鄭敏 蘇福聯(lián) 袁名遠(yuǎn) 劉玉 黃東海 張巍 李宇 廖璐婧 羅凱 何美軍

摘要：對(duì)葛根［Pueraria montana （Loureiro） Merrill］總黃酮的抑菌和抗氧化活性進(jìn)行研究。采用單因素試驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化葛根的水提工藝，利用紫外分光光度法和高效液相色譜法對(duì)葛根總黃酮進(jìn)行表征，并運(yùn)用瓊脂擴(kuò)散法和以DPPH·、ABTS+·和總還原能力為指標(biāo)評(píng)價(jià)葛根總黃酮的生物活性。結(jié)果表明，優(yōu)化后的葛根總黃酮提取工藝為料液比（m∶V，g∶mL）1∶16，提取時(shí)間69 min，提取3次，總黃酮得率為7.690%。優(yōu)化后的葛根總黃酮中檢出9種常見(jiàn)黃酮成分，其含量總占比為91.81%；葛根總黃酮對(duì)11株供試菌有不同的抑菌活性，并首次發(fā)現(xiàn)其對(duì)糞鏈球菌（Enterococcus faecalis）和蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）有中度敏感作用，MIC分別為250、500 mg/mL，具有較強(qiáng)的清除能力和總還原能力，其中對(duì)DPPH·、ABTS+·自由基的IC50分別為0.398、0.189 mg/mL。

關(guān)鍵詞：葛根［Pueraria montana （Loureiro） Merrill］； 響應(yīng)面； 工藝優(yōu)化； 總黃酮； 抑菌； 抗氧化

中圖分類號(hào)：R284.2 ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2023）11-0065-08

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2023.11.012 開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Optimization of extraction process of total flavonoids from Pueraria montana and its antibacterial and antioxidant activities

ZHENG Min1，2， SU Fu-lian1，2， YUAN Ming-yuan1，2， LIU Yu1，2， HUANG Dong-hai1，

ZHANG Wei3， LI Yu1， LIAO Lu-jing1， LUO Kai2， HE Mei-jun1

（1.Institute of Chinese Herbal Medicines， Hubei Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Chinese Herbal Medicine Biology and Cultivation， Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Hubei Research and Development Center of Chinese Herbal Medicine， Enshi ?445000，Hubei，China；2. College of Biological and Food Engineering， Hubei Minzu University， Enshi ?445000，Hubei，China；3.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Research， Hubei Academy of Agricultural Sciences，Wuhan ?430064， China）

Abstract： The antibacterial and antioxidant activities of total flavonoids from Pueraria montana （Loureiro） Merrill were studied. The water extraction technology of Pueraria montana was optimized by the single factor test and response surface method. The total flavonoids were characterized by ultraviolet spectrophotometry and high performance liquid chromatography. The biological activities of total flavonoids were evaluated by agar diffusion method， with DPPH·， ABTS+· and total reduction capacity as indicators. The results showed that the optimized extraction process of total flavonoids from Pueraria montana was as follows： Solid-liquid ratio （m∶V，g∶mL） of 1∶16， extraction time of 69 min， extraction times of 3 times， and the total flavonoids yield was 7.690%. Nine common flavonoids were detected in the optimized total flavonoids of Pueraria montana， the total content of which accounted for 91.81%. The total flavonoids of Pueraria montana had different antibacterial activities against 11 strains tested， and it was found to be moderately sensitive to Enterococcus faecalis and Bacillus thuringiensis for the first time， with MIC of 250， 500 mg/mL， respectively. It had strong scavenging ability and total reduction ability， and the IC50 of DPPH· and ABTS+· free radicals were 0.398， 0.189 mg/mL， respectively.

