鐘俊 王文，2*

近年來，肩袖損傷、前交叉韌帶損傷等已成為運動醫(yī)學(xué)最常見的韌帶/肌腱損傷[1]。此類韌帶/肌腱（如岡上肌或前十字韌帶）因其結(jié)構(gòu)特殊，須采用韌帶/肌腱止點重建術(shù)，即人為重建一個新的腱骨界面，然而該手術(shù)效果及預(yù)后很大程度上取決于重建的腱骨界面的愈合情況[2]，單純手術(shù)治療往往愈合欠佳[3]。近年來，隨著組織工程的進步，組織工程支架逐漸顯現(xiàn)出了促腱骨愈合的潛力，目前用于促腱骨愈合的組織工程支架主要分為兩大類：生物衍生支架材料（如脫細胞ECM支架等）和人工合成支架材料。本文總結(jié)并概述了用于促進腱骨愈合的人工合成支架材料，重點歸納了人工合成支架材料促腱骨愈合的最新進展。

1 正常生理狀態(tài)下的腱骨界面結(jié)構(gòu)及其重要意義

1.1 腱骨界面的解剖結(jié)構(gòu)

生理狀態(tài)下，大多數(shù)的腱骨界面為4 層逐漸轉(zhuǎn)變的結(jié)構(gòu)，從肌腱末端發(fā)出的膠原纖維呈扇形散開，最終交錯插入骨質(zhì)纖維中，如前十字韌帶的股骨止點及肩袖的岡上肌腱的肱骨止點，這種過渡的結(jié)構(gòu)能最大程度上地均勻分布施加在腱骨結(jié)合部上的應(yīng)力，避免應(yīng)力集中導(dǎo)致腱骨分離。還有少部分腱骨界面并無過渡結(jié)構(gòu)形成，肌腱/韌帶直接與骨相連。兩種類型的腱骨界面之間的形成與功能差異，目前尚未明確。

1.2 腱骨界面的細胞分子構(gòu)成

微觀來看，腱骨界面兩端及中間的纖維軟骨帶的細胞及細胞外基質(zhì)的構(gòu)成彼此之間幾乎完全不同[4]，細胞外基質(zhì)方面肌腱與骨端富含Ⅰ型膠原，但骨同時還有大量的鈣鹽沉積，而纖維軟骨帶部分則主要由Ⅱ型膠原構(gòu)成，同時基質(zhì)中含有大量的蛋白多糖，在肌腱與纖維軟骨帶區(qū)域還發(fā)現(xiàn)有大量的亮氨酸富集蛋白，有研究認為正是這些蛋白及蛋白多糖使得從肌腱末端發(fā)出的膠原纖維得以呈扇形散開[5]；細胞構(gòu)成方面肌腱端主要為成纖維細胞樣的腱細胞構(gòu)成，纖維軟骨帶主要為纖維軟骨細胞并隨著鈣質(zhì)沉積而逐漸變?yōu)榉蚀蟮睦w維軟骨細胞，骨端則由骨細胞、成骨細胞與破骨細胞構(gòu)成。

1.3 恢復(fù)腱骨界面的重要意義

單純手術(shù)極難恢復(fù)腱骨界面的過渡結(jié)構(gòu)，有研究認為可能是因為腱骨界面是軟/硬組織之間的界面，界面兩端的細胞及細胞外基質(zhì)的蛋白構(gòu)成幾乎完全不同[4]。單純手術(shù)重建后的腱骨界面大多為反應(yīng)性瘢痕愈合[6-7]，相較于天然的腱骨界面，瘢痕愈合的腱骨界面多有脂肪浸潤，纖維排列紊亂、方向無序、彈性差且抗?fàn)坷芰Σ畹炔涣棘F(xiàn)象[8]。后期肌腱/韌帶反復(fù)的牽拉會導(dǎo)致瘢痕愈合的界面內(nèi)部輕則出現(xiàn)微觀損傷，重則出現(xiàn)結(jié)構(gòu)斷裂，前者會導(dǎo)致局部水腫、無菌性炎癥，引起疼痛不適，后者甚至?xí)?dǎo)致重建手術(shù)失敗，腱骨界面分離。因此促進腱骨愈合具有極其重要的研究及臨床意義。

