邢倩倩

(1.乳業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心,光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院,上海 200436;2.食品營(yíng)養(yǎng)與安全協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 無(wú)錫 214122)

隨著食品工業(yè)的發(fā)展,對(duì)現(xiàn)代分析技術(shù)提出了更高要求,需表征盡可能多的食品組成成分和使檢測(cè)的微量食品組分達(dá)到更高的靈敏度,進(jìn)而了解食品物質(zhì)組成基礎(chǔ)[1]。近些年伴隨著分析化學(xué)的進(jìn)展,易操作的先進(jìn)儀器逐步出現(xiàn),傳統(tǒng)食品分析方法正在逐步被功能強(qiáng)大的分析技術(shù)所取代,如多維色譜技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)在食品分析方面的廣泛應(yīng)用[2]。二維液相色譜在揭示食品復(fù)雜基質(zhì)組成、提供高分離能力和未知調(diào)味化合物識(shí)別方面具有明顯優(yōu)勢(shì)[3]。

1 二維液相色譜簡(jiǎn)介

1.1 原理

二維分離的理念由Giddings[4]提出,通過(guò)將兩個(gè)獨(dú)立的色譜分離過(guò)程組合到一起實(shí)現(xiàn),在該分離過(guò)程中樣品經(jīng)過(guò)兩次不同機(jī)理的分離過(guò)程,因此分離能力遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)一維分離。傳統(tǒng)的一維色譜在分離復(fù)雜樣品過(guò)程中會(huì)發(fā)生峰交叉、共流出和分離度不足等現(xiàn)象,說(shuō)明一維色譜存在峰容量不足的問(wèn)題。二維液相色譜對(duì)復(fù)雜樣品的分辨率遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)一維液相色譜,該分辨能力即峰容量。峰容量是指色譜體系中用最小分離度分得的最多峰個(gè)數(shù)的理論值[5]。二維液相色譜的理論峰容量為兩種分離模式峰容量的乘積。因此,建立二維液相色譜應(yīng)盡量選擇兩種不同的分離模式,保證正交性最大,即充分利用兩種分離模式的峰容量[6]。

在實(shí)際應(yīng)用中,二維液相色譜可通過(guò)組分由第一維到第二維的轉(zhuǎn)移方式分為離線、在線或流速停止模式[7]。在離線二維液相色譜模式中,首先手動(dòng)接出一維分離后的各個(gè)組分,處理后直接進(jìn)入第二維分離模式。在線二維液相色譜模式中,第一維和第二維通過(guò)接口或是調(diào)諧器連接,可自動(dòng)收集一維組分直接進(jìn)入第二維進(jìn)行分析[8—10]。流速停止二維液相色譜模式中,第一維流速停止開(kāi)始第二維分離過(guò)程,第二維完成后再重啟第一維分離模式,完成后再依次開(kāi)啟第二維分離模式。

1.2 分類

二維液相色譜包括中心切割二維色譜和全二維液相色譜。中心切割模式可應(yīng)用于對(duì)第一維色譜中某個(gè)特定組分進(jìn)行第二維分離的過(guò)程,全二維模式應(yīng)用于對(duì)于第一維色譜中所有組分進(jìn)行第二維分離的過(guò)程。在全二維分離模式中,必須保證第一維的組分無(wú)損傷地全部進(jìn)入第二維,即需要保證第一維的樣品收集率比較高。

1.3 特點(diǎn)

二維液相色譜系統(tǒng)在分離能力方面遠(yuǎn)強(qiáng)于傳統(tǒng)一維色譜,這也是其成功應(yīng)用于食品分析的最大優(yōu)點(diǎn)[11]。另外,二維液相色譜系統(tǒng)也可與質(zhì)譜串聯(lián)使用,提高分離效率和識(shí)別能力[12]?；诙S液相色譜具有諸多優(yōu)點(diǎn),近些年在食品方面應(yīng)用愈加廣泛。本文針對(duì)近些年二維液相色譜在食品分析方面的應(yīng)用展開(kāi)討論。

