范旭東，胡國(guó)君，陳紹莉，任 芳，杜乃凡，戰(zhàn) 良，張尊平，董雅鳳

（1 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所，國(guó)家落葉果樹脫毒中心，遼寧興城 125100）（2 遼寧省綠色農(nóng)業(yè)技術(shù)中心）（3 山東青大種苗有限公司）

葡萄在無性繁殖和生長(zhǎng)過程中極易感染病毒，感病植株受病毒長(zhǎng)期持續(xù)危害，無法通過藥劑治療，嚴(yán)重影響葡萄產(chǎn)量和品質(zhì)。葡萄是感染病毒種類最多的果樹，目前已報(bào)道的病毒多達(dá)95 種[1-2]，其中約1/3 的病毒可引起明顯的癥狀和危害，導(dǎo)致樹體長(zhǎng)勢(shì)減弱、葉片和枝條畸形、葉片變色（變紅、變黃、褪綠、花葉、環(huán)斑）、木質(zhì)部凹陷等。葡萄扇葉衰退病（grapevine fanleaf degeneration disease，GFDD）是一類重要的葡萄病毒病，早期研究認(rèn)為其病原為葡萄扇葉病毒（grapevine fanleaf virus，GFLV）和10 余種其他線蟲傳多面體病毒屬（Nepovirus）病毒[3]。郭德銀等[4]最早采用間接ELISA方法從我國(guó)葡萄樣品中檢測(cè)到GFLV，但國(guó)內(nèi)尚無其他線蟲傳多面體病毒侵染葡萄的報(bào)道。

近年來，我國(guó)栽植的陽(yáng)光玫瑰葡萄病毒病發(fā)生普遍，多表現(xiàn)為植株長(zhǎng)勢(shì)減弱，葉片皺縮、褪綠、畸形等葡萄扇葉衰退病癥狀，為明確其病原，本團(tuán)隊(duì)采用高通量測(cè)序技術(shù)，從病株中鑒定到葡萄漿果內(nèi)壞死病毒（grapevine berry inner necrosis virus，GINV）[5]、灰比諾葡萄病毒（grapevine Pinot gris virus，GPGV）[6]和葡萄蠶豆萎蔫病毒（grapevine fabavirus，GFabV）[7]，未檢測(cè)到GFLV 和其他線蟲傳多面體病毒屬病毒，明確了我國(guó)葡萄扇葉衰退病相關(guān)病毒種類。本文通過對(duì)上述病毒研究進(jìn)展情況進(jìn)行梳理和總結(jié)，可為有針對(duì)性地開展病毒檢測(cè)和脫除，進(jìn)而有效防控葡萄扇葉衰退病提供參考。

1 我國(guó)葡萄扇葉衰退病相關(guān)病毒分析

葡萄扇葉衰退?。ㄋ追Q扇葉?。┰谖覈?guó)各主要葡萄產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，但一直對(duì)其病原缺乏深入系統(tǒng)研究。早期僅通過癥狀觀察判斷為扇葉病[8]，后采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）[4]和PCR 方法[9]對(duì)GFLV進(jìn)行檢測(cè)，因僅針對(duì)目的病毒，因此不能檢測(cè)到樣品中的其他病毒。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用，使全面檢測(cè)樣品中的所有病毒種類成為可能，對(duì)揭示引起葡萄病毒病害的病原具有重要意義。近年來，本團(tuán)隊(duì)采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)部分表現(xiàn)扇葉衰退病的葡萄樣品進(jìn)行病毒鑒定，均未檢測(cè)到GFLV，而是檢測(cè)到GINV、GPGV 和GFabV 等新病毒[10]，進(jìn)而明確了我國(guó)葡萄扇葉衰退病的主要病原。

2 我國(guó)葡萄扇葉衰退病相關(guān)病毒研究進(jìn)展

2.1 葡萄扇葉病毒

20 世紀(jì)60 年代初首次報(bào)道葡萄扇葉病毒（grapevine fanleaf virus，GFLV）可通過線蟲傳播，并將其汁液摩擦接種至昆諾藜、千日紅、煙草等草本寄主[11]。Hewitt 等[12]先通過劍線蟲將GFLV 傳播至莧色蔾，再?gòu)母腥镜那{色蔾回接到葡萄植株，引起葡萄產(chǎn)生典型的葡萄扇葉病癥狀，從而完成了GFLV 的柯赫氏法則驗(yàn)證，證明GFLV 是葡萄扇葉病的病原。GFLV 屬豇豆花葉病毒科（Comoviridae）、線蟲傳多面體病毒屬（Nepovirus）。病毒粒子球形，直徑30 nm，基因組包括RNA1 和RNA2 兩條鏈，不同分離株間無血清學(xué)差異，但存在癥狀差異，自然界中未發(fā)現(xiàn)葡萄以外的其他寄主[3]。