2 促腱骨愈合的人工合成支架材料

組織工程支架材料能作為緩釋載體或輸送系統(tǒng)，運輸干細胞、生長因子或營養(yǎng)物質(zhì)進入體內(nèi)并釋放，優(yōu)化修復(fù)環(huán)境；或通過空間結(jié)構(gòu)募集細胞并調(diào)控募集細胞的分布及分化方向，從而直接或間接地引導(dǎo)修復(fù)細胞向需要的方向分化來促進腱骨愈合。盡管其中的生物衍生支架類材料已有許多研究證明其效果卓越，但該類支架由于受限于供體組織來源及處理問題需取活體組織進行處理，因此獲取難度較高，成本較高，推廣使用難度大。而人工合成支架材料原材料獲取簡單，便于推廣使用，逐漸成為了組織工程支架促腱骨愈合領(lǐng)域的研究熱點。人工合成支架材料根據(jù)結(jié)構(gòu)可大體分為單相支架、多相一體化支架及梯度漸變仿生支架[4]。

2.1 人工合成支架材料的選擇

基于手術(shù)方式的不同，重建的腱骨止點固定方式大致分為錨釘縫合法或經(jīng)骨縫合法等，代表性的手術(shù)為肩袖岡上肌止點重建術(shù)，此類固定方式因重建止點周圍組織間隙多，采取界面充填型支架時難以將支架材料可靠地固定在填充部位（見圖1B），故針對于此類腱骨止點的支架更多采取補片橋接型（見圖1A）且結(jié)構(gòu)材料方面采取的更多為兼具機械強度與生物降解性的人工聚合物成分以提供物理支持，分擔(dān)界面拉應(yīng)力，并在支架上掛載生長因子等活性物質(zhì)調(diào)控修復(fù)細胞行為；經(jīng)骨隧道法，代表性的為前交叉韌帶重建術(shù)，此類固定方式的骨隧道與骨隧道內(nèi)重建韌帶之間的空間狹窄，故此類固定方式更多采取界面充填型支架（見圖1C），結(jié)構(gòu)材料采取的多為容易降解且無毒的天然聚合物成分以及時降解，避免遮擋腱骨結(jié)合，并掛載諸如膠原、羥基磷灰石等細胞外基質(zhì)成分增強腱骨整合。

圖1 腱骨部位及支架放置部位示意圖

2.2 單層支架

單層支架研究起步最早，研究數(shù)量最多，早期的單層支架結(jié)構(gòu)材料更多是采取以明膠為代表性的易降解材料[9-10]，主要以支架降解時釋放營養(yǎng)物質(zhì)為治療策略。袁曉偉[11]在明膠支架上裝載了辛伐他汀/羥基磷灰石納米顆粒（hydroxyapatite nanoparticles,na-HAP）微球，支架降解能持續(xù)緩釋辛伐他汀/na-HAP 促進大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）增殖并向成骨分化，通過緩釋營養(yǎng)物質(zhì)持續(xù)起效，且過程中支架本體逐漸降解，避免遮擋腱骨愈合。

后有學(xué)者提出易降解材料的機械強度不足，支架植入體內(nèi)后易發(fā)生形變甚至破裂[12]，導(dǎo)致體內(nèi)外實驗效果不匹配，并且破裂形成的游離體對于局部愈合亦是一種不利因素，遂逐漸研究出了以聚己內(nèi)酯（polycaprolactone,PCL）和聚乳酸-羥基乙酸等生物相容性好、機械強度高的原料作為結(jié)構(gòu)材料的支架，其不易發(fā)生形變，緩釋作用時間更長，并且還可以為修復(fù)細胞提供生長依附的空間[13-17]。Reifenrath 等[18]在殼聚糖包裹的PCL 纖維靜電紡織成的支架上負載并持續(xù)緩釋具有成軟骨作用的TGF-β，可促進重建腱骨止點處的纖維軟骨樣結(jié)構(gòu)的生成。朱禮偉[19]在3D打印的鈦合金微孔支架搭載轉(zhuǎn)化生長因子β3（transforming growth factor-β3,TGF-β3），通過持續(xù)緩釋TGF-β3，長期有效地促進損傷處新骨形成。Zhu 等[20]電紡了PCL/KGN（kartogenin,KGN）支架，該支架能緩慢持續(xù)釋放KGN，促進損傷處修復(fù)細胞向軟骨方向分化，并且具有取向排列的纖維結(jié)構(gòu)，促使細胞定向排列，避免新生膠原排列紊亂，增強愈合處機械強度。此外，采用PCL的單層支架在擁有卓越的機械強度的同時仍然是可降解的，即便是充填型支架也不會遮擋腱骨結(jié)合。

