孟思雨 , 張卓?jī)| , 伍 勇 , 孫志良 , 劉兆穎

(1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 , 湖南 長(zhǎng)沙 410128 ; 2 湖南省獸藥工程技術(shù)研究中心 , 湖南 長(zhǎng)沙 410128)

鉤吻是馬錢科鉤吻屬藤木植物?！稄V東中獸醫(yī)常用草藥》記載:“鉤吻,常定期對(duì)豬羊服本藥,可以健胃、殺蟲、催肥”。目前,在獸醫(yī)臨床中,鉤吻具有多重作用,包括殺蟲、鎮(zhèn)靜、增強(qiáng)免疫力和促動(dòng)物生長(zhǎng)等廣泛藥理活性[1-3]。據(jù)報(bào)道,鉤吻飼喂能夠增加育肥豬的日增重、降低料重比,進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)其能使腸黏膜的形態(tài)和盲腸的菌群發(fā)生變化[4]。研究表明,將適量的鉤吻干粉添加到肉雞的基礎(chǔ)日料中,不僅可發(fā)現(xiàn)肉雞的體重明顯增加,還能觀察到肉雞的免疫器官指標(biāo)明顯提高,表明鉤吻對(duì)肉雞的免疫機(jī)能有顯著的促進(jìn)作用[5]。研究表明,鉤吻中主要生物堿鉤吻素己和鉤吻素甲具有抗焦慮、抗炎和鎮(zhèn)痛等藥理活性[6-9]。雖然中藥具有低毒和低殘留優(yōu)點(diǎn),但動(dòng)物長(zhǎng)期服用仍有可能會(huì)對(duì)肝臟中的藥物代謝酶造成不利影響,導(dǎo)致藥物之間發(fā)生相互作用,甚至產(chǎn)生副作用,從而影響藥品的安全性和穩(wěn)定性。目前,國(guó)內(nèi)外研究已發(fā)現(xiàn),中藥對(duì)機(jī)體藥物代謝酶存在影響,例如,五味子、葛根總黃酮和槲皮素對(duì)細(xì)胞色素P450(Cytochrome P450,CYP450)家族中CYP3A、CYP1A2和CYP2A6活性具有一定的抑制作用,進(jìn)而影響其他藥物代謝[10-13]。因此,深入研究鉤吻是否同樣對(duì)藥物代謝酶產(chǎn)生影響,對(duì)指導(dǎo)鉤吻的臨床應(yīng)用具有重要意義。

CYP450是體內(nèi)重要的藥物代謝酶,其參與機(jī)體約70%以上的藥物代謝[14]。動(dòng)物試驗(yàn)表明,CYP2A6可能參與鉤吻素子在豬和大鼠肝微粒體內(nèi)的代謝,并存在種屬差異[15]。本實(shí)驗(yàn)室前期采用3種不同的鉤吻提取物(鉤吻醇提取物、酸水提取物和水提取物)對(duì)人肝癌細(xì)胞(HepG2)進(jìn)行處理,結(jié)果發(fā)現(xiàn),3種鉤吻提取物均能使HepG2細(xì)胞凋亡和活性氧(Reactive oxygen species,ROS)含量上升,而添加肝組織勻漿上清液后,HepG2細(xì)胞凋亡和ROS含量升高的速度明顯下降,表明CYP450參與了鉤吻在體內(nèi)的代謝[16]。紅霉素-N-脫甲基酶(ErythromycinN-demethylase,ERND)在體內(nèi)的代謝主要由CYP3A介導(dǎo),氨基比林-N-脫甲基酶(Aminopyrine-N-demethylase,AND)在體內(nèi)的代謝主要由CYP2E1介導(dǎo)[17,18]。醌氧化還原酶[NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1,NQO1]能夠發(fā)生雙電子還原反應(yīng)將醌還原為氫醌,從而減低醌對(duì)細(xì)胞的損傷[19]。研究表明,NQO1在一定程度上可以通過(guò)抑制馬兜鈴酸I(Aristolochic acids I,AAI)[20]和血根堿類(Sanguinarine,SANG)物質(zhì)的還原反應(yīng)[21],從而減少其對(duì)人體的毒性,NQO被認(rèn)為是外源性物質(zhì)或氧化劑等應(yīng)激源誘導(dǎo)的關(guān)鍵解毒酶之一[22]。但是,尚未見(jiàn)探究鉤吻對(duì)豬細(xì)胞色素P450和NQO1酶活性影響的研究報(bào)道。