我國(guó)早期主要通過田間癥狀觀察來確定GFLV侵染，具有一定的主觀性。郭德銀等[4]采用間接ELISA 方法對(duì)葡萄樣品進(jìn)行了GFLV 鑒定，田間品種陽(yáng)性率為74.3%，熱處理試管苗陽(yáng)性率為5.6%，國(guó)外引進(jìn)的脫毒品種陽(yáng)性率為17.7%。晁無疾等[13]采用ELISA 方法對(duì)北京地區(qū)葡萄樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示GFLV 在北京地區(qū)發(fā)生普遍。譚雪蓮等[14]對(duì)甘肅地區(qū)葡萄樣品進(jìn)行ELISA 檢測(cè)，GFLV 檢出率為13.3%。2000 年以來，許多學(xué)者開始采用RT-PCR方法進(jìn)行檢測(cè)[15-18]。張向昆[19]對(duì)秦皇島8 個(gè)葡萄園5個(gè)釀酒品種435 份葡萄樣品進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)葡萄扇葉病普遍發(fā)生，但未檢出GFLV。陳婕等[20]對(duì)嘉興地區(qū)6 個(gè)縣區(qū)的6 個(gè)主栽品種162 份樣品進(jìn)行檢測(cè)，未檢出GFLV。周敏[21]從湖南主產(chǎn)區(qū)采集的54 個(gè)表現(xiàn)癥狀的葡萄樣品中29 個(gè)樣品檢測(cè)到GFLV。Zhou等[22]研發(fā)了巢式PCR 方法，大幅度提高了GFLV 的檢測(cè)靈敏度，2017 年首次報(bào)道了GFLV 中國(guó)分離物的基因組全長(zhǎng)序列，其與國(guó)外分離物處于不同的進(jìn)化分支[23]。

由于侵染葡萄的病毒種類繁多，癥狀復(fù)雜多變，很難將某種病毒與癥狀相對(duì)應(yīng)，研究結(jié)果也顯示，部分帶病植株檢測(cè)不到GFLV[19-21]，故推測(cè)存在其他病毒引起類似癥狀。近幾年，高通量測(cè)序技術(shù)發(fā)展迅速，可同時(shí)檢測(cè)發(fā)病植株中的所有已知和未知病毒，對(duì)于病原鑒定具有革命性的意義[24]。筆者對(duì)表現(xiàn)葉片褪綠斑駁、環(huán)斑、畸形等癥狀的葡萄樣品進(jìn)行高通量測(cè)序，均未檢測(cè)到GFLV，而是多次檢出GINV、GPGV 和GFabV，表明引起我國(guó)葡萄扇葉衰退病的病原不僅僅是GFLV。

2.2 葡萄漿果內(nèi)壞死病毒

日本于1997 年最先報(bào)道葡萄漿果內(nèi)壞死病毒（grapevine berry inner necrosis virus，GINV）[25]。GINV被認(rèn)為是葡萄漿果內(nèi)壞死?。ㄗ钤绶Q花葉病）的病原，該病于1984 年在日本巨峰葡萄上首次發(fā)現(xiàn)，在當(dāng)時(shí)的日本山梨縣葡萄園中造成嚴(yán)重危害。敏感品種（巨峰、先鋒、立川無核、康拜爾早生等）長(zhǎng)勢(shì)減弱，春季萌芽延遲，并表現(xiàn)莖內(nèi)壞死、短節(jié)，葉片褪綠，果粒變小，果外變色，果內(nèi)壞死等癥狀[26]。GINV 屬發(fā)狀病毒屬（Trichovirus）的成員，病毒粒子大小為740 nm×12 nm，基因組全長(zhǎng)為7 229 nt，由3 個(gè)開放閱讀框組成，分別編碼復(fù)制酶（RP）、移動(dòng)蛋白（MP）和外殼蛋白（CP）。目前已報(bào)道3個(gè)GINV 中國(guó)分離物的基因組全長(zhǎng)序列[27]?；贛P和CP 的遺傳進(jìn)化分析結(jié)果顯示，中國(guó)和日本GINV分離物可分為3 組，其中中國(guó)分離物主要分在組群1 和組群2，日本分離物位于組群3[28]。GINV 在田間可通過癭螨進(jìn)行傳播[29]。