Key words： Pueraria montana（Loureiro）Merrill； response surface； process optimization； total flavonoid； antibacterial； antioxidation

葛根［Pueraria montana （Loureiro） Merrill］又稱野葛、葛藤、葛麻姆，是豆科葛屬植物，已被國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)收納為藥食同源類中藥。葛根中的主要活性成分是葛根素、大豆苷、大豆苷元、染料木苷等黃酮類成分，具有預(yù)防癌癥、抗糖尿病、抗菌和抗氧化等生物活性［1-3］。已有研究表明，黃酮是一種很強(qiáng)的抗氧化劑，能有效清除體內(nèi)自由基和促進(jìn)體內(nèi)血液循環(huán)；黃酮類物質(zhì)是植物源中的抑菌劑，與抗生素有良好的協(xié)同作用［4-6］。從中草藥中提取有效的天然抗氧化劑和抑菌劑是一個(gè)研究熱點(diǎn)，而采用紫外分光光度法和高效液相色譜法聯(lián)合分析葛根中黃酮活性成分鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究采用響應(yīng)面法優(yōu)化葛根總黃酮提取工藝，分析葛根黃酮組分及含量，探討其對(duì)人體的常見(jiàn)致病菌抑制作用和抗氧化活性表征，以期為葛根綜合評(píng)價(jià)及資源開(kāi)發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試材與試劑 葛根，購(gòu)自普寧市澤群中藥飲片有限公司（批號(hào)200902），經(jīng)湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院中藥材研究所張美德研究員鑒定為豆科植物葛的干燥根；3′-羥基葛根素（批號(hào)P28N8F49269，純度≥96%）、葛根素（批號(hào)S02M98B54875，純度≥98%）、3′-甲氧基葛根素（批號(hào)P07N9F73425，純度≥98%）、葛根素-6″-O-木糖苷（批號(hào)P14D9S77617，純度≥98%）、葛根素芹菜糖苷（批號(hào)P09J7F8770，純度≥98%）、刺芒柄花苷（批號(hào)018GB164369，純度≥98%）對(duì)照品，購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；大豆苷（批號(hào)111738-201904，純度為93.4%）、大豆苷元（批號(hào)11502-202003，純度為99.3%）、染料木苷（批號(hào)111709-201702，純度為99.9%）對(duì)照品，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；無(wú)水乙醇、色譜甲醇、過(guò)硫酸鉀，購(gòu)自沃凱國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；水為去離子水、娃哈哈純凈水，購(gòu)自周邊超市；1，1-二苯基-2苦基肼自由基（批號(hào)：JZ5ZI-KS，純度＞97.0%），購(gòu)自梯希愛(ài)（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；2，2′-聯(lián)氨-雙（3-己基苯并噻唑-6-磺酸）二胺鹽（批號(hào)C12467437，純度為98%）、L-抗壞血酸（批號(hào)C12578987，純度＞99.0%）、磷酸緩沖液（批號(hào)C2209133，0.1 mol/L，pH 6.6）、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵，均購(gòu)自上海麥克林生化有限公司。11株供試菌，如表1所示，由中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所中國(guó)科學(xué)院熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室鑒定。

1.1.2 儀器 Agilent 1260型高效液相色譜儀，配DAD檢測(cè)器和反相色譜柱120 HC-C18（4.6 mm×250 mm），美國(guó)安捷倫公司；UV18000型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本島津公司；BC-W208型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海貝凱生物化工設(shè)備有限公司；ZDHW型電熱套，鞏義市予華儀器有限公司；FA2204C型電子分析天平（S/N：0280736761），上海天美天平儀器有限公司；HH-S型恒溫水浴鍋，金壇市恒豐儀器制造有限公司；漩渦混勻儀，上海滬析實(shí)業(yè)有限公司；Neofuge 15型高速離心機(jī)，力新儀器上海有限公司；Infinite M200 PRO型多功能酶標(biāo)儀，瑞士Tecan公司。

1.2 方法

1.2.1 葛根總黃酮的提取 稱取20 g葛根飲片，按照一定的料液比加入去離子水浸泡30 min，按一定的提取時(shí)間和提取次數(shù)于100 ℃進(jìn)行回流提取，隨后將提取液多次抽濾，濾液合并后于75 ℃減壓濃縮，濃縮液用去離子水定容至250 mL，得葛根提取液。

1.2.2 葛根總黃酮含量的測(cè)定 精密稱取2.50 mg葛根素標(biāo)準(zhǔn)品溶于去離子水中制成0.25 mg/mL母液，稀釋成濃度梯度為0、0.002 5、0.003 7、0.004 9、0.006 1、0.007 4、0.008 6、0.009 8 mg/mL。分別在波長(zhǎng)250 nm處測(cè)定吸光度，再以濃度（X）為橫坐標(biāo)、吸光度（Y）為縱坐標(biāo)繪制葛根素標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y=82.332X-0.005，R2=0.999 7，方程在葛根素標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0～0.009 8 mg/mL時(shí)吸光度與葛根素質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系。精確量取0.5 mL濃縮液于50 mL容量瓶中，以去離子水定容，在波長(zhǎng)250 nm處測(cè)定其吸光度，重復(fù)3次，計(jì)算其總黃酮得率［7，8］。公式如下。

