董孝元，周 玉，余 義，劉 莎，汪明迪，孫 莉，唐艷榮*

（1.黃鶴樓酒業(yè)有限公司，湖北 武漢 430050；2.湖北信嘉檢測(cè)科技有限公司，湖北咸寧 437000；3.黃鶴樓酒業(yè)（咸寧）有限公司，湖北咸寧 437000）

中國(guó)是蒸餾酒生產(chǎn)大國(guó)。酒類在發(fā)酵蒸餾過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生一種致癌物質(zhì)氨基甲酸乙酯，該物質(zhì)不斷為大眾所熟知，是食物在發(fā)酵或貯存過(guò)程中天然產(chǎn)生的物質(zhì)，普遍存在于發(fā)酵食品和酒類產(chǎn)品中。眾所周知，用糧食釀造的白酒需要經(jīng)過(guò)發(fā)酵以及高溫蒸煮，釀造酒中的氨基甲酸乙酯主要是由乙醇和尿素共同作用產(chǎn)生的。尿素是在發(fā)酵過(guò)程中酵母分解精氨酸所產(chǎn)生的副產(chǎn)品。氨基甲酸乙酯也會(huì)在蒸餾酒內(nèi)產(chǎn)生，特別是核果（如櫻桃、杏和梅）烈酒。果核所含的氰基糖苷在酶水解后會(huì)產(chǎn)生一種名為異氰酸酯的副產(chǎn)品，異氰酸酯與酒中的乙醇發(fā)生化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生氨基甲酸乙酯。

氨基甲酸乙酯是一種廣泛存在于白酒飲料中的2A 類致癌物質(zhì)，對(duì)人體健康存在潛在危害性[1]，各類酒中均不同程度微量存在，一些國(guó)家對(duì)酒中的含量有明確的限制規(guī)定[4]。關(guān)于食物中的EC含量，國(guó)際上對(duì)食品及酒類的氨基甲酸乙酯含量控制規(guī)定各不相同。我國(guó)白酒固態(tài)發(fā)酵方式及獨(dú)特的生產(chǎn)工藝，在一定程度上限制了現(xiàn)有氨基甲酸乙酯控制措施的可使用性。目前氨基甲酸乙酯的檢測(cè)方法包括液相法、液相質(zhì)譜串聯(lián)法、氣相質(zhì)譜串聯(lián)法等[3]。本文從利用液相質(zhì)譜聯(lián)用儀高效快速檢測(cè)氨基甲酸乙酯入手，優(yōu)化前處理方式，縮短檢測(cè)出峰時(shí)間，有利于我國(guó)白酒中氨基甲酸乙酯限量標(biāo)準(zhǔn)的建立，為消費(fèi)者和白酒生產(chǎn)企業(yè)提供參考，使我國(guó)白酒企業(yè)得以良性發(fā)展及保障白酒產(chǎn)品的質(zhì)量安全[2]。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

樣品：市售白酒。

試劑及耗材：氨基甲酸乙酯（規(guī)格0.1 g，儲(chǔ)存溫度20 ℃±4 ℃），Dr.Ehrenstorfer GmbH；乙腈（色譜純），美國(guó)Baker 公司；甲酸（色譜純），麥克林集團(tuán)有限公司；超純水，德國(guó)默克密理博MiLLi-QDireat。

儀器設(shè)備：Agilent 1260LC-Agilent 6460 安捷倫三重串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜儀；Agilent ZORBAX RXC18安捷倫色譜柱（2.1×150 mm，1.8 μm）；有機(jī)濾膜(孔徑0.22 μm)，天津津騰；天津津騰全玻璃微孔過(guò)濾器(規(guī)格1000 mL)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（100 mg/L）：準(zhǔn)確稱取10 mg（精確至0.0001 mg）氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL 容量瓶中，用一級(jí)水溶解并定容至100 mL，配制成100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于4 ℃冰箱中保存。

標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別準(zhǔn)確吸取0.04 mL、0.08 mL、0.16 mL、0.40 mL、0.80 mL 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于100 mL容量瓶中，一級(jí)水定容至刻度，配制成濃度分別為0.04 mg/L、0.08 mg/L、0.16 mg/L、0.40 mg/L、0.80 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2.2 樣品前處理方法

用移液管準(zhǔn)確移取10 mL 白酒樣品于蒸發(fā)皿中，放于沸騰水浴鍋上，蒸發(fā)至近干后用純水定容至10 mL，并搖勻。用一次性2.5 mL 注射器吸取均質(zhì)樣品，經(jīng)0.22 μm的有機(jī)濾膜過(guò)濾至1 mL進(jìn)樣瓶中，供液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀上機(jī)檢測(cè)。

1.2.3 色譜條件

(a)色譜柱：C18柱（柱長(zhǎng)150 mm，柱內(nèi)徑2.1 mm，填料粒徑1.8μm）；

(b)流動(dòng)相：A 相：0.1 %甲酸溶液；B 相：乙腈溶液；

(c)流速：0.15 mL/min；

(d)柱溫：40 ℃；

(e)進(jìn)樣量：2 μL。

1.2.4 質(zhì)譜條件

(a)離子源類型：電噴霧離子源；

(b)掃描方式：正離子模式；

(c)毛細(xì)管電壓：3000 V；

(d)離子源溫度：350 ℃；

(e)霧化氣：30 psi；

(f)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)：選擇至少2個(gè)子離子。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件和質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.1.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

