梅鳳琦，劉彥慧

(1.廣東醫(yī)科大學(xué)順德婦女兒童醫(yī)院,佛山 528300;2.廣東醫(yī)科大學(xué),湛江 523808;3.深圳市羅湖區(qū)人民醫(yī)院,深圳 518000)

自從在孕婦血漿中檢測(cè)出游離胎兒DNA的存在,并發(fā)現(xiàn)其具有胎兒全部基因組序列片段的特點(diǎn),由此開啟并推動(dòng)了無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)技術(shù)(NIPT)的發(fā)展,使NIPT在臨床中得到廣泛應(yīng)用。學(xué)者們除了通過NIPT分析胎兒染色體遺傳病外,還致力研究血漿游離DNA(Cell-free DNA,cfDNA)與不良妊娠結(jié)局的關(guān)系,以期通過cfDNA相關(guān)指標(biāo)來(lái)預(yù)測(cè)不良妊娠結(jié)局。

孕期cfDNA是包含游離母體DNA和游離胎兒DNA的混合物。游離胎兒DNA主要來(lái)自胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞[1],也有可能來(lái)自被母體免疫系統(tǒng)破壞后的胎兒細(xì)胞的殘留物[2]。常見的不良妊娠結(jié)局,如妊娠期高血壓(GH)、子癇前期(PE)、妊娠期糖尿病(GDM)、胎兒生長(zhǎng)受限(FGR)、早產(chǎn)等,通常表現(xiàn)為對(duì)胎盤甚至胎兒造成不可逆的影響,從而導(dǎo)致臨床癥狀的發(fā)生。目前,不良妊娠結(jié)局病因尚未明確,所以早篩查、早發(fā)現(xiàn)、早預(yù)防對(duì)母嬰健康尤為重要。近年來(lái),國(guó)內(nèi)外學(xué)者通過研究孕期cfDNA濃度、游離胎兒DNA分?jǐn)?shù)、線粒體DNA(mtDNA)、核小體啟動(dòng)子等cfDNA相關(guān)指標(biāo)與不良妊娠結(jié)局的關(guān)系,以期尋找能早期預(yù)測(cè)不良妊娠結(jié)局的相關(guān)指標(biāo)。

一、cfDNA濃度

孕期cfDNA含有85%～90%的游離母體DNA和10%～15%的游離胎兒DNA,其中游離母體DNA主要來(lái)自于母體髓系/淋巴系細(xì)胞[3],游離胎兒DNA主要來(lái)自胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞[1]。游離胎兒DNA最早可在孕4周時(shí)被檢測(cè)出,其濃度隨著妊娠進(jìn)展而逐漸升高,并在孕32周之后顯著升高。

1.cfDNA濃度與妊娠期高血壓疾病(HDP):HDP是妊娠期特有疾病,根據(jù)不同程度可分為GH、PE、子癇、慢性高血壓并發(fā)子癇前期、妊娠合并慢性高血壓[4]。HDP在我國(guó)的發(fā)病率為9.4%～10.4%[4],其總死亡率可達(dá)10%～16%[5],是中國(guó)孕產(chǎn)婦主要死亡原因之一。HDP病因復(fù)雜,機(jī)制尚不明確,其基本病理生理改變是全身小血管痙攣,全身各系統(tǒng)各臟器灌注減少[4]。有研究發(fā)現(xiàn),HDP患者孕早期的cfDNA濃度顯著高于正常孕婦,每當(dāng)cfDNA濃度增加1 ng/ml時(shí),HDP的發(fā)生幾率將增加至1.03倍,cfDNA濃度是HDP的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一[6]。Amaral等[7]對(duì)孕中期孕婦進(jìn)行前瞻性研究也得出相似的結(jié)論,并發(fā)現(xiàn)當(dāng)總cfDNA的濃度為160 ng/ml時(shí),可用作診斷GH和PE的臨界值,該濃度值對(duì)GH敏感性和特異性分別為71.6%和84.7%,對(duì)PE敏感性和特異性分別為82.4%和84.7%。由此可見,孕早、中期的cfDNA濃度對(duì)HDP有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值。