Fan 等[5]對(duì)表現(xiàn)癥狀（褪綠斑駁和環(huán)斑）和無癥狀的貝達(dá)進(jìn)行小RNA 測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無癥狀植株中僅檢測(cè)到2 種類病毒（GYSVd1 和HSVd），而在表現(xiàn)環(huán)斑癥狀的植株中檢測(cè)到GINV 和HSVd，推測(cè)GINV 與貝達(dá)褪綠斑駁和環(huán)斑癥狀發(fā)生相關(guān)。后續(xù)對(duì)我國(guó)15 個(gè)省區(qū)市的195 個(gè)葡萄樣品進(jìn)行GINV 的RT-PCR 檢測(cè)，帶毒率為35.9%；表現(xiàn)明顯環(huán)斑癥狀的葡萄樣品GINV 檢出率為94.1%[28]，部分樣品癥狀表現(xiàn)見圖版2-A。雖然將GINV 嫁接傳毒至健康貝達(dá)葡萄上會(huì)引起環(huán)斑癥狀，但仍不能完成柯赫氏法則驗(yàn)證。對(duì)植物病毒而言，侵染性克隆是完成柯赫氏法則第三條規(guī)則的有效方法。為此，我們構(gòu)建了GINV 侵染性克隆，進(jìn)一步確定了GINV 能夠引起明顯的葡萄環(huán)斑癥狀[30]。

2.3 灰比諾葡萄病毒

2012 年，意大利研究人員首次發(fā)現(xiàn)灰比諾葡萄病毒（grapevine Pinot gris virus，GPGV），引起灰比諾、塔明娜、黑比諾等葡萄品種葉片褪綠斑駁、皺縮、變形等癥狀，與葡萄扇葉病極為相似[31]。GPGV是葡萄上發(fā)生最普遍、危害最嚴(yán)重的病毒之一，目前已有20 多個(gè)國(guó)家相繼報(bào)道[32]。研究表明GPGV 可通過葡萄癭螨進(jìn)行傳播[33]，并且該病毒在田間存在草本寄主[34]。GPGV 為正義單鏈RNA 病毒，是發(fā)狀葡萄病毒屬（Trichovirus）成員，其基因組由3 個(gè)開放閱讀框組成，分別編碼復(fù)制酶（RP）、移動(dòng)蛋白（MP）和外殼蛋白（CP）。GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)登錄的GPGV 基因組全長(zhǎng)序列有200 多條[35-36]。

感染GPGV 的葡萄植株并非都表現(xiàn)明顯癥狀，可能與葡萄品種對(duì)病毒的敏感性有關(guān)[37]。一些敏感品種并非一直表現(xiàn)明顯癥狀，Bianchi 等[38]發(fā)現(xiàn)，有癥狀植株的GPGV 平均濃度顯著高于無癥狀植株。Bertazzon 等[39]進(jìn)一步證實(shí)了這一現(xiàn)象，指出嚴(yán)重癥狀的發(fā)生與較高的病毒濃度有關(guān)。Saldarelli 等[40]對(duì)92 個(gè)GPGV 分離物基因組序列進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)MP 基因3′端和CP 基因起始處的588 個(gè)堿基區(qū)存在顯著的序列多樣性，特別是在有癥狀的葡萄樣品中，MP 基因存在提前終止密碼子，從而產(chǎn)生了毒力較強(qiáng)的分離物，引起嚴(yán)重癥狀。為進(jìn)一步明確GPGV的致病性，研究者構(gòu)建了侵染性克隆，通過農(nóng)桿菌侵染方式接種葡萄，出現(xiàn)了與田間自然感染植株相同的癥狀，進(jìn)一步證明了GPGV 與癥狀的關(guān)系，接種的葡萄4～5 個(gè)月后會(huì)發(fā)生隱癥現(xiàn)象[41]。植株體內(nèi)硼元素的平衡在減輕癥狀中起到一定作用[40-41]。