由于部分單層支架構(gòu)型為補片型的橋接支架，覆蓋在腱骨愈合處時不僅可以彌散營養(yǎng)物質(zhì)，還能提供機械支撐及物理屏障，阻止瘢痕與脂肪等影響腱骨愈合的組織長入[21-22]。Kim 等[23]通過肝素介導(dǎo)在真空干燥制備的PCL/聚丙二醇與環(huán)氧乙烷加聚物補片型支架上結(jié)合血小板源性生成因子（platelet-derived growth factor,PDGF）與骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（bone morphogenetic protein-2,BMP-2），能緩釋生長因子并且補片型的結(jié)構(gòu)能作為物理屏障阻止纖維組織長入修復(fù)處，影響愈合效果，動物實驗提示該支架具有促進類似原生腱骨結(jié)合部樣組織的潛力。

然而，由于腱骨愈合處周圍組織間隙較多，支架緩釋的營養(yǎng)物質(zhì)有流動到其他部位導(dǎo)致不良反應(yīng)發(fā)生的可能，近年來國內(nèi)外開始探索構(gòu)建具有特定拓撲學(xué)結(jié)構(gòu)的支架，其治療策略是通過平行排列的通道狀或溝渠狀結(jié)構(gòu)用于促進成腱分化[24-25]，通過各向異性疏松多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)用于促進成骨分化[26-27]。Chen等[28]3D打印的PLGA支架具有隨機排列疏松多孔的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，可以作為骨髓間充質(zhì)干細胞載體，在重建的腱骨界面處富集修復(fù)細胞促進修復(fù)。周建平[29]電紡制備的PCL-聚乙二醇（polyethylene glycol,PEG）-PCL/45S5 生物活性玻璃復(fù)合支架，具有平行排列的溝渠狀結(jié)構(gòu)，可優(yōu)化纖維軟骨膠原的排列。以構(gòu)建拓撲學(xué)結(jié)構(gòu)為治療策略的支架采用的結(jié)構(gòu)材料機械強度往往十分優(yōu)秀，富有彈性及韌性，植入損傷處不僅可以作為細胞攀附生長的生長空間，還可以為尚未愈合的腱骨界面提供機械支持，遮擋一定程度的牽拉力或應(yīng)力，降低復(fù)發(fā)斷裂的風(fēng)險。

總的來說，單層支架各方面的研究相對完善，主要是通過改善腱骨愈合處的微環(huán)境，富集修復(fù)處的修復(fù)細胞，提供所需的營養(yǎng)物質(zhì)并調(diào)控其生長分化，促進并優(yōu)化細胞外基質(zhì)的沉積以促進損傷修復(fù)，并且因為單層支架的均質(zhì)性特點，支架形狀可塑性極強，整體性好，而止點重建術(shù)后的腱骨愈合處的形狀往往多變且不規(guī)則，可隨意裁剪以匹配修復(fù)處形狀是不可忽視的優(yōu)勢。

2.3 復(fù)層一體化支架

由于軟骨細胞和成骨細胞的代謝和增殖需要不同的微環(huán)境，使得單層支架結(jié)構(gòu)較難同時滿足促成骨、成軟骨、成腱作用，復(fù)層一體化支架便應(yīng)運而生。復(fù)層一體化支架具有多層功能各異的結(jié)構(gòu)，能同時提供界面兩端細胞適宜的微環(huán)境。其設(shè)計思路豐富多樣，部分支架以提供細胞攀附與生長的空間，通過填充或覆蓋的方式富集并橋接重建術(shù)后的止點兩側(cè)修復(fù)細胞為治療策略。Romeo 等[30]采用靜電紡絲技術(shù)構(gòu)建的聚乙醇酸/聚丙交酯-ε-己內(nèi)酯雙層一體化支架，作為FDA批準(zhǔn)的第一種用于腱骨愈合的支架，在動物實驗中觀察到了重建腱骨止點處出現(xiàn)類似于天然腱骨結(jié)合處的過渡帶樣結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生，并且在臨床實驗中有效地提升肩袖撕裂后的修補愈合率至91%，且所有患者均未出現(xiàn)支架相關(guān)不良事件。Alkaissy等[31]在3D打印的PCL硬基中電紡嵌入了PCL+聚對二氧環(huán)己酮（polydioxanone,PDO）長細絲，制備了具有腱骨－軟硬雙相的復(fù)層一體化支架，將其植入損傷處能填充組織缺損區(qū)域，鏈接重建腱骨止點兩端修復(fù)細胞，促進重建止點愈合。上述類型支架由于不含活性成分，植入后不易引起免疫排斥反應(yīng)，材料性狀穩(wěn)定無毒，機械強度可靠，是目前最有望投入臨床使用的支架類型。

