崔永亮，羅 偉，吳航玉，吳 霜，余秀梅，程祖強，張玉婷，胡 驥

（1.四川省自然資源科學研究院，四川 成都 610041；2.四川省生態(tài)環(huán)境科學研究院，四川 成都 610041；3.四川農業(yè)大學 資源學院，四川 成都 611130；4.四川省自然資源科學研究院成都分院，四川 成都 610041）

0 引言

近年來工礦業(yè)的發(fā)展導致大量重金屬和有機物等有毒化合物進入生物圈，對生物圈中的生物造成了極大危害。重金屬污染物相比有機污染物更難以被降解，因此極易對生態(tài)環(huán)境和糧食安全造成巨大危害。據(jù)報道，礦業(yè)產(chǎn)生的重金屬污染物有主要有銅（Cu）、鎘（Cd）、鎳（Ni）、鉻（Cr）、鉛（Pb）［1］，此類重金屬污染物的環(huán)境危害潛力與富集時間正相關，通過在農用土壤富集進入農作物從而對人體健康產(chǎn)生危害。土壤重金屬污染是破壞土壤健康和導致其生產(chǎn)力下降的重要原因之一，土壤中過量的重金屬會對生態(tài)環(huán)境、動植物以及人類健康構成威脅［2］。隨著工、農業(yè)的迅速發(fā)展，污染物在環(huán)境中的不斷累積，導致土壤環(huán)境污染日益嚴重，尤其是土壤重金屬污染因其高富集、難降解、毒性強等特點而越來越被人們所關注［3］。

我國土壤銅污染問題形勢十分嚴峻，土壤中的銅含量伴隨著銅礦開采、含銅農藥的使用急劇增加，遠遠超出了土壤自身的承載能力。據(jù)報道，在污染嚴重的地區(qū)如銅礦區(qū)，土壤的銅含量可高達5000 mg／kg［4］。水中銅含量達0.01mg／L時，對水體自凈有明顯的抑制作用；超過3.0mg／L 時，會產(chǎn)生異味；超過15mg／L 時，無法飲用［5］。若用含銅廢水灌溉農田，銅在土壤和農作物中的累積會造成農作物，特別是水稻和大麥的生長不良并會污染糧食籽粒。土壤中的銅含量一旦超過一定濃度，土壤微生物數(shù)量和種群結構將會被強制改變，土壤酶活性也會降低。鎘在自然界中常以化合物狀態(tài)存在，當環(huán)境受到鎘污染后，鎘可在生物體內富集，通過食物鏈進入人體引起慢性中毒。鎘被人體吸收后，在體內形成鎘硫蛋白，選擇性地蓄積在肝、腎中。其中，腎臟可吸收進入體內近1／3 的鎘，是鎘中毒的“靶器官”，會造成骨質疏松、萎縮、變形等一系列癥狀［6］。

重金屬污染土壤由于受到重金屬毒害，導致其中各類營養(yǎng)元素含量極低，抗逆性較差的植物無法生存。豆科植物具有較強的抗逆性，廣泛分布于荒漠區(qū)、鹽堿地等惡劣的自然環(huán)境中。同時豆科植物的根系可以與根瘤菌共生，起到固氮培肥、增加土壤有機質和氮素含量的作用，從而增加土壤肥力。因此豆科植物在重金屬污染區(qū)域具有極大的農業(yè)和生態(tài)價值。氮素作為植物生長需要的最重要的大量營養(yǎng)元素之一，是植物體中蛋白質、核酸、許多輔助因子以及植物次級代謝物的主要組成成份，對植物的生長、代謝和遺傳等都具有不可替代的作用。氮素代謝、光合作用、礦質元素吸收及呼吸代謝等過程，均會影響作物的形態(tài)和產(chǎn)量［7，8］。祖艷群等研究表明，重金屬與氮素之間存在交互作用，且會對植物的生理代謝和遺傳特征產(chǎn)生影響，通過合理利用交互作用有助于減輕重金屬污染對植物的危害［9］。郭光光的研究顯示，在人工污染土壤中施氮肥可以有效提高蓖麻的生物量及其對銅的轉移率［10］。王晨驕研究發(fā)現(xiàn)，同時施用氮肥、磷肥能顯著促進重金屬污染土壤中植物的生物量，同時提高植物對重金屬的耐受性，促進植物對重金屬的富集、轉移［11］。