PE是GH同時(shí)累及多器官病情加重的表現(xiàn)。在中國(guó)人群中,孕12～22周PE患者的總cfDNA濃度和游離胎兒DNA濃度顯著高于正常孕婦,其中cfDNA濃度與PE風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)[8]。孕中、晚期cfDNA濃度能區(qū)分重度PE和HELLP綜合征(以溶血、肝酶升高、血小板減少為特點(diǎn)的嚴(yán)重HDP)[9]。需要注意的是,GH伴輕度PE患者的cfDNA濃度與正常孕婦比較無(wú)顯著差異[10]。然而,Rolnik等[11]研究發(fā)現(xiàn),對(duì)孕婦特征和胎齡校正后,孕11～13周和孕20～24周孕婦的cfDNA濃度與PE無(wú)關(guān)。目前對(duì)于孕早期總cfDNA濃度能否預(yù)測(cè)PE仍有爭(zhēng)議,但也有研究指出孕中期的游離胎兒DNA濃度與PE的嚴(yán)重程度相關(guān)[9-10]。

2.cfDNA濃度與GDM:GDM是指妊娠期間首次發(fā)現(xiàn)或出現(xiàn)糖尿病或糖耐量異常,以高血糖和高胰島素血癥為特征。隨著我國(guó)糖尿病患者人數(shù)的快速增長(zhǎng)以及生育政策調(diào)整后高齡產(chǎn)婦的增加,妊娠期高血糖已經(jīng)成為妊娠期最常見的妊娠并發(fā)癥[12],約占中國(guó)孕婦的7.4%～24.5%[13]。

Del Vecchio等[1]通過cfDNA甲基化程度觀察到妊娠前3個(gè)月GDM孕婦的胎盤特異性cfDNA濃度顯著增加。研究發(fā)現(xiàn),雖然GDM孕婦cfDNA濃度增高,但cfDNA濃度并不是GDM的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子[6]。江鴻等[14]研究發(fā)現(xiàn),GDM患者的游離胎兒DNA濃度和健康孕婦比較無(wú)顯著差異。有研究發(fā)現(xiàn),孕婦年齡是GDM的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[15]。Yuan等[8]研究發(fā)現(xiàn),≥35歲孕婦中,cfDNA濃度較高會(huì)增加患GDM的風(fēng)險(xiǎn);但<35歲孕婦中,cfDNA濃度與患GDM的風(fēng)險(xiǎn)呈負(fù)相關(guān),提示cfDNA濃度需要結(jié)合孕周和孕婦年齡聯(lián)合分析才能對(duì)GDM有預(yù)測(cè)價(jià)值。

3.cfDNA濃度與FGR:FGR是一種異質(zhì)性臨床疾病,指受母體、胎兒、胎盤等病理因素影響,胎兒超聲估測(cè)體重或腹圍低于相應(yīng)胎齡第10百分位[16],是導(dǎo)致圍產(chǎn)兒患病和死亡的重要原因?；诘聽柗品ㄑ芯窟_(dá)成的共識(shí),FGR分為早發(fā)型和晚發(fā)型兩種主要表型[17]。胎盤功能不全被認(rèn)為是FGR和較差圍產(chǎn)期結(jié)局的主要原因。有研究發(fā)現(xiàn),在孕11～13周時(shí),發(fā)生FGR孕婦的總cfDNA濃度和游離胎兒DNA濃度與正常孕婦比較無(wú)顯著差異[18]。Rafaeli-Yehudai等[19]研究發(fā)現(xiàn),胎盤介導(dǎo)發(fā)生FGR孕婦的孕晚期cfDNA濃度與健康孕婦比較無(wú)顯著差異,但PE伴FGR孕婦的cfDNA濃度顯著高于健康組。還有研究發(fā)現(xiàn),在孕早、中期游離胎兒DNA濃度升高會(huì)增加FGR及PE伴FGR的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[7,20]。目前,對(duì)于cfDNA濃度能否預(yù)測(cè)FGR仍有爭(zhēng)議。

4.cfDNA濃度與早產(chǎn):早產(chǎn)是指妊娠滿28周而不足37周的分娩[4],占國(guó)內(nèi)新生兒死亡原因的25%,是國(guó)內(nèi)新生兒死亡的重要原因之一。有研究認(rèn)為孕早期或孕中期的游離胎兒DNA濃度對(duì)早產(chǎn)沒有明顯預(yù)測(cè)價(jià)值[6,18],但早產(chǎn)患者的孕晚期的游離胎兒DNA濃度顯著高于健康組[21-22]。史文靜等[21]研究發(fā)現(xiàn),有先兆早產(chǎn)的孕婦孕30周的游離胎兒DNA濃度顯著高于健康組,其中3例有先兆早產(chǎn)的孕婦經(jīng)有效治療后,其游離胎兒DNA水平與健康組比較無(wú)顯著差異,提示孕晚期的游離胎兒DNA濃度可以作為早產(chǎn)預(yù)測(cè)的指標(biāo),并評(píng)估早產(chǎn)的治療效果。