總黃酮得率=[c×n×Vm×100%] ? ? ?（1）

式中，c為葛根總黃酮檢測(cè)濃度（mg/mL）；n為葛根提取液稀釋倍數(shù)；V為葛根提取液定容總體積（mL）；m為葛根的質(zhì)量（g）。

1.2.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì) 研究料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)對(duì)總黃酮提取率的影響，稱取20 g葛根，浸泡30 min，其他提取條件保持一致：①設(shè)置5個(gè)梯度的料液比（g∶mL）1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25，提取時(shí)間80 min，提取次數(shù)3次；②設(shè)置5個(gè)梯度的提取時(shí)間20、40、60、80、100 min，料液比（g∶mL）1∶15，提取次數(shù)3次；③設(shè)置5個(gè)梯度的提取次數(shù)1、2、3、4、5次，料液比（g∶mL）1∶15，提取時(shí)間80 min；考察各因素對(duì)葛根總黃酮得率的影響。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以料液比（A）、提取時(shí)間（B）、提取次數(shù)（C）為自變量，總黃酮得率為響應(yīng)值，選取單因素試驗(yàn)中各自變量表現(xiàn)較好的3個(gè)水平，利用Design-Expert 8.0.6響應(yīng)面軟件，以Box-Behnken原理設(shè)計(jì)三因素三水平試驗(yàn)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素與水平編碼如表2所示［9，10］。

1.2.5 葛根黃酮的HPLC定量分析 采用高效液相色譜（HPLC）外標(biāo)法［11］，測(cè)定響應(yīng)面優(yōu)化后的工藝條件所制備的葛根中黃酮類化合物的組成及其含量。色譜條件：流動(dòng)相A為85%甲醇溶液、15%水；流動(dòng)相B為85%水、15%甲醇溶液。洗脫程序：0～15.00 min，流動(dòng)相A 15%、流動(dòng)相B 85%；15.01～60.00 min，流動(dòng)相A 40%、流動(dòng)相B 60%；60.01～75.00 min，流動(dòng)相A 60%、流動(dòng)相B 40%；75.00～75.01 min，流動(dòng)相A 15%、流動(dòng)相B 85%。檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm；流速為1.0 mL/min；柱溫為25 ℃；進(jìn)樣量為10 μL。

將3′-羥基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素-6″-O-木糖苷、大豆苷、葛根素芹菜糖苷、染料木苷、刺芒柄花苷、大豆苷元共9個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品，分別加入30%乙醇溶液制成濃度為0.97、0.98、0.79、0.99、0.30、1.05、0.41、0.47、0.42、0.99、0.42 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液；分別精密吸取各標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液適量，用30%乙醇溶液定容至10 mL得混合標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液；混合標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液采用二倍稀釋法，制成不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液以繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取適量葛根提取物稀釋一定倍數(shù)，0.45 μm濾膜過(guò)濾后按色譜條件進(jìn)樣，進(jìn)行重復(fù)性、精密度、穩(wěn)定性及加標(biāo)回收試驗(yàn)，計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），黃酮組分得率計(jì)算公式如下。

黃酮組分得率=[c×n×Vm×1 000×100%] ? （2）

式中，[c]為HPLC檢測(cè)濃度（mg/mL）；[n]為葛根提取液稀釋倍數(shù)；[V]為葛根提取液定容體積（mL）；[m]為葛根質(zhì)量（g）；1 000為換算系數(shù)。