雖然豆科植物的固氮作用使其比其他植物更有可能在重金屬污染土壤中生長，但也有研究顯示，重金屬污染會導致豆科植物的根毛萎縮、根壞死，減少根瘤數(shù)量［12］，也會使根瘤細胞中固氮酶活性降低，影響豆科植物的固氮能力［13，14］，還會阻礙葉綠素合成，影響豆科植物的光合作用［15］。已有研究多關注如何篩選出具有重金屬抗逆性的根瘤菌與豆科植物建立聯(lián)合修復體系［16，17］，也對刺槐、紫花苜蓿、紫藤等多種豆科植物進行了廣泛研究［18，19］，但對施氮條件下大豆對重金屬的響應研究相對較少，因此，本文擬通過研究施氮條件下銅、鎘污染如何影響大豆生長來了解土壤重金屬對豆科植物的危害，探討利用施氮提高重金屬污染土地利用效率的方法是否具有可行性。

1 實驗材料和試劑

大豆種子：南豆12。南豆12 是南充市農業(yè)科學院選育的具有超高蛋白抗逆高產(chǎn)等多項優(yōu)良性狀的大豆新品種［20］，研究其在重金屬污染土壤中的表現(xiàn)有利于推動探討如何在治理重金屬污染的同時兼顧經(jīng)濟效益，提高重金屬污染土壤的利用效率。

無氮營養(yǎng)液：KCl 0.5g／L、CaSO40.2g／L、MgSO40.2g／L、KH2PO40.2g／L、C10H12FeN2NaO81mg／L、CaCO32g／L、H3BO32.8g／L、ZnSO40.2g／L、CuSO40.5mg／L、MnCl20.5mg／L、Na2MoO40.1mg／L。

含氮營養(yǎng)液：在無氮營養(yǎng)液中加入濃度為1g／L的KNO3。

重金屬鹽：CuCl2·2H2O 43mg／L 和CdCl2·2.5H2O 8.1mg／L。

2 研究方法

2.1 前處理

種子發(fā)芽。選擇均勻飽滿的南豆12 種子，放入裝有浸濕濾紙的培養(yǎng)皿中，溫室避光萌發(fā)。

盆栽實驗。盆栽土壤分別為含有16mg／kg 的Cu2＋和4mg／kg的Cd2＋的土壤，將不含Cd 和Cu 的相同土壤作為對照，并將對照、鎘污染土壤組、銅污染土壤組分別編號為MH（0）、Cd（4）、Cu（16）。為了分析施氮對大豆植株的影響，設置不施用氮作為施氮（1g／L HNO3）處理的對照，施氮和不施氮分別編號為N＋和N－，各處理均設置三盆重復。待大豆種子萌發(fā)后，在超凈工作臺將其種于盆栽中，每盆3顆種子，在表面鋪上一層石英砂，放入人工氣候培養(yǎng)箱培養(yǎng)；培養(yǎng)箱設定模擬晝夜交替，光照17h，溫度為25℃，濕度80%；黑夜7h，溫度17℃，濕度85%，以準確測定施氮對鎘和銅污染土壤中大豆植株的影響。

2.2 生長指標測定

在培養(yǎng)40d后，每個處理隨機取6 株大豆樣品，自來水沖洗大豆植株，自來水洗凈植株表面后用超純水潤洗。將植株表面擦干后測定大豆植株株高、根長、莖粗、生物量等生長指標。

2.3 植株生理生化指標測定

將收獲的植株稱重，記錄鮮重后在105℃下殺青30min，80℃烘至恒重，稱干重。磨碎過60 目篩。采用濃H2SO4—H2O2濕法消化植物樣，并分別采用凱氏定氮法、鉬銻抗比色法、火焰光度計法進行植物樣品氮、磷、鉀含量的測定。