2 二維液相色譜在食品溯源和安全方面的應(yīng)用

食品中的風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)和危害物質(zhì)可由多種因素引入。食品污染物一方面來(lái)源于農(nóng)藥、殺蟲劑、環(huán)境污染物、抗生素以及為應(yīng)對(duì)食品需求增長(zhǎng)而使用的藥物等,另一方面則由食品攜帶或本身產(chǎn)生,如病原微生物污染、加工過(guò)程中生成的毒素和風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)等,以上所列物質(zhì)均對(duì)健康有害。因此,為了規(guī)范這些有害化合物的存在,需嚴(yán)格控制食品生產(chǎn)、加工和儲(chǔ)存過(guò)程中相關(guān)物質(zhì)的允許限量。

在食品風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)檢測(cè)方面,傳統(tǒng)分析技術(shù)所面臨的挑戰(zhàn)包括食品樣品中所含化合物種類多而復(fù)雜,目標(biāo)化合物含量范圍過(guò)寬以及基質(zhì)自帶的未知潛在毒性物質(zhì)等。因此,在傳統(tǒng)的食品分離分析中,需要經(jīng)過(guò)復(fù)雜費(fèi)時(shí)的前處理過(guò)程才能完成目標(biāo)化合物的檢測(cè)。在檢測(cè)食品中風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)方面,能夠克服傳統(tǒng)分析缺點(diǎn)的分析技術(shù)是重要的發(fā)展方向[13]。傳統(tǒng)分析方法在分析食品污染物時(shí)由于樣品前處理導(dǎo)致目標(biāo)化合物丟失或轉(zhuǎn)移從而降低準(zhǔn)確性,食品安全分析中使用二維液相色譜方法可經(jīng)過(guò)較少或不經(jīng)過(guò)前處理步驟分析檢測(cè)識(shí)別目標(biāo)化合物,從而避免該類失誤。

2.1 二維液相色譜在食品溯源方面的應(yīng)用

Ianni等[14]采用中心切割二維液相色譜法,該二維系統(tǒng)采用反相色譜柱串聯(lián)手性色譜柱組成,用于評(píng)估來(lái)自兩頭具有不同“加州乳腺炎測(cè)試”評(píng)分的奶牛的牛奶樣品中丹磺酰化氨基酸對(duì)映體含量的變化,結(jié)果顯示隨著乳腺炎發(fā)展程度加重,丹磺?；被岷克街饾u降低,該結(jié)果可建立數(shù)學(xué)模型以用于早期乳腺炎的診斷。Alvim-Jr等[15]建立在線反相手性二維色譜系統(tǒng)串聯(lián)三重四級(jí)桿檢測(cè)器完成人乳中的氟西汀和諾氟西汀的含量檢測(cè),該研究結(jié)合RAM-BSA C18色譜柱與ChirobioticTMV2色譜柱,提供了一種具有高靈敏度、無(wú)基質(zhì)效應(yīng)、分析時(shí)間僅為25 min、幾乎無(wú)需樣品制備且溶劑用量較少(每次運(yùn)行 10 mL)的方法,該方法成功應(yīng)用于分析母乳樣品,可用于藥代動(dòng)力學(xué)研究和常規(guī)藥物監(jiān)測(cè)。與Alvim-Jr同一課題組的Lopes等[16]將Alvim-Jr所建立的方法拓展至初乳樣品中,并按照歐洲藥品管理局指南完成方法驗(yàn)證。