計(jì)算葛根提取液中上述9種常見(jiàn)黃酮成分在葛根總黃酮中的占比，計(jì)算公式如下。

黃酮組分占比=[黃酮組分得率總黃酮得率×100%] （3）

1.2.6 葛根總黃酮的抑菌活性測(cè)定 采用瓊脂擴(kuò)散法［12］，測(cè)試葛根總黃酮對(duì)11個(gè)供試菌的抑菌活性。取優(yōu)化后工藝制備的葛根提取液適量，減壓濃縮后，在70 ℃條件下真空干燥，制成干燥的葛根總黃酮提取物。將適量干浸膏溶于無(wú)菌水中制成1 000 mg/mL的供試液。將供試菌活化，于37 ℃培養(yǎng)，使其OD600 nm達(dá)0.6；分別取該供試菌液20 μL與20 mL LB培養(yǎng)基混勻，倒入無(wú)菌平板，待其冷卻后將8 mm無(wú)菌濾紙片貼于其上，隨后吸取10 μL葛根供試液滴加至濾紙片上，同時(shí)滴加25 mg/mL的卡那霉素作為陽(yáng)性對(duì)照，無(wú)菌水作為陰性對(duì)照，于37 ℃培養(yǎng)12 h，試驗(yàn)重復(fù)3次。測(cè)量其抑菌圈直徑，高度抑制>20 mm、中度抑制10～20 mm、輕度抑制<10 mm。采用二倍稀釋法［13］，進(jìn)一步測(cè)定對(duì)葛根供試液敏感度較高組的最小抑菌濃度（MIC）。LB培養(yǎng)基配制：每升LB培養(yǎng)基含5 g酵母提取物、10 g胰蛋白胨、10 g氯化鈉、20 g瓊脂，調(diào)pH至7.2～7.4。

1.2.7 葛根總黃酮的抗氧化活性測(cè)定

1）DPPH·清除能力。采用DPPH法［12］，并稍作修改，精密稱取適量1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）溶于適量無(wú)水乙醇制成的0.2 mmol/L DPPH-乙醇溶液中。分別取適量抗壞血酸和葛根總黃酮供試液（濃度分別為0.10、0.30、0.50、0.70、0.90、1.10 mg/mL）。向96孔板中加入100 μL 0.2 mmol/L DPPH-乙醇溶液與100 μL葛根總黃酮供試液，放入酶標(biāo)儀中振搖1 min，30 ℃避光反應(yīng)30 min后，于517 nm處讀取吸光度。以抗壞血酸作為陽(yáng)性對(duì)照，以去離子水和無(wú)水乙醇作為空白對(duì)照。計(jì)算DPPH自由基清除率與IC50（半抑制濃度）。公式如下。

DPPH清除率=[A2-A0+A1A2×100%] ? ?（4）

式中，A1為葛根總黃酮供試液與無(wú)水乙醇吸光度；A2為DPPH-乙醇溶液與去離子水吸光度；A0為DPPH-乙醇溶液與葛根總黃酮供試液吸光度。

2）ABTS+·清除能力。參照劉雨詩(shī)等［14］的方法，稍作修改，取2.45 mmol/L過(guò)硫酸鉀溶液與7 mmol/L ABTS儲(chǔ)備液等體積混合，于37 ℃避光、靜置過(guò)夜，制備ABTS儲(chǔ)備液，使用時(shí)用無(wú)水乙醇將ABTS儲(chǔ)備液稀釋，置于734 nm波長(zhǎng)處，吸光度為0.70±0.02，得ABTS工作液。在96孔板中加入150 μL ABTS工作液與30 μL抗壞血酸和葛根總黃酮供試液（濃度分別為0.10、0.30、0.50、0.70、0.90、1.10 mg/mL），放入酶標(biāo)儀中振搖1 min，于30 ℃避光反應(yīng)6 min后，于734 nm處讀取吸光度。以抗壞血酸作為陽(yáng)性對(duì)照，以去離子水作為空白對(duì)照。計(jì)算ABTS陽(yáng)離子自由基清除率與IC50。公式如下。