濃H2SO4—H2O2濕法消化植物樣。取5g 植物樣與三角瓶中，加入約5mL濃硫酸浸泡一晚。將三角瓶放置在消化爐上加熱。分批滴加30% H2O2，加熱，內容物的顏色由黑色逐漸變成棕色、棕黃色，最后成為淺黃色或無色的澄清溶液。消化至此完成，需時大約30min。消化液中可能會有少量棕色的無定型疏松狀固體浮于液面。冷卻后定容為50mL，進行過濾，濾液供測試使用。

凱氏法測定植物樣中的氮含量。將濾液中加入5mL硼酸指示溶劑，置于全自動凱氏定氮儀上進行加堿蒸餾3min，將試樣中的氨通過冷凝由H3BO3溶液直接吸收，并用鹽酸標準溶液滴定硼酸吸收液，記錄鹽酸滴定體積，計算樣品中全氮含量。

鉬銻抗比色法測定植物樣中的全磷含量。取10mL濾液于100mL容量瓶中，加入10mLH3BO3溶液，再加入兩滴二硝基酚指示劑，搖勻，用H2SO4和NaOH溶液調節(jié)pH 至溶液剛呈微黃色，再加5mL鉬銻抗試劑顯色，并用蒸餾水定容。搖勻后，置于室溫下顯色30min，用分光光度計在700nm 波長下進行比色，讀出測定液的吸收值。

火焰光度法測定植物樣中的全鉀含量。吸取濾液5mL于25mL容量瓶中，用水定容，直接在火焰光度計上測定，記錄檢流計的讀數(shù)。

2.4 重金屬含量的測定

用混酸（VHNO3∶ VHClO4＝4∶ 1）消煮植物樣品重金屬。所有樣品的重金屬的測定用ICP—OES方法上機測定，并用國家標準重金屬溶液作為參比。

2.5 數(shù)據(jù)分析

本研究使用Microsoft office 2010 對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，使用SPSS17.0 對數(shù)據(jù)進行顯著性差異的分析，并使用Microsoft office 2010 對數(shù)據(jù)進行作圖。

3 結果及分析

3.1 銅、鎘污染下施氮對大豆生長的影響

由表1 可知，在所有處理中，施氮對根長沒有顯著的促長作用。在無重金屬污染的土壤中，施氮顯著提高了大豆植株的株高、莖粗和生物量，分別增加了32.32%、46.42%、247.58%。在銅、鎘污染土壤中，施氮對大豆的株高、莖粗、生物量也起到了一定的促進作用，但對不同處理條件下的影響程度不同。在銅污染土壤中，施氮使大豆的株高、莖粗和生物量分別增加了43.38%、12.12%和162.01%；在鎘污染土壤中，施氮使大豆的株高、莖粗和生物量分別增加了47.67%、20.68%和218.69%。在不施氮處理條件下，銅和鎘并沒有顯著影響大豆的株高、莖粗和生物量，但使株高下降了2.36%和1.70%，生物量下降了17.74%和33.87%，莖粗上升了16.90%和3.57%。在施氮處理條件下，銅和鎘雖未顯著影響大豆株高與莖粗，但大豆株高分別上升了5.63%、9.60%，莖粗則分別下降了9.86%、12.99%，同時大豆生物量分別下降了24.61%、39.36%。

表1 鎘、銅污染土壤中大豆的生長狀況和生物量Table 1 Growth and biomass of soybean plants in the copper or cadmium contaminated soil

3.2 對大豆植株營養(yǎng)指標的影響

3.2.1 對大豆植株氮含量的影響

由圖1 可知，在未施氮的處理條件下，土壤中的銅和鎘未顯著影響大豆莖和葉中的氮含量，但顯著影響了大豆根的氮含量，使其分別下降了49.88%和52.74%。在施氮條件下，土壤中的銅和鎘使大豆根部氮含量下降了42.88%和28.31%，葉部氮含量下降了2.78%、33.95%，但未對大豆莖部的氮含量有顯著影響。在無重金屬污染的土壤中，施氮顯著促進了大豆植株根莖葉的氮含量，分別增加了43.92%、116.95%、57.60%。在銅、鎘污染土壤中，施氮對大豆植株氮含量也起到了一定的促進作用，但對不同處理條件下的影響程度不同。在銅污染土壤中，施氮使大豆根、莖和葉中的氮含量分別增加了64.52%、135.71%和55.48%；在鎘污染土壤中，施氮使大豆根、莖、葉的氮含量分別增加了120.20%、138.25%、10.21%。