指紋圖譜技術(shù)可用于分離、識(shí)別和比較復(fù)雜樣品的相關(guān)成分,二維液相指紋色譜可通過(guò)提供二維圖像來(lái)實(shí)現(xiàn)相關(guān)功能。全二維液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜可用于完成復(fù)雜樣品非靶向指紋識(shí)別,以獲得樣品化合物信息的完整圖譜。全二維指紋圖譜對(duì)分析方法的分離參數(shù)要求較高,需在保證不丟失信息的情況下最大化實(shí)現(xiàn)復(fù)雜樣品基質(zhì)分離,同時(shí)要應(yīng)對(duì)由于缺乏能夠直接處理二維液相色譜提供的復(fù)雜原始數(shù)據(jù)的軟件而導(dǎo)致的數(shù)據(jù)處理挑戰(zhàn)。使用二維液相色譜方法來(lái)評(píng)估受保護(hù)的原產(chǎn)地名稱(protected designation of origin,PDO)的真實(shí)性便是二維液相指紋圖譜技術(shù)一種代表性應(yīng)用。PDO是一項(xiàng)歐洲質(zhì)量認(rèn)證,由歐盟農(nóng)產(chǎn)品檢驗(yàn)認(rèn)證機(jī)構(gòu)頒發(fā),授予具有良好固定品質(zhì)(包括地理來(lái)源、加工和感官特性)的食品,該認(rèn)證旨在保護(hù)成員國(guó)優(yōu)質(zhì)食品和農(nóng)產(chǎn)品。來(lái)自卡拉布里亞(意大利)的甘草是具有高感官品質(zhì)和豐富生物活性的化合物,已被認(rèn)證為PDO產(chǎn)品。Montero等[17]開(kāi)發(fā)親水反相二維液相色譜方法,用于分析來(lái)自不同國(guó)家(意大利、中國(guó)、伊朗和阿塞拜疆)的甘草次級(jí)代謝產(chǎn)物,并與卡拉布里亞(意大利)的甘草次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)比,ZIC-HILIC固定相用作第一維色譜柱,選擇C18用作第二維色譜柱,該結(jié)果成功鑒定出可作為分析甘草地理來(lái)源評(píng)估的潛在標(biāo)記物。

Zhang等[18]建立親水反相二維液相色譜串聯(lián)離子淌度四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜完成43種紅參和37種白參指紋圖譜的建立和對(duì)比。該工作分析流程:第一步,確定24種人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品的碰撞截面值;第二步,使用人參皂苷數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)檢測(cè)到的化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定,結(jié)構(gòu)鑒定所需關(guān)鍵參數(shù)為峰檢測(cè)時(shí)間、強(qiáng)度閾值、質(zhì)量準(zhǔn)確度、碰撞截面值、耐受性和保留時(shí)間;第三步,使用Progenesis QI 2.1軟件處理原始數(shù)據(jù)完成標(biāo)志物檢測(cè);第四步,對(duì)檢測(cè)到的離子進(jìn)行光譜解卷積和歸一化,獲得包含保留時(shí)間、m/z 和歸一化峰面積的數(shù)據(jù)矩陣;第五步,使用Ezinfo 3.0軟件對(duì)所得矩陣進(jìn)行化學(xué)計(jì)量學(xué)分析,化學(xué)計(jì)量學(xué)分析包括應(yīng)用無(wú)監(jiān)督主成分分析和監(jiān)督正交偏最小二乘判別分析。該研究成功檢測(cè)出用于區(qū)分紅參和白參品種的9種人參皂苷,實(shí)現(xiàn)不同人參品種的溯源。

