān)注。

3 結(jié)論

研究建立了液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定凡納濱對(duì)蝦中27種抗寄生蟲藥物的方法,藥物經(jīng)提取、凈化后,于色譜柱進(jìn)行分離,電噴霧離子源正負(fù)離子同步掃描,多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式測(cè)定。該方法前處理簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確度高、精密度好。試驗(yàn)研究的樣品基質(zhì)為凡納濱對(duì)蝦,后續(xù)研究將繼續(xù)擴(kuò)展蝦類品種和藥物殘留數(shù)量,以期適應(yīng)多樣品基質(zhì)種類和多藥物殘留的測(cè)定要求。