另外，有研究進一步在復(fù)層一體化支架上添加生物化學(xué)信號（生長因子或營養(yǎng)物質(zhì)等），富集細胞的同時進一步調(diào)控黏附細胞的生物行為。Tarafder等[32]采取3D打印技術(shù)，以PCL+PLGA為支架的結(jié)構(gòu)材料，在支架的上、中、下三層分別掛載了結(jié)締組織生長因子（connective tissue growth factor,CTGF）、CTGF+TGF-β3、BMP-2，能持續(xù)分層緩釋促成腱的CTGF/促成骨的BMP-2/促成軟骨的CTGF+TGF-β3，區(qū)域特異性的募集干細胞并調(diào)控其分化，使重建恢復(fù)后的腱骨界面更貼近原生腱骨界面。

然而，現(xiàn)有支架材料并不能很好地控制生長因子的緩釋方向與部位，彌散至損傷部位附近的內(nèi)環(huán)境的生長因子是否會隨著內(nèi)環(huán)境循環(huán)至其他部位而引起異位組織的異常增殖仍有待進一步研究。因此，有研究采取攜帶細胞外基質(zhì)或物理信號（如特定的拓撲學(xué)結(jié)構(gòu)）以誘導(dǎo)細胞的分化方向。Cong等[33]采用靜電紡絲技術(shù)制備了一種三層一體化支架，支架的起端是呈平行排列的Ⅰ型膠原/PCL 纖維構(gòu)成，中間部分由非取向排列的Ⅱ型膠原/PCL纖維構(gòu)成，末端由非定向排列羥基磷灰石納米顆粒/PCL纖維構(gòu)成，模擬了原生的腱骨界面的基質(zhì)構(gòu)成，體外實驗證明該支架促進了過渡樣結(jié)構(gòu)形成。Cao 等[34]模擬天然的腱骨界面，采用3D 打印PCL/磷酸三鈣（tricalcium phosphate,TCP）-PCL/TCP三層一體化支架，通過動物實驗可以觀察到支架上出現(xiàn)以鈣化軟骨帶為特征的過渡樣結(jié)構(gòu)形成。

毫無疑問，相較于單層支架，復(fù)層一體化支架促腱骨愈合作用機制更為完善，并且相關(guān)研究也表明此類支架促進腱骨愈合的效果肯定[32-34]，但復(fù)層結(jié)構(gòu)不可避免會降低支架的整體性，出現(xiàn)層次之間的分解及降解率的不一致。因此，如何協(xié)調(diào)復(fù)層一體化支架在植入修復(fù)處后支架上各種成分之間的作用，以及支架的各層結(jié)構(gòu)間的降解率便成為了下一步需要解決的問題。