ABTS+·清除率=[A2-A0+A1A2×100%] （5）

式中，A1為葛根總黃酮供試液與去離子水吸光度；A2為ABTS工作液與去離子水吸光度；A0為ABTS工作液與葛根總黃酮供試液吸光度。

3）總還原能力。采用微量法［15］，在試管中依次加入磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L，pH=6.6），抗壞血酸和葛根總黃酮供試液（濃度分別為0.10、0.30、0.50、0.70、0.90、1.10 mg/mL），1% 鐵氰化鉀各500 μL，混勻后置于50 ℃水浴中反應(yīng)20 min，冷卻至室溫，加入10%三氯乙酸500 μL，混勻后3 000 r/min離心 ? 10 min，吸取上清液1 mL，加入1 mL去離子水和100 μL 0.1% 三氯化鐵溶液充分混勻，30 ℃避光 ? 30 min后，向96孔板中加入200 μL混合樣液，放入酶標(biāo)儀后，于700 nm處讀取吸光度。以抗壞血酸作為陽(yáng)性對(duì)照，以去離子水作為空白對(duì)照。吸光度差值（[ΔA]）越大，表示總還原能力越強(qiáng)。公式如下。

[ΔA=A-A0] ? ?（6）

式中，A為磷酸緩沖液、葛根總黃酮供試液、鐵氰化鉀溶液、三氯乙酸、去離子水和三氯化鐵吸光度；[A0]為磷酸緩沖液、鐵氰化鉀溶液、三氯乙酸、去離子水和三氯化鐵吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)使用Origin 9.0軟件進(jìn)行分析作圖，采用Design-Expert 8.0.6進(jìn)行響應(yīng)面分析，數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示，0.01

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 料液比對(duì)葛根總黃酮得率的影響 如圖1所示，隨著溶劑體積的增加，總黃酮得率升高，當(dāng)料液比（g∶mL）達(dá)1∶15時(shí)，總黃酮得率最大，為7.03%；當(dāng)繼續(xù)增大溶劑體積時(shí)，總黃酮提取率在7.00%左右小幅波動(dòng)，不再增加。

2.1.2 提取時(shí)間對(duì)葛根總黃酮得率的影響 如圖2所示，隨著提取時(shí)間的增加，總黃酮得率逐漸升高，在提取時(shí)間80 min時(shí)達(dá)到最大值，為7.38%。當(dāng)提取時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)，總黃酮得率開(kāi)始下降，這可能是因?yàn)殡S著時(shí)間的延長(zhǎng)，黃酮類化合物不斷溶出到提取液中，總黃酮得率也就逐漸增加。同時(shí)，在提取的過(guò)程中也可能會(huì)發(fā)生黃酮類化合物的氧化、持續(xù)高溫導(dǎo)致的結(jié)構(gòu)破壞等，當(dāng)提取時(shí)間進(jìn)一步增加，隨著黃酮類化合物氧化和破壞的積累，導(dǎo)致其得率下降。

2.1.3 提取次數(shù)對(duì)葛根總黃酮得率的影響 如圖3所示，在1～3次內(nèi)，總黃酮得率與提取次數(shù)呈正相關(guān)，浸提次數(shù)為3次時(shí)，總黃酮得率達(dá)到最大值，為7.34%，之后隨著提取次數(shù)的增加，總黃酮得率開(kāi)始下降。這可能是因?yàn)楫?dāng)提取次數(shù)少時(shí)，黃酮提取不充分，多次提取合并后得率上升，當(dāng)提取至3次時(shí)黃酮類物質(zhì)提取比較充分。提取次數(shù)過(guò)多使?jié)饪s體積大幅增加，導(dǎo)致提取液受熱時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，可能造成黃酮類物質(zhì)的損失，降低了總黃酮得率；同時(shí)，還會(huì)帶來(lái)整體工藝時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、能耗增加、溶劑用量增大等系列問(wèn)題，因此，提取次數(shù)以3次為宜。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)與結(jié)果 以料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)為因素，總黃酮得率為響應(yīng)值，利用Box-Behnken原理設(shè)計(jì)了三因素三水平共17組試驗(yàn)，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果如表3所示。通過(guò)對(duì)其進(jìn)行回歸分析，得到3個(gè)因素與總黃酮得率之間的二次回歸方程：Y= 7.30 + 0.57A - 0.50B - 0.09C + 0.52AB + 0.42AC - 0.58BC - 0.72A2 - 0.43B2 - 0.95C2。

2.2.2 回歸模型的建立與分析 對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表4所示，模型F為163.68，差異極顯著，失擬項(xiàng)F為2.15，差異不顯著，且模型R2為0.995 3，R2adj為0.989 2，說(shuō)明模型可靠，能夠很好地對(duì)總黃酮得率進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。由F可知，A、B、AB、AC、BC、A2、B2、C2對(duì)葛根總黃酮得率的影響極顯著（P<0.01），C對(duì)總黃酮得率的影響顯著P<0.05）。