二、血漿游離胎兒DNA分?jǐn)?shù)

血漿游離胎兒DNA分?jǐn)?shù)為游離胎兒DNA占母體總游離DNA的百分比。絕大部分孕婦在孕10周的游離胎兒DNA分?jǐn)?shù)可超過4%,平均值約10%[23]。在孕10～20周期間,游離胎兒DNA分?jǐn)?shù)每周增加約0.1%,當(dāng)超過妊娠21周,游離胎兒DNA分?jǐn)?shù)每周增加1%[23]。游離胎兒DNA分?jǐn)?shù)受胎兒和孕婦的特征影響,其與母體身高、體重和體質(zhì)量指數(shù)(BMI)呈負(fù)相關(guān),與胎齡呈正相關(guān)[24]。

1.游離胎兒DNA分?jǐn)?shù)與HDP:與cfDNA濃度不同的是,高游離胎兒DNA分?jǐn)?shù)與HDP之間無(wú)顯著相關(guān)性[25]。有研究發(fā)現(xiàn),HDP患者的游離胎兒DNA分?jǐn)?shù)顯著低于對(duì)照組,但對(duì)HDP的預(yù)測(cè)價(jià)值意義不大[26-27]。但也有研究發(fā)現(xiàn),孕早期和孕中期的低游離胎兒DNA分?jǐn)?shù)與PE的高風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)[28-29]。Gerson等[30]研究發(fā)現(xiàn),在高齡患者中,妊娠前3個(gè)月低游離胎兒DNA分?jǐn)?shù)對(duì)有較嚴(yán)重特征的PE和HDP有一定的提示風(fēng)險(xiǎn)作用,相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)值分別達(dá)到3.3和1.6。以上結(jié)果表明,游離胎兒DNA分?jǐn)?shù)預(yù)測(cè)HDP仍需要繼續(xù)進(jìn)一步研究。

2.游離胎兒DNA分?jǐn)?shù)與GDM:Hopkins等[31]研究發(fā)現(xiàn),GDM患者會(huì)出現(xiàn)低游離胎兒DNA分?jǐn)?shù),但干預(yù)BMI后,游離胎兒DNA分?jǐn)?shù)與GDM之間無(wú)顯著相關(guān)性。Yuan等[29]研究發(fā)現(xiàn),低游離胎兒DNA分?jǐn)?shù)與GDM無(wú)相關(guān)性,游離胎兒DNA分?jǐn)?shù)的增加與GDM風(fēng)險(xiǎn)降低有一定關(guān)聯(lián)。Suzumori等[26]研究發(fā)現(xiàn),GDM患者孕早期的游離胎兒DNA分?jǐn)?shù)與對(duì)照組比較無(wú)顯著差異,利用游離胎兒DNA分?jǐn)?shù)很難預(yù)測(cè)GDM。由于肥胖與糖尿病的發(fā)生高度相關(guān),而游離胎兒DNA分?jǐn)?shù)受孕婦的BMI影響較大,因此可能需要血漿游離胎兒DNA分?jǐn)?shù)聯(lián)合孕婦BMI預(yù)測(cè)GDM的發(fā)生。

3.游離胎兒DNA分?jǐn)?shù)與FGR:國(guó)內(nèi)研究發(fā)現(xiàn),FGR患者的游離胎兒DNA分?jǐn)?shù)與健康組比較無(wú)顯著差異[32],但另外兩項(xiàng)國(guó)外研究對(duì)FGR分型后分析發(fā)現(xiàn),對(duì)于沒有合并其他并發(fā)癥的FGR患者,早發(fā)型FGR患者的孕早期游離胎兒DNA分?jǐn)?shù)顯著低于正常孕婦,并認(rèn)為游離胎兒DNA分?jǐn)?shù)可作為聯(lián)合篩查模型中的額外標(biāo)記[33-34]。