圖1 大豆根、莖、葉的氮含量Figure 1 Nitrogen content in root，stem and leaf of soybean plants

3.2.2 對大豆植株磷含量的影響

由圖2 可知，在未施氮的處理條件下，土壤中的銅未影響大豆根、莖的磷含量，但使大豆葉部磷含量下降了50.18%；土壤中的鎘使大豆根、莖、葉的磷含量分別下降了70.26%、75.87%、70.42%。在施氮條件下，土壤銅和鎘未對大豆根、莖、葉的磷含量產(chǎn)生顯著影響。在無重金屬污染的土壤中，施氮對大豆植株根、莖、葉的磷含量有顯著影響，分別下降了78.19%、93.03%、65.98%。在土壤銅、鎘污染條件下，施氮對大豆植株的磷含量影響各不相同。在銅污染土壤中，施氮使大豆根、莖、葉的磷含量分別下降了79.72%、80.30%、43.71%；在鎘污染土壤中，施氮使大豆根、葉的磷含量分別上升了66.93%、10.75%，莖部的磷含量下降了13.46%。

圖2 大豆根、莖、葉的磷含量Figure 2 Phosphorus content in root，stem and leaf of soybean plants

3.2.3 對大豆植株鉀含量的影響

由圖3 可知，在未施氮的處理條件下，銅顯著影響了大豆根的鉀含量，使其下降了27.53%，但土壤鎘未顯著影響大豆植株的鉀含量。在施氮條件下，銅和鎘只對大豆根的鉀含量產(chǎn)生影響，使大豆根的鉀含量分別下降了22.99%和24.05%。在無重金屬污染的土壤中，施氮使大豆植株根、莖、葉的鉀含量分別增加了31.13%、36.00%、79.03%。在土壤銅、鎘污染條件下，施氮對大豆植株的鉀含量影響各有不同。在銅污染土壤中，施氮使大豆根、莖、葉的鉀含量分別增加了39.31%、61.43%、104.69%；在鎘污染土壤中，施氮也使大豆根、莖、葉的鉀含量分別上升了10.97%、37.36%、47.49%。

圖3 大豆根、莖、葉的鉀含量Figure 3 Potassium content in root，stem and leaf of soybean plants

3.3 對大豆植株重金屬含量的影響

由表2 可知，在土壤銅、鎘污染條件下，施氮對大豆植株各部分重金屬含量影響各不同。在鎘污染土壤中，施氮均減少了大豆根和莖的鎘含量，使其分別下降了50.98%和78.28%。在銅污染土壤中，施氮僅使大豆根中的銅含量顯著下降了48.91%。盡管土壤中鎘的含量低于銅，但大豆根吸收的鎘含量卻高于銅含量。在未施氮的處理條件下，大豆根、莖中的鎘含量均高于銅含量，但大豆葉中的銅含量高于鎘含量。在施氮條件下，大豆莖、葉中的銅含量高于鎘含量，而在大豆根部鎘含量高于銅含量。

表2 鎘污染土壤中大豆鎘含量與銅污染土壤中大豆銅含量（單位：mg／kg）Table 2 Cadmium content of soybean plants in cadmium contaminated soil and copper content of soybean plants in copper contaminated soil（Unit：mg／kg）

4 討論

土壤受銅、鎘等重金屬毒性的影響而相對貧瘠，植株難以生長生存，而通過施加氮肥，能夠良好的緩解土壤中重金屬的毒害作用［21］，提高大豆生物量和營養(yǎng)元素的積累，使重金屬污染土壤中植物增產(chǎn)［22，23］，提升了重金屬污染土地的利用效率。因此，本研究主要通過銅、鎘污染土壤中大豆的盆栽實驗，揭示了銅、鎘污染土壤中施氮不僅對大豆生物量及營養(yǎng)元素積累有不同程度的積極作用，還能有效降低大豆植株對污染土壤中銅、鎘的富集程度，間接提高大豆植株在重金屬污染土壤中的生產(chǎn)效率。