響應(yīng)面陡峭表明該因素對(duì)總黃酮得率的影響較強(qiáng)，曲面平緩表明影響較弱；等高線的形狀可反映各因素間交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，趨于橢圓形表明兩因素的交互作用顯著，而圓形表明不顯著。由圖4可知，比較響應(yīng)面的陡峭程度，料液比和提取時(shí)間均大于提取次數(shù)，表明各因素對(duì)總黃酮得率影響大小順序?yàn)榱弦罕?提取時(shí)間＞提取次數(shù)；比較3個(gè)因素交互作用的等高線，料液比與提取時(shí)間、料液比與提取次數(shù)交互作用的等高線均呈橢圓形，且排列越密集，交互作用越顯著，其響應(yīng)面曲線較陡，對(duì)葛根總黃酮得率影響均極顯著。

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 通過(guò)響應(yīng)面分析，得出料液比（g∶mL）1∶16.25，提取時(shí)間69.04 min，提取次數(shù)3.18次為最佳工藝參數(shù)，由此預(yù)測(cè)總黃酮得率為7.502%。在試驗(yàn)過(guò)程中，工藝參數(shù)取整后調(diào)整為料液比（g∶mL）1∶16，提取時(shí)間69 min，提取次數(shù)3次。通過(guò)試驗(yàn)驗(yàn)證，調(diào)整后工藝所得總黃酮得率為7.690%，與預(yù)測(cè)值對(duì)比，RSD＜5%，相對(duì)誤差較小，說(shuō)明模型預(yù)測(cè)能力良好，預(yù)測(cè)結(jié)果可信度高。

2.3 葛根黃酮的HPLC定量分析

結(jié)果表明，從葛根總黃酮中共檢出9個(gè)黃酮類成分，按出峰時(shí)間依次為3′-羥基葛根素（1）、葛根素（2）、3′-甲氧基葛根素（3）、葛根素-6″-O-木糖苷（4）、大豆苷（5）、葛根素芹菜糖苷（6）、染料木苷（7）、刺芒柄花苷（8）、大豆苷元（9），色譜圖如圖5所示，標(biāo)準(zhǔn)品的線性關(guān)系如表5所示。

由表5可知，10個(gè)黃酮標(biāo)準(zhǔn)品濃度與峰面積在0.000 3～0.235 9 mg/mL時(shí)線性關(guān)系良好（R2為0.990 9～0.999 9），樣品檢測(cè)重復(fù)性、精密度以及穩(wěn)定性均良好，適用于黃酮的檢測(cè)。黃酮組分檢測(cè)結(jié)果如表6所示，葛根總黃酮提取物中3′-羥基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素-6″-O-木糖苷、大豆苷、葛根素芹菜糖苷、染料木苷、刺芒柄花苷和大豆苷元共9個(gè)黃酮成分的提取率，分別為0.50%±0.01%、3.31%±0.36%、0.77%±0.03%、0.21%±0.02%、0.42%±0.07%、1.68%±0.20%、0.07%±0.03%、0.03%±0.01%、0.08%±0.02%，其總和占提取物中總黃酮的91.98%，其平均回收率為97.39%～101.81%，RSD為1.60%～4.16%。

2.4 葛根總黃酮的抑菌試驗(yàn)結(jié)果與分析

葛根總黃酮的抑菌結(jié)果如表7所示，其對(duì)11種供試菌有不同的抑制作用，其中對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌［（8.26±0.18） mm］、金黃色葡萄球菌［（8.63±0.12） mm］、枯草芽孢桿菌［（8.27±0.08） mm］、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌［（8.61±0.13） mm］、大腸桿菌［（8.14±0.06） mm］、多耐銅綠假單胞菌［（8.98±0.11） mm］6種菌有微弱的抑制作用；對(duì)糞鏈球菌［（10.38±0.10） mm］和蘇云金芽孢桿菌［（10.01±0.11） mm］有中度的抑制作用，對(duì)耐甲氧西林表皮葡萄球菌、藤黃微球菌以及肺炎克雷伯菌3種菌沒(méi)有抑制作用。進(jìn)一步測(cè)定葛根總黃酮對(duì)上述8種菌的MIC，結(jié)果表明，葛根總黃酮對(duì)大部分菌的抑制能力較弱，僅可測(cè)出對(duì)糞鏈球菌（250 mg/mL）、蘇云金芽孢桿菌（500 mg/mL）以及多耐銅綠假單胞菌（500 mg/mL）的MIC。