2.2 二維液相色譜在食品安全方面的應(yīng)用

2.2.1 化學(xué)性危害

多環(huán)芳烴是食品中廣泛存在的化學(xué)污染物之一,其在食品中的含量與食品來(lái)源有關(guān),主要通過(guò)烹飪過(guò)程、工業(yè)食品加工或環(huán)境污染產(chǎn)生。多環(huán)芳烴具有毒性、致癌和致突變作用,其在食品中的存在易對(duì)人類健康產(chǎn)生不利影響。由于多環(huán)芳烴的結(jié)構(gòu)多樣導(dǎo)致其異構(gòu)體數(shù)量多,因此分析該類化合物非常困難,二維液相色譜的強(qiáng)大分離能力可解決該問(wèn)題。Nestola等[19]建立中心切割二維液相色譜串聯(lián)氣質(zhì)聯(lián)用色譜法分析多種食物基質(zhì)中的多環(huán)芳烴,該系統(tǒng)中第一維色譜柱選擇硅膠柱用于去除甘油三酯并保留多環(huán)芳烴和不飽和物成分,自動(dòng)進(jìn)入第二維去除不飽和物并完成多環(huán)芳烴分離,第二維組分進(jìn)入氣質(zhì)聯(lián)用儀完成定量分析檢測(cè)。該研究提出了一種結(jié)合不同色譜分離策略分析多環(huán)芳烴的有效方法,成功用于檢測(cè)橄欖油、葵花籽油、雞蛋、番茄醬或蛋黃醬等樣品中的多環(huán)芳烴含量。

食品中常見(jiàn)的化學(xué)性危害物還包括除草劑和抗生素等。Donato等[20]建立二維液相色譜法用于檢測(cè)紅酒中除草劑,在一維中使用氰基色譜柱,在二維中使用C18色譜柱。此外,為了增加兩種分離機(jī)制之間的正交性,在第二維中使用了60 s的移動(dòng)梯度。該工作除了檢測(cè)紅酒的酚類成分外,還檢測(cè)到了痕量的除草劑滅草隆。通常認(rèn)為在線二維液相色譜的局限性之一是靈敏度低,主要是由于分析物在二維色譜中受到流動(dòng)相兩次稀釋;該成果中檢測(cè)限(LOD)為1 mg/L,表明對(duì)葡萄酒中所含化合物的分離和定量具有非常高的選擇性和靈敏度。Wang等[21]建立親水反相二維色譜系統(tǒng)串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)器檢測(cè)乳制品中七大類20種抗生素殘留,該方法可一次性完成乳中多種抗生素殘留檢測(cè),成功應(yīng)用于5種乳粉、5種液態(tài)奶和5種生奶的抗生素含量測(cè)定。

2.2.2 生物性危害

真菌毒素是由曲霉屬、青霉菌屬和鐮刀菌屬等幾種絲狀真菌產(chǎn)生的一組低分子量的有毒次生代謝產(chǎn)物,該類化合物攝入后可在動(dòng)物和人類中引起多種疾病。Campone等[22]成功開(kāi)發(fā)中心切割二維液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定啤酒中的黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2,伏馬毒素B1、B2和赭曲霉毒素A的含量分析。該方法運(yùn)行時(shí)間為37 min。選擇兩種啤酒對(duì)該方法進(jìn)行了驗(yàn)證,可滿足食品中霉菌毒素測(cè)定方法的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)(EC Decision 657/2002和Regulation(EC) No.401/2006)。與一維技術(shù)相比,該二維方法檢測(cè)過(guò)程中干擾物顯著減少,基質(zhì)效應(yīng)也大大減少。

食品溯源和安全是食品研究方向的一項(xiàng)重要議題,以上所述案例對(duì)于食品溯源和安全研究具有借鑒意義。

3 二維液相色譜在食品質(zhì)量和添加劑方面的應(yīng)用

3.1 二維液相色譜在食品質(zhì)量方面的應(yīng)用

食品質(zhì)量是食品的重要標(biāo)志性參數(shù),控制食品質(zhì)量才能保證其感官性質(zhì)。調(diào)味品作為食品工業(yè)的一個(gè)重要方面,色譜技術(shù)已應(yīng)用在調(diào)味品的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)表征方面[23-25]。二維液相色譜作為適合評(píng)價(jià)食品質(zhì)量的技術(shù),在該方面應(yīng)用已較多。Pickrahn等[26]建立液相色譜和固相萃取制備結(jié)合方法(HPLC-SPE-HPLC)用于表征兩種調(diào)味品大料提取物中的味覺(jué)成分,樣品首先在第一維色譜中分離出16個(gè)組分,進(jìn)而通過(guò)SPE完成溶劑替換,然后進(jìn)入第二維色譜完成分離;該分離系統(tǒng)制備出的256個(gè)組分使用超高效液相色譜串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜完成表征,表明該調(diào)味品的甜味主要由反式茴香腦提供,苦味由反式偽異丁香酚-2-甲基丁酸酯提供。