因此,本試驗(yàn)將通過(guò)體內(nèi)試驗(yàn)探討鉤吻飼喂后對(duì)豬肝臟中AND、ERND(可反映CYP3A、CYP2E1的酶活性)和NQO1活性的影響,以期為鉤吻在臨床上的進(jìn)一步應(yīng)用提供藥理學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 2,6-二氯酚靛酚(2,6-Dichloroindophenol,DCPIP)和雙香豆素,均購(gòu)自天津美侖醫(yī)藥集團(tuán)有限公司;還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(Reduced nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate,NADPH),購(gòu)自Roche公司;BCA蛋白測(cè)定試劑盒,購(gòu)自湖南艾佳生物科技股份有限公司;紅霉素、氨基比林和甲醛,均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 主要儀器 CF16RXⅡ型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī),日立工機(jī)商業(yè)有限公司產(chǎn)品;HH·S/1-2-5數(shù)顯恒溫水浴鍋,上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品;INFINITE F50酶標(biāo)儀,Tecan 公司產(chǎn)品;AFX1-0501-P超純水儀,上海博欽環(huán)保科技公司產(chǎn)品;MDF-U2086S/216L超低溫冰箱,SANYO 公司產(chǎn)品;AY220電子天平,Shimadzu公司產(chǎn)品。

1.3 鉤吻醇提取物和鉤吻酸水提取物制備方法

1.3.1 鉤吻醇提取物 鉤吻醇提取物制備由泰谷生物科技有限公司完成(總生物堿含量為64.4 g/L),具體制備方法:將10 kg鉤吻放于提取罐中,隨后倒入80 L 95%乙醇溶液,混合提取1.5 h,200目濾網(wǎng)過(guò)濾后收集提取液,對(duì)藥渣進(jìn)行重提,合并提取液置于濃縮罐中,最后減壓干燥即為鉤吻醇提取物。

1.3.2 鉤吻酸水提取物 鉤吻酸水提取物由湖南加農(nóng)正和有限公司完成(總生物堿含量為21.5 g/L),具體制備方法:在體積為1 000 L的耐酸提取罐中加入0.5%硫酸水溶液800 L和鉤吻100 kg,攪拌提取24 h,200目濾網(wǎng)過(guò)濾后收集提取液,對(duì)藥渣進(jìn)行重提,合并提取液,使用NaOH(8 mol/L)溶液將提取液的pH調(diào)至7.0,置于濃縮罐中,最后減壓干燥即為鉤吻酸水提取物。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在湖南新五豐有限公司永安分公司進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn),選擇75頭56日齡的二元雜交仔豬,將其隨機(jī)分成5個(gè)組,詳細(xì)的分組情況見(jiàn)表1。在飼養(yǎng)47 d后,處死仔豬并采集肝臟,放進(jìn)-80 ℃冰箱留存。

表1 動(dòng)物試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Animal experimental design

1.4.2 肝微粒體和肝胞液制備 將肝臟組織室溫解凍、稱重并剪小塊,用蔗糖緩沖液進(jìn)行勻漿;勻漿后分裝并離心,4 ℃、10 000 g/min離心30 min;每毫升上清中添加0.1 mL CaCl2(88 mmol/L)溶液,渦旋使其混合均勻,冰浴5 min,期間需輕輕攪拌數(shù)次,4 ℃、22 000 g/min離心15 min,所得上清即為肝胞液。棄去上清,沉淀中加入0.1 mol/L Tris(含0.15 mol/L KCl)洗滌1次,以消除雜質(zhì)和CaCl2,4 ℃、22 000 g/min離心15 min,棄去上清;將所得沉淀加入0.1 mol/L PBS溶液,混合均勻即得肝微粒體。

1.4.3 肝微粒體和肝胞液蛋白濃度測(cè)定 使用BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度,具體操作步驟參考試劑盒的使用說(shuō)明書。每個(gè)濃度進(jìn)行3次重復(fù),取平均值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線:y軸為光密度(Optical density,OD)數(shù)值,x軸為牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)濃度,得到回歸方程和相關(guān)系數(shù)(r)。將肝微粒體和肝胞液分別稀釋10和100倍,每孔加入20 μL稀釋后的肝微粒體懸液和肝胞液。所得OD值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程,求得肝微粒體和肝胞液的蛋白濃度。