2.5 葛根總黃酮的體外抗氧化試驗(yàn)結(jié)果與分析

清除自由基能力是評(píng)價(jià)體外抗氧化活性的常用方法。如圖6所示，隨著葛根總黃酮濃度的增加，葛根中的活性成分含量均有不同程度的提高，但均低于相同質(zhì)量濃度的抗壞血酸。葛根總黃酮對(duì)DPPH·和ABTS+·自由基的線性回歸方程分別為Y1=72.43X1+21.14、Y2=71.43X2+36.49；IC50分別為0.398、0.189 mg/mL。如圖6a、圖6b所示，當(dāng)濃度為0.90 mg/mL時(shí)，葛根總黃酮的DPPH·、ABTS+·清除率最高，分別為82.38%和96.25%；如圖6c所示，在濃度為0.10～0.90 mg/mL時(shí)，葛根總黃酮和抗壞血酸的抗氧化能力具有較好的線性關(guān)系，其線性回歸方程為Y3=0.45X4+0.01，相關(guān)系數(shù)R2=0.96，當(dāng)濃度大于0.70 mg/mL時(shí)，總還原能力趨于平緩，呈一定的正相關(guān)，說(shuō)明葛根總黃酮具有較好的總還原能力。

3 討論

本研究采用響應(yīng)面法優(yōu)化了葛根的提取工藝，優(yōu)化后的工藝條件下總黃酮得率為7.690%，經(jīng)驗(yàn)證該提取工藝穩(wěn)定可行。并對(duì)提取物進(jìn)行了定性定量分析，研究結(jié)果顯示，葛根中的3′-羥基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素-6″-O-木糖苷、大豆苷、葛根素芹菜糖苷、染料木苷、刺芒柄花苷、大豆苷元的提取率分別為0.50%±0.01%、3.31%±0.36%、0.77%±0.03%、0.21%±0.02%、0.42%±0.07%、1.68%±0.20%、0.07%±0.03%、0.03%±0.01%、0.08%±0.02%，其總和占葛根總黃酮的91.98%。本研究與Zhao等［16］的研究結(jié)果一致，其采用熱水提?。℉ot water extraction）法從葛根中獲得葛根素、大豆苷、大豆苷元的得率分別為2.2%±0.06%、0.4%±0.03%、0.03%± 0.02%；楊青青等［17］也得到類似結(jié)果，葛根總黃酮的得率分別為2.11%和0.44%，都顯著低于本研究結(jié)果。本研究對(duì)葛根總黃酮提取物中黃酮類成分的定性定量分析，較為詳細(xì)地闡明了其中各黃酮成分的含量及其在總黃酮中所占的比例，增強(qiáng)了分析結(jié)果的代表性和整體性。

本研究探討了葛根總黃酮對(duì)11種供試菌的抑制作用。首次發(fā)現(xiàn)對(duì)糞鏈球菌（MIC=250 mg/mL）和蘇云金芽孢桿菌（MIC=500 mg/mL）有中度抑制作用。這與魏磊等［18］的研究結(jié)果類似，抑菌譜一致，但是抑菌濃度有差異，這可能是由不同的提取方法導(dǎo)致葛根中黃酮類化合物含量差異造成的。本研究還發(fā)現(xiàn)葛根總黃酮具有較好的抗氧化活性，在質(zhì)量濃度為0.70 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH·、ABTS+·具有一定的清除能力和總還原能力，與范琳等［19］報(bào)道的葛根水相萃取抗氧化的結(jié)果一致。

4 小結(jié)

通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化得到葛根提取工藝，并建立了與之匹配的提取物定性和定量檢測(cè)方法。優(yōu)化后的提取工藝合理、可行、高效，定性定量分析了葛根黃酮中的成分組成。此外，葛根總黃酮具有良好的抑菌、抗氧化活性，但本研究提取的葛根總黃酮僅是粗黃酮，存在著許多雜質(zhì)，有待進(jìn)一步純化分離，進(jìn)而加深對(duì)其體內(nèi)抑菌、抗氧化的研究。

參考文獻(xiàn)：

［1］ QI Q，ZHANG X Q，YAO L，et al. Pueratin improves diminished ovarian reserve by inhibiting apoptosis［J］. Experimental and therapeutic medicine，2021，22（6）：1-10.