3.2 二維液相色譜在食品添加劑方面的應(yīng)用

在食品工業(yè)界,不法商家會(huì)通過(guò)添加被禁止的成分來(lái)偽裝成更高質(zhì)量的產(chǎn)品,或是添加限量物質(zhì)增強(qiáng)風(fēng)味,色譜已應(yīng)用于不同食品中添加劑的限量檢測(cè)[27—28]。Hou等[29]開(kāi)發(fā)了一種簡(jiǎn)便快速的停流速中心切割二維液相色譜方法,第一維使用C4色譜柱,第二維使用C18色譜柱,用于同時(shí)定量酸奶中的5種添加劑,包括阿斯巴甜、苯甲酸、那他霉素、糖精鈉和山梨酸,該方法總分析時(shí)間為30 min,樣品加標(biāo)回收率在94.5%～103.9%之間。Hou等[30]建立中心切割二維液相色譜法分析牛奶和奶粉中的5種主要蛋白質(zhì)(α-酪蛋白、β-酪蛋白、乳清蛋白、α-乳球蛋白、β-乳球蛋白)和7種添加劑(麥芽糖醇、乙基麥芽糖醇、香蘭素、乙基香蘭素、苯甲酸、山梨酸、糖精鈉),該方法中第一維色譜能夠?qū)⑻砑觿┖偷鞍踪|(zhì)分成兩組,呈現(xiàn)較高極性的添加劑從C4柱中快速洗脫并截留在捕集柱中以在第二維C18色譜柱中進(jìn)一步分析,而蛋白質(zhì)主要保留在第一維色譜柱中分析。添加單糖,如果糖、半乳糖或葡萄糖也是一種增強(qiáng)奶粉風(fēng)味的摻假方法,Ma等[31]開(kāi)發(fā)了一種二維液相色譜方法評(píng)估分析各種品牌和不同種類奶粉中單糖的存在,該方法使用無(wú)需樣品前處理的中心切割二維液相色譜方法,研究對(duì)象包括全脂、脫脂和嬰兒配方奶粉以及豆奶粉,該方法檢測(cè)出部分奶粉樣品中含有葡萄糖。

食品質(zhì)量和添加劑對(duì)食品工業(yè)行業(yè)發(fā)展尤為重要,以上所述策略對(duì)于食品質(zhì)量和真?zhèn)窝芯烤哂薪梃b意義。

4 二維液相色譜在食品營(yíng)養(yǎng)和健康方面的應(yīng)用

由于食品是非常復(fù)雜的基質(zhì),因此它們的分離和表征非常困難。二維液相色譜可有效解決復(fù)雜基質(zhì)分離分析過(guò)程中所遇到的挑戰(zhàn)[32]。眾所周知,食物的營(yíng)養(yǎng)成分含量與其生物活性之間具有量化關(guān)系。現(xiàn)在食品科學(xué)領(lǐng)域的大部分研究涉及食品營(yíng)養(yǎng)或食品健康?；诙S液相色譜在分離分析方面的優(yōu)點(diǎn),其在食品營(yíng)養(yǎng)與食品健康方面應(yīng)用前景廣闊[33—34]。二維液相色譜適合表征和鑒定食品基質(zhì)中存在的營(yíng)養(yǎng)成分,這些化合物通常是微量成分[35—37]。采用非靶向分析對(duì)包含目標(biāo)組分的基質(zhì)進(jìn)行全組分分析是理想的解決復(fù)雜基質(zhì)中微量組分分離分析的手段[38]。