1.4.4 AND活性測(cè)定 參照參考文獻(xiàn)[23]對(duì)AND活性測(cè)定方法進(jìn)行優(yōu)化。

1.4.4.1 甲醛標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 制備1 mmol/L甲醛(HCHO)工作液,將工作液稀釋至濃度為0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.3和0.4 mmol/L。取各梯度濃度溶液0.5 mL,加入12.5%三氯乙酸溶液0.75 mL使反應(yīng)結(jié)束,7 000 r/min離心10 min;取0.25 mL上清液加入Nash試劑0.25 mL,60 ℃水浴10 min,冷卻后用酶標(biāo)儀于405 nm處測(cè)定OD值。每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,其中縱坐標(biāo)為OD405 nm,橫坐標(biāo)為HCHO溶液濃度,得到回歸方程和相關(guān)系數(shù)(r)。

1.4.4.2 AND活性測(cè)定 離心管中加入肝微粒體蛋白混合液0.4 mg,再依次加入PBS溶液(100 mmol/L)0.25 mL、氨基比林溶液(24 mg/mL)0.05 mL和不同濃度的待測(cè)化合物溶液0.005 mL,37 ℃水浴3 min,加入NADPH(5 mmol/L)0.05 mL,加超純水定容至0.5 mL,使各離心管中化合物濃度分別為0、1.0、2.5、5.0和10 μg/mL,每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù),37 ℃水浴20 min,加入12.5%三氯乙酸溶液0.75 mL使反應(yīng)結(jié)束,渦旋3 min,按照HCHO標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制步驟進(jìn)行剩余操作。AND活性可以通過(guò)測(cè)量每毫克蛋白每分鐘內(nèi)產(chǎn)生HCHO的數(shù)量來(lái)反應(yīng),酶活性單位是nmol/(min·mg)。

1.4.5 ERND活性測(cè)定 同1.4.4,不同點(diǎn)是將反應(yīng)底物替換為0.4 mmol/L紅霉素。

1.4.6 NQO1活性測(cè)定 參照參考文獻(xiàn)[24]進(jìn)行測(cè)定。96孔板每孔加入10 μL不同濃度的豬肝胞液;再向各孔中加入200 μL反應(yīng)液,包括Tris-HCl(50 mmol/L)、DCPIP(40 μmol/L)、NADPH(50 mmol/L)和雙香豆素(濃度為40 μmol/L)?？瞻卓资请p香豆素替換為等量超純水,其余不變。然后向各孔中添加抑制劑,25 ℃孵育5 min,再向各孔加入DCPIP,25 ℃反應(yīng)3 min,在620 nm處測(cè)定OD值。按公式(1)計(jì)算酶活性。

(1)

式中ΔOD620 nm為吸光值差值,ε為21 mM-1cm-1。

NQO1活性可以通過(guò)測(cè)量每毫克蛋白每分鐘內(nèi)還原DCPIP的數(shù)量來(lái)反映,酶活性單位是nmol/(min·mg)。

1.5 數(shù)據(jù)分析 試驗(yàn)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(MEAN±SD)”方式表示。采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,使用t檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 鉤吻提取物對(duì)肝微粒體AND活性的影響 如圖1A所示,與T1組相比,T2組AND活性無(wú)顯著影響(P>0.05),而T3組和T4組AND活性極顯著提高(P<0.01),T5組AND活性無(wú)顯著影響(P>0.05)。

圖1 鉤吻提取物對(duì)豬肝微粒體AND(A)和ERND(B)活性的影響Fig.1 Effects of Gelsemium elegans extracts on AND(A) And ERND(B) activities of liver microsome in pigs與T1組比較,*:P<0.05,**:P<0.01; 下同Compared with the T1 group,*:P<0.05,**:P<0.01. The same as below

2.2 鉤吻提取物對(duì)肝微粒體ERND活性的影響 如圖1B所示,與T1組相比,T2組ERND活性無(wú)顯著影響(P>0.05),而T3組ENND活性具有顯著性影響(P<0.05),T4組和T5組ENND活性具有極顯著性影響(P<0.01)。

2.3 鉤吻提取物對(duì)肝胞液NQO1活性的影響 如圖2所示,與T1組相比,T2組、T3組、T4組和T5組NQO1活性的抑制程度均具有極顯著性差異(P<0.01),其中,T3組、T4組和T5組NQO1活性依次降低至12.04、6.07和3.15 nmol/(min·mg),提示鉤吻對(duì)NQO1活性的影響呈濃度依賴性,在T5組濃度下,抑制作用最強(qiáng)。

圖2 鉤吻提取物對(duì)豬肝胞液NQO1活性的影響Fig.2 Effects of Gelsemium elegans extracts on NQO1 activity of liver cytosol in pigs