2.4 梯度漸變仿生支架

復(fù)層一體化支架雖然能通過多層結(jié)構(gòu)分工模擬原生的腱骨界面微環(huán)境，但原生的腱骨界面的層次之間的轉(zhuǎn)變呈過渡式而非斷層式。鑒于此，梯度漸變支架材料被逐漸研發(fā)出來：其梯度漸變多數(shù)體現(xiàn)在支架上的細胞外基質(zhì)成分，如通過在聚乳酸/na-HAP 補片型支架表面灌注PLA 溶液，使固液界面溶脹擴散，支架中的na-HAP 沉積濃度出現(xiàn)梯度漸變，細胞實驗發(fā)現(xiàn)接種在支架上的脂肪來源間充質(zhì)干細胞出現(xiàn)了區(qū)域特異性分化差異[35]。另外一項研究通過逐漸降低絲素蛋白支架在模擬體液內(nèi)浸泡時的液面高度，同樣使支架上鈣質(zhì)沉積濃度出現(xiàn)梯度變化，接種在支架上的骨髓間充質(zhì)干細胞亦出現(xiàn)了與鈣質(zhì)濃度變化相匹配的分化差異[36]，以上支架的治療策略為通過梯度變化的鈣質(zhì)沉積調(diào)控黏附細胞的分化，從而形成類似于天然腱骨界面的梯度鈣化樣結(jié)構(gòu)，對于促進腱骨愈合有重要意義。還有研究進一步結(jié)合拓撲學(xué)與仿生學(xué)，在梯度漸變仿生支架上加入特定的拓撲學(xué)結(jié)構(gòu)，進一步提升支架的調(diào)控黏附細胞生物行為的能力。Stanton等[37]開發(fā)的水凝膠支架不僅具有梯度漸變的na-HAP 濃度，同時其平行排列的明膠微帶結(jié)構(gòu)有效地優(yōu)化了黏附細胞細胞外基質(zhì)膠原纖維的排列。Zhu 等[38]采取熱致相分離技術(shù)制備的HAP/PLGA 立體支架不僅具有梯度變化的鈣沉積，并且其拓撲學(xué)結(jié)構(gòu)包含了利于腱源細胞長入的平行排列的通道狀上層結(jié)構(gòu)與利于骨來源細胞長入的疏松小孔下層結(jié)構(gòu)，類似于天然的腱骨界面構(gòu)形，對于促進腱骨愈合有巨大的潛力，進一步的動物實驗也證明梯度漸變仿生支架有效促進了更多類似于天然腱骨界面的組織形成并提高了修復(fù)處的抗?fàn)坷芰36]。此類支架上逐漸變化的細胞外基質(zhì)成分有效地誘導(dǎo)了黏附于支架上的修復(fù)細胞的差異性分化，并且由于這種分化差異具有梯度，避免了細胞成分突然變化帶來的組織斷層影響愈合后的腱骨界面強度。

值得一提的是，Calejo 等[39]創(chuàng)新性地在電紡液中逐漸加入PL，從各向異性絲線逐漸編織到na-HAP 的各向同性絲線，構(gòu)建的立體支架上不僅呈現(xiàn)出了梯度漸變的細胞外基質(zhì)成分，同時還具有逐漸變化的拓撲學(xué)結(jié)構(gòu)，細胞實驗證明，接種在支架上的人脂肪間充質(zhì)干細胞的細胞外基質(zhì)鈣化程度等成骨分化相關(guān)特征均明顯高于無支架的對照組。毫無疑問，梯度漸變仿生支架能最大程度地模擬原生的腱骨界面微環(huán)境，促腱骨愈合效果肯定，并且因其不存在內(nèi)部分層界面，故機械性能也較多層支架優(yōu)秀，是最理想的促腱骨愈合的支架材料，也是目前領(lǐng)域內(nèi)的研究熱點，但此類支架制備難度大，支架上的梯度漸變的成分、結(jié)構(gòu)及表型尚待進一步探索，并且如何簡化制備工藝仍需進一步研究。

3 總結(jié)與展望

目前已有許多證明有效促進腱骨愈合的人工合成支架材料設(shè)計制備出來，考慮到腱骨界面同時由兩種干細胞進行修復(fù)（肌腱干細胞及骨髓間充質(zhì)干細胞），提示了接下來人工合成支架材料在促腱骨愈合領(lǐng)域的主要研究方向應(yīng)在以下兩方面：一方面，優(yōu)化已證明有效的人工合成支架的機械強度，控制其制備成本，標(biāo)準(zhǔn)化其制備流程，進一步提高應(yīng)用前景；另一方面，繼續(xù)探索設(shè)計制備人工合成支架，設(shè)計時整合盡可能多的信號，包括生物化學(xué)信號（如生長因子、KGN 等）、物理信號（如局部的流體剪應(yīng)力等）、幾何結(jié)構(gòu)（如取向排列的纖維結(jié)構(gòu)利于腱樣組織再生），甚至支架表面的曲率等，進一步模擬生理腱骨界面結(jié)構(gòu)，協(xié)同引導(dǎo)調(diào)控兩種干細胞的行為，最終促成腱骨界面結(jié)構(gòu)化修復(fù)。