在施氮或不施氮條件下，土壤中的銅、鎘污染均會對大豆植株的生長產(chǎn)生抑制作用，可能是因為重金屬會降低植物葉片中的葉綠素含量，同時抑制了土壤微生物如根瘤菌的活性，從而影響植物對氮素的利用［24，25］。但施氮后，大豆株高、莖粗和生物量均有提升，可能是因為氮素的添加提高了葉片中葉綠素含量，光合作用加強，從而緩解了土壤重金屬對大豆植株的毒害作用［26］。施氮對土壤銅污染給大豆帶來的毒害緩解作用比對鎘毒害的緩解作用更強，可能是由于不同重金屬影響植物氮素利用的方式不同。鎘污染會影響植物中的硝酸還原酶、谷氨酸還原酶等氮代謝關鍵酶的活性［27］，而銅污染則會影響植物中抗氧化酶的活性［28，29］。此外，本研究結果顯示，銅、鎘污染土壤中的大豆長勢反而好于沒有重金屬污染土壤中的大豆，這是由于銅作為植物生長所需的微量元素參與了植物的呼吸作用、光合作用等過程，因此少量銅元素在一定程度上能促進大豆的生長［30，31］，而鎘則可能通過增加植物中過氧化物酶的活性來促進植物生長［32］。

從大豆植株中營養(yǎng)元素含量來看，土壤銅、鎘污染對大豆植株的營養(yǎng)元素積累存在不同程度的影響，而施氮可顯著增加大豆根、莖、葉中氮、鉀營養(yǎng)元素的含量。土壤銅、鎘污染對大豆根的氮積累影響較顯著，而施氮對于緩解莖部的銅、鎘脅迫的效果最好，根部次之。施氮也可緩解大豆葉部受到的銅脅迫，且比緩解鎘脅迫的效果更好，而根部、莖部則相反。施加氮肥對于銅污染土壤中大豆根莖葉的磷含量無影響，但提高了鎘污染土壤中大豆根、葉部的磷含量。但施氮使部分處理中大豆的磷含量下降，這可能是由于氮元素營養(yǎng)量的增加抑制了大豆各部分對于磷的吸收［33］。土壤銅、鎘污染對大豆根部的鉀的吸收積累表現(xiàn)出抑制作用。銅、鎘污染土壤中施氮使大豆根、莖、葉的鉀含量均有所提高，其中葉部的鉀含量提高最為顯著，莖部次之。此外，在銅、鎘污染土壤中，施氮顯著降低了大豆植株中銅、鎘的含量，使土壤銅、鎘污染對大豆植株各部分的毒害作用減小。其中，施氮使大豆莖中的鎘含量降低幅度最大，說明施氮能有效緩解鎘對大豆莖部的脅迫；施氮使大豆根中的銅含量降低幅度最大，說明施氮能有效緩解銅對大豆根部的脅迫。

綜上，在銅、鎘污染土壤中施加氮肥能緩解銅、鎘對植物的毒害作用，增強大豆在重金屬污染土壤中的抗性［33］，減少重金屬污染土壤中的污染元素在大豆植株中的富集，對大豆植株生長有促進作用，尤其是對于大豆根莖葉在銅、鎘土壤污染下的氮元素和鉀元素的吸收有顯著的積極效果。施氮能夠有效提升重金屬污染土壤中大豆的產(chǎn)量與品質，在后續(xù)實際應用過程中，能同時兼顧土壤重金屬污染修復和經(jīng)濟效益，有效提高重金屬污染土地的利用效率［34］。

5 結論

在銅、鎘污染土壤中施氮對大豆生長、生物量、營養(yǎng)元素積累有顯著的促進作用，同時還能有效降低大豆植株中的銅、鎘含量，有效緩解土壤銅、鎘污染對大豆植株的危害，但不同重金屬污染土壤中施氮對大豆植株的影響程度各不相同。因此，本研究明確了氮素在緩解土壤重金屬污染對大豆植株危害中的積極作用，為利用施氮來提升重金屬污染土壤中大豆的生產(chǎn)效率提供理論依據(jù)，也為進一步提升重金屬污染土地的利用效率提供技術支撐。