3 討論

鉤吻曾在民間廣泛用作促畜禽生長(zhǎng)的飼料添加劑。研究表明,將2%鉤吻粉末添加至仔豬的基礎(chǔ)日糧中,可以促進(jìn)仔豬的生長(zhǎng),實(shí)驗(yàn)組仔豬增重高于空白對(duì)照組;轉(zhuǎn)錄組結(jié)果顯示,鉤吻可以上調(diào)仔豬血液中甘氨酸(Glycine,Gly)和N-乙酰半胱氨酸(N-Acetylcysteine,NAC)水平,影響炎癥和免疫通路,發(fā)揮抗炎作用,并可改善腸道微生物環(huán)境,進(jìn)一步提升動(dòng)物的生長(zhǎng)性能[25]。目前,藥物與代謝酶之間相互作用的研究主要有體外試驗(yàn)和體內(nèi)試驗(yàn)2種。胡燕嫻基于體外試驗(yàn)初步闡明,CYP450參與了鉤吻生物堿在不同種屬動(dòng)物肝微粒體中的代謝[26]。魏文增[27]則更深入地闡明了CYP3A在鉤吻素子體外代謝過(guò)程中的關(guān)鍵作用。楊櫻[28]研究表明,經(jīng)鉤吻根總生物堿誘導(dǎo)的小鼠肝微粒體內(nèi)的CYP2A6活性較正常小鼠有明顯升高;同時(shí)與正常小鼠對(duì)比,豬、羊肝微粒體中CYP2A6酶活性也明顯提高,由此推測(cè)CYP2A6可能是參與鉤吻代謝的重要代謝酶之一。與體外試驗(yàn)相比,體內(nèi)試驗(yàn)可更真實(shí)和客觀的反映藥物對(duì)肝藥酶的影響。目前尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道鉤吻提取物對(duì)動(dòng)物體內(nèi)藥物代謝酶活性的影響,本試驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)鉤吻提取物對(duì)仔豬肝微粒體活性的影響,證明CYP2E1和CYP3A參與了鉤吻在豬體內(nèi)的代謝,表明長(zhǎng)期飼喂鉤吻會(huì)影響豬體內(nèi)藥物代謝酶活性,產(chǎn)生藥物間相互作用,為毒理學(xué)和安全用藥提供參考依據(jù)。

本試驗(yàn)采用鉤吻醇提取物和鉤吻酸水提取物,比較不同溶劑提取的鉤吻總生物堿對(duì)豬肝藥酶活性的影響,結(jié)果顯示,鉤吻醇提取物對(duì)CYP450酶活性有一定的影響,而鉤吻酸水提取物則沒(méi)有影響。本實(shí)驗(yàn)室鉤吻選用乙醇、硫酸、水作為溶劑進(jìn)行提取,提取物根據(jù)生物堿的含量排序?yàn)?醇提取物(64.4 g/L)>酸水提取物(21.5 g/L)>水提取物(5.7 g/L)[29]。因此,鉤吻醇提取物對(duì)AND和ERND活性的影響大于鉤吻酸水提取物的原因可能是生物堿含量的差異造成的。這種情況或許與鉤吻提取物中的成分相關(guān),由于提取步驟和試劑的不同,造成提取物的成分有明顯差異,從而影響酶活性[30,31]。

NQO1是Ⅱ相解毒酶,在體內(nèi)的代謝過(guò)程中扮演著至關(guān)重要的角色[32],與CYP450酶系統(tǒng)共同組成了復(fù)雜的生物學(xué)網(wǎng)絡(luò),為生命活動(dòng)提供了強(qiáng)大支持[33]。研究表明,NQO1參與了SANG還原成二氫血根堿(Dihydrosanguinarine,DHSA)的過(guò)程,顯著降低大鼠肝細(xì)胞(Buffalo rat liver,BRL)毒性,表明NQO1對(duì)機(jī)體具有保護(hù)作用[21]。陳敏等[20]研究NQO1對(duì)AAI體內(nèi)還原代謝和腎毒性的影響,揭示NQO1參與體內(nèi)AAI的還原代謝并在AAI腎毒性中發(fā)揮重要作用。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,2種鉤吻提取物都能夠顯著抑制NQO1酶的活性。因此,推測(cè)鉤吻可抑制豬體內(nèi)NQO1參與的代謝,與依賴于NQO1代謝的藥物合用時(shí),應(yīng)注意用藥的合理性和安全性。值得注意的是,鉤吻對(duì)NQO1活性的抑制機(jī)制尚需深入研究。