4.1 二維液相色譜在食品營(yíng)養(yǎng)方面的應(yīng)用

酚類化合物是水果飲品中的代表性營(yíng)養(yǎng)調(diào)味物質(zhì),該類物質(zhì)的色譜表征已較成熟[39]。Aly等[40]選擇綠色環(huán)保溶劑替代部分傳統(tǒng)溶劑建立在線全二維液相色譜分析鑒別葡萄汁和葡萄酒中的酚類化合物,這項(xiàng)研究首次嘗試用綠色二維液相色譜,試圖在不影響分離能力的情況下更環(huán)保地實(shí)現(xiàn)該類物質(zhì)的分離分析。Brazdauskas等[41]采用綜合二維液相色譜完成黑莓果渣中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的化學(xué)表征,可分離出61種不同成分,可初步鑒定不同花青素、原花青素、黃酮類化合物和酚酸等營(yíng)養(yǎng)調(diào)味物質(zhì)。Montero等[42]建立親水反相串聯(lián)紫外質(zhì)譜二維方法用于分析多個(gè)品種葡萄藤中的(多)酚類營(yíng)養(yǎng)調(diào)味物質(zhì),首次在葡萄藤中檢測(cè)出高度聚合的二苯乙烯類化合物,該方法顯示出高峰容量(842)和良好的正交性(78%)。

二維液相色譜方法已廣泛用于食品功能活性物質(zhì)的制備,用于此目的的二維液相色譜配置通常是離線制備型二維液相色譜,該系統(tǒng)能夠從第一維手動(dòng)收集相對(duì)較大量的餾分,這些餾分可以適當(dāng)濃縮并重新溶解,以便在第二維中進(jìn)行分析。Fan等[43]建立制備型二維液相色譜方法用于分離甘草中黃酮類化合物,本成果中離線二維液相色譜成功用于純化甘草中的低濃度物質(zhì),在16.8 h內(nèi)純化24種純度高于90%的黃酮類化合物,表明離線二維制備色譜可用于分離活性營(yíng)養(yǎng)成分用于活性研究。Zenezini等[44]建立二維液相色譜用于從驢奶中純化肽,并對(duì)其進(jìn)行表征,首先通過(guò)反相一維純化具有抗氧化和血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性的驢奶肽,然后在第二維親水色譜分離中進(jìn)一步分析,通過(guò)篩選分離的肽的生物活性,其中兩個(gè)顯示出抗氧化活性,另外兩個(gè)顯示出血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制作用。

4.2 二維液相色譜在食品健康方面的應(yīng)用

二維液相色譜方法也可用于在線篩選化合物生物活性,通常第一維中使用細(xì)胞膜色譜,色譜柱中填充研究生物活性的特定受體,第二維則是分離目標(biāo)化合物。細(xì)胞膜色譜由細(xì)胞膜固定相組成,該固定相是將含有目標(biāo)化合物特定受體的細(xì)胞膜固定在活性二氧化硅上制備所得。Cao等[45]采用該方法成功從3種藥食兩用物質(zhì)中篩選出5種抗炎成分。

食品研究中,不僅食品成分重要,其相關(guān)的生物活性也很重要。以上所述策略對(duì)于食品營(yíng)養(yǎng)和健康研究具有借鑒意義。

5 展望

綜上所述,二維液相色譜是食品領(lǐng)域研究的一個(gè)非常有價(jià)值的工具。二維液相色譜方法在提高分辨率、獲得化合物結(jié)構(gòu)信息、易與質(zhì)譜聯(lián)用以及縮短樣品制備時(shí)間方面具有明顯優(yōu)勢(shì)。

盡管二維液相色譜在食品方面的應(yīng)用已經(jīng)比較廣泛,但仍有較大的提升空間。接口技術(shù)、耐用性、定量、化學(xué)計(jì)量學(xué)、數(shù)據(jù)處理等的發(fā)展有助于提高二維液相色譜在食品分析方面的應(yīng)用價(jià)值。未來(lái),二維液相色譜將在食品調(diào)味營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表征、食品質(zhì)量和食品安全等方面發(fā)揮巨大作用。