4.游離胎兒DNA分?jǐn)?shù)與早產(chǎn):不同孕期的游離胎兒DNA分?jǐn)?shù)對(duì)預(yù)測(cè)早產(chǎn)的研究結(jié)論不盡一致。多項(xiàng)研究認(rèn)為,孕早期的游離胎兒DNA分?jǐn)?shù)不能預(yù)測(cè)早產(chǎn)的發(fā)生[26,30,32]。Yuan等[29]研究發(fā)現(xiàn),孕13～26周低游離胎兒DNA分?jǐn)?shù)會(huì)增加早產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn),低游離胎兒DNA分?jǐn)?shù)與早期早產(chǎn)(<34周)顯著相關(guān),與晚期早產(chǎn)(34～36周)無(wú)顯著相關(guān)。Guo等[24]研究發(fā)現(xiàn),妊娠中期的游離胎兒DNA分?jǐn)?shù)與隨后的自發(fā)早產(chǎn)之間無(wú)明顯相關(guān)性。因此,游離胎兒DNA分?jǐn)?shù)聯(lián)合妊娠相關(guān)蛋白(PAPP-A)、C-反應(yīng)蛋白和堿性磷酸酶等血清標(biāo)志物或許能提供更高的診斷價(jià)值,以確定是否有早產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)[26,30]。

三、mtDNA

mtDNA結(jié)構(gòu)較簡(jiǎn)單且數(shù)量多[35],是氧化應(yīng)激的主要來(lái)源,參與多種生理過程。在妊娠期間,胎盤發(fā)育需要大量的線粒體以滿足胎兒需求。正常孕婦mtDNA的濃度隨著孕周而變化,孕晚期mtDNA濃度顯著高于孕早期和產(chǎn)后[36]。盡管在孕婦血漿中大部分mtDNA來(lái)自母體,但大約5%～20%的mtDNA來(lái)自胎兒/胎盤,提示利用mtDNA可推測(cè)或診斷與胎盤相關(guān)的不良妊娠結(jié)局。Williamson等[37]研究發(fā)現(xiàn),線粒體功能障礙是PE氧化應(yīng)激的危險(xiǎn)因素,PE患者在孕15～20周期間mtDNA濃度顯著增加。Busnelli等[38]研究發(fā)現(xiàn),孕早期mtDNA拷貝數(shù)對(duì)PE伴FGR的診斷具有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值。線粒體活性是維持體內(nèi)葡萄糖穩(wěn)態(tài)的重要因素,孕期線粒體功能障礙可能會(huì)導(dǎo)致系統(tǒng)性胰島素抵抗的發(fā)展。McElwain等[39]研究發(fā)現(xiàn),孕中期mtDNA濃度聯(lián)合BMI可作為預(yù)測(cè)GDM發(fā)展的指標(biāo)。

四、cfDNA核小體啟動(dòng)子

血漿cfDNA因受到核小體的保護(hù)而不被破壞。Snyder等[40]通過構(gòu)建核小體基因圖譜發(fā)現(xiàn),核小體可反映其組織來(lái)源的信息,孕婦血漿cfDNA片段具有胎盤特異性,可推測(cè)啟動(dòng)子與胎盤相關(guān)的不良妊娠結(jié)局有關(guān)聯(lián)。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),不良妊娠并發(fā)癥(PE、GDM、FGR和巨大兒)患者孕早期cfDNA的核小體在初始轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(簡(jiǎn)稱“啟動(dòng)子”)與正常組相比存在多個(gè)差異基因,并通過差異基因的不同組合方式開發(fā)了預(yù)測(cè)分類器[41-42]。有研究發(fā)現(xiàn),PE患者血漿中信號(hào)傳導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子5A(STAT5A)啟動(dòng)子甲基化程度顯著低于正常孕婦[43]。Erfanian等[44]研究發(fā)現(xiàn),精氨酸加壓素(AVP)啟動(dòng)子區(qū)多態(tài)性變異與PE相關(guān),其等位基因變異可能增加PE風(fēng)險(xiǎn)。以上研究結(jié)果提示,cfDNA核小體啟動(dòng)子可作為預(yù)測(cè)不良妊娠結(jié)局的生物標(biāo)志。

綜上所述,孕期cfDNA隨著孕周和孕婦基礎(chǔ)狀態(tài)的變化而變化,而不良妊娠結(jié)局的病因復(fù)雜,目前cfDNA各項(xiàng)指標(biāo)(cfDNA濃度、游離胎兒DNA分?jǐn)?shù)、mtDNA、核小體啟動(dòng)子等)對(duì)不良妊娠結(jié)局的預(yù)測(cè)價(jià)值不盡相同,單項(xiàng)指標(biāo)的獨(dú)立預(yù)測(cè)能力有限,需要聯(lián)合孕婦年齡、BMI、孕周等情況綜合判斷才能獲得更好的預(yù)測(cè)效果。