［2］ NIU W，MIAO J，LI X，et al. Metabolomics combined with systematic pharmacology reveals the therapeutic effects of Salvia miltiorrhiza and Radix Pueraria lobata herb pair on type 2 diabetes rats［J］.Journal of functional foods，2022，89（1）：1423.

［3］ 陳麗紅，唐于平，王 強(qiáng).不同提取方法制備的葛根芩連配方顆粒抑菌藥效研究［J］.中成藥，2012，34（10）： 2016-2017.

［4］ 龐會(huì)娜，范 琳，肖鳳琴，等.指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量法對(duì)葛根抗氧化活性部位的藥效物質(zhì)篩選［J］.中國(guó)藥房，2021，32（7）：839-844.

［5］ 向志軍，趙廣榮，元英進(jìn)，等.復(fù)方丹參的體外抗氧化活性研究［J］.中草藥，2006（2）：211-213.

［6］ 胡清文.三種中藥材的化學(xué)成分及其生物活性研究［D］.濟(jì)南：山東大學(xué)，2018.

［7］ MIGUES V H，DAVID J M，GOMES A F，et al. Determination of soybean isoflavone by HPLC/DAD and simple UV spectroscopic analysis： A comparative study［J］.Food analytical methods，2022， 15（2）：367-376.

［8］ 張 晉，陳 楊，曹颯麗，等.水煎煮法提取葛根總黃酮的動(dòng)力學(xué)模型適用性研究［J］.中國(guó)中藥雜志，2013， 38（17）：2788-2792.

［9］ WOUMBO C Y，KUATE D，KLANG M J，et al. Valorization of glycine max （soybean） seed waste： Optimization of the microwave-assisted extraction （MAE） and characterization of polyphenols from soybean meal using response surface methodology （RSM）［J］.Journal of chemistry，2021（11）：1-12.

［10］ BUCKOW R，KASTELL A，TEREFE N S，et al. Pressure and temperature effects on degradation kinetics and storage stability of total anthocyanins in blueberry juice［J］.Journal of agricultural and food chemistry，2010， 58（18）：10076-10084.

［11］ 王 萍，王宇鶴，辛愛(ài)潔，等.Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化粉葛配方顆粒提取工藝［J］.中成藥，2017，39（6）： 1293-1296.

［12］ KATHURIA D，DHIMAN A K，SUREKHA A. Effect of different extraction techniques and drying conditions for the assay of isoflavone from Harit soya seeds［J］.Journal of food processing and preservation，2021，46（1）：e16107.

［13］ 袁名遠(yuǎn)，劉 玉，黃東海，等.響應(yīng)面優(yōu)化復(fù)合藤茶固體飲料研究［J］.食品科技，2021，46（8）：96-103.

［14］ 劉雨詩(shī)，劉娟汝，張存艷，等.微波萃取葛根總黃酮工藝及其抗氧化活性研究［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2020，31（1）： 68-72.

［15］ SUN Y，YANG B，WU Y，et al. Structural characterization and antioxidant activities of κ-carrageenan oligosaccharides degraded by different methods［J］.Food chemistry，2015（1），178：311-318.

［16］ ZHAO T，LUO Y，ZHANG X，et al. Subcritical water extraction of bioactive compounds from Radix Puerariae and optimization study using response surface methodology［J］.Chemical engineering communications，2019， 206（9）：1-11.

［17］ 楊青青，龔吉軍.響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助葛根浸提工藝及浸提液抗氧化活性研究［J］.食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2021，12（13）：5409-5417.

［18］ 魏 磊，王 偉，侯玥瑩，等.葛葉總黃酮的提取工藝優(yōu)化及抗菌抗氧化能力研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2021， 49（14）：152-156，161.

［19］ 范 琳，王 苗，馬馨桐，等.葛根抗氧化活性有效部位的篩選研究［J］.食品研究與開(kāi)發(fā)，2021，42（6）： 119-123.