2016 年，我國(guó)首次報(bào)道了GPGV，檢測(cè)的36個(gè)葡萄樣品中15 個(gè)為陽(yáng)性，其中10 個(gè)樣品表現(xiàn)褪綠花葉癥狀[6]，部分樣品癥狀表現(xiàn)見圖版2-B。將5個(gè)感染GPGV 的葡萄樣品（僅1 個(gè)表現(xiàn)褪綠花葉癥狀）嫁接傳毒至健康貝達(dá)葡萄上，結(jié)果均表現(xiàn)明顯的褪綠花葉癥狀，表明貝達(dá)葡萄對(duì)GPGV 較為敏感。2018 年，采用RT-PCR 方法對(duì)采自15 個(gè)省區(qū)市的195 個(gè)葡萄樣品進(jìn)行檢測(cè)，GPGV 檢出率為28.2%[42]。

2.4 葡萄蠶豆萎蔫病毒

葡萄蠶豆萎蔫病毒（grapevine fabavirus，GFabV）是2016 年從日本鮮食葡萄上鑒定出的新病毒[43]，中國(guó)、韓國(guó)、美國(guó)等也有報(bào)道[7,44-45]。GFabV 屬于伴生豇豆病毒科（Secoviridae）蠶豆萎蔫病毒屬（Fabavirus）成員，其基因組由RNA1 和RNA2 兩條正義單鏈組成[46]。GFabV 基因組變異較大，基于RNA1 和RNA2 多聚蛋白的部分核苷酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，中國(guó)和國(guó)外GFabV 分離物可劃分為5 個(gè)種群，中國(guó)分離物歸屬于其中的3 個(gè)種群[47]。日本學(xué)者基于RNA1 基因組序列將GFabV 分離物劃分為4 個(gè)種群[45]。目前，中國(guó)已獲得了3 個(gè)具有明顯差異的GFabV 基因組全長(zhǎng)序列[48-49]。

2017 年，采用小RNA 測(cè)序技術(shù)，我國(guó)首次從表現(xiàn)葉片褪綠斑駁及畸形癥狀的貝達(dá)葡萄上檢測(cè)到GFabV，通過嫁接傳毒的方法，明確了該病毒與貝達(dá)病毒病癥狀的相關(guān)性[7]。我國(guó)陽(yáng)光玫瑰病毒病普遍發(fā)生，表現(xiàn)葉片變小、褪綠斑駁、畸形等癥狀，但均未檢測(cè)到GFLV[50-51]。2019 年，我們采用小RNA測(cè)序技術(shù)，對(duì)表現(xiàn)和不表現(xiàn)癥狀的陽(yáng)光玫瑰進(jìn)行病毒鑒定，發(fā)現(xiàn)GFabV 在感病陽(yáng)光玫瑰中檢出率達(dá)88.2%，明顯高于其他病毒，因此推測(cè)GFabV 是引起陽(yáng)光玫瑰病毒病的關(guān)鍵病原[10]。日本保存的陽(yáng)光玫瑰無病毒原種不攜帶病毒和類病毒，但母本樹（原種嫁接到5BB 砧木上）攜帶GFabV、葡萄雙生病毒A、啤酒花矮化類病毒和葡萄黃斑類病毒1[52]。韓國(guó)學(xué)者也在葡萄上檢測(cè)到GFabV，帶病毒的陽(yáng)光玫瑰葡萄表現(xiàn)葉片褪綠和畸形癥狀[45]。部分感染GFabV的葡萄樣品癥狀見圖版2-C。

3 展望

葡萄扇葉衰退病在我國(guó)葡萄產(chǎn)區(qū)發(fā)生普遍，曾經(jīng)認(rèn)為類似癥狀均由GFLV 引起，近年研究發(fā)現(xiàn)，除GFLV 外，GINV、GPGV 和GFabV 也會(huì)引起扇葉衰退病癥狀（葉片畸形、黃斑、環(huán)斑、黃化），而且檢出率顯著高于GFLV。通過侵染性克隆構(gòu)建（GINV）、嫁接傳毒（GPGV、GFabV）等試驗(yàn)研究，證明GINV、GPGV、GFabV 與我國(guó)葡萄扇葉衰退病相關(guān)。今后應(yīng)加強(qiáng)GINV、GPGV、GFabV 的致病性及傳播途徑研究，研發(fā)高效的病毒檢測(cè)和脫除技術(shù)，建立規(guī)范的葡萄脫毒種苗培育體系，為我國(guó)葡萄產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展提供苗木保障。