將液相部分色譜柱換為兩通連接，采取直接進(jìn)樣的方式，將配制的純品目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)溶液注入質(zhì)譜，分別進(jìn)行正離子模式和負(fù)離子模式，在Scan 狀態(tài)下進(jìn)行全掃描檢測(cè)，得到TIC 總離子流圖，根據(jù)總離子流圖標(biāo)記出特征離子峰，即得到一級(jí)質(zhì)譜圖和準(zhǔn)分子離子峰，再進(jìn)行SIM 模式掃描，將標(biāo)記出的準(zhǔn)分子離子峰進(jìn)行單獨(dú)掃描，得到EIC 提取離子流圖；再用碰撞氣惰性氣體氮?dú)夤粼撉绑w離子，獲得其二級(jí)質(zhì)譜圖及相應(yīng)的子離子。結(jié)果表明在正離子模式下響應(yīng)值及靈敏度均高于負(fù)離子模式，因此，本方法選擇正離子電離模式。利用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM)）對(duì)選定的定性離子和定量離子對(duì)裂解電壓、毛細(xì)管電壓、碰撞能、保留時(shí)間、碰撞池加速電壓等質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，使各監(jiān)測(cè)離子豐度和信號(hào)達(dá)到最佳。正離子模式下的質(zhì)譜分析參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 氨基甲酸乙酯的質(zhì)譜參數(shù)

2.1.2 色譜條件的優(yōu)化

通過(guò)對(duì)氨基甲酸乙酯物理和化學(xué)信息的分析，分別以0.1%甲酸-甲醇、0.1%甲酸-乙腈、5 mmol/L甲酸銨-乙腈、5 mmol/L 甲酸銨-甲醇作為流動(dòng)相進(jìn)行樣品分離。由于不同流動(dòng)相的pH 值不同，對(duì)色譜柱中的填料物質(zhì)會(huì)起到一定的作用，有的流動(dòng)相有利于目標(biāo)物質(zhì)的分離，有的流動(dòng)相則會(huì)抑制目標(biāo)物出峰，導(dǎo)致峰形異常，如峰拖尾、峰前伸、雙頭峰，以及鬼峰等現(xiàn)象，均不利于對(duì)樣品進(jìn)行定性以及定量分析。通過(guò)利用以上流動(dòng)相對(duì)氨基甲酸乙酯進(jìn)行色譜峰分離，結(jié)果表明，用0.1%甲酸-乙腈作為流動(dòng)相時(shí)物質(zhì)分離度、峰形、響應(yīng)值以及保留時(shí)間的穩(wěn)定性均優(yōu)于0.1%甲酸-甲醇、5 mmol/L甲酸銨-乙腈、5 mmol/L 甲酸銨-甲醇，故本方法最終選用0.1 %甲酸-乙腈為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫。圖3 是氨基甲酸乙酯在優(yōu)化的色譜和質(zhì)譜條件下的MRM色譜圖。

圖1 氨基甲酸乙酯離子質(zhì)譜圖

圖2 不同流動(dòng)相色譜圖對(duì)比

圖3 氨基甲酸乙酯的多反映監(jiān)測(cè)色譜圖

圖4 氨基甲酸乙酯母離子及子離子色譜圖

2.2 線性范圍、檢出限和定量限

將氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用一級(jí)水稀釋，分別配制成濃度為40 μg/L、80 μg/L、160 μg/L、400 μg/L、800 μg/L 的標(biāo)準(zhǔn)工作液，按1.2 節(jié)所述的色譜-質(zhì)譜條件進(jìn)行測(cè)定，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，如圖5 所示。參考標(biāo)準(zhǔn)GB/T 27417—2017《合格評(píng)定化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗(yàn)證指南》中5.4 檢出限和定量限的評(píng)定方法規(guī)定，信噪比法評(píng)估檢出限和定量限，檢出限可接受的信噪比為3∶1，定量限可接受的信噪比為10∶1。本方法為保證實(shí)用性，模擬氨基甲酸乙酯在白酒中的狀態(tài)，由于目前市面上的白酒酒精度大多在42%vol和52%vol，本方法利用購(gòu)買的無(wú)水乙醇，配制成酒精度為46%vol 的白酒模擬樣品，在白酒模擬樣品中添加氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，進(jìn)行方法探底試驗(yàn)。既要保證信噪比可接受，也要保證峰形易識(shí)別，且峰形無(wú)異常，如圖6所示。

圖5 氨基甲酸乙酯的線性相關(guān)系數(shù)

圖6 檢出限和定量限信噪比

結(jié)果顯示，在40～800 μg/L 的濃度范圍內(nèi)，分析物氨基甲酸乙酯的質(zhì)量濃度x(ng/mL)和響應(yīng)值y之間線性相關(guān)系數(shù)為0.999；模擬樣品中添加濃度為10 μg/L 時(shí)，信噪比為6 大于3，峰形易識(shí)別且無(wú)異常，即確定為檢出限；濃度為20 μg/L信噪比為15大于10，峰形易識(shí)別且無(wú)異常，故確定為定量限。

2.3 精密度和回收率

為充分保證相關(guān)樣品檢測(cè)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確有效，本試驗(yàn)分別準(zhǔn)備3 種常見(jiàn)的不同香型白酒樣品，濃香型白酒、醬香型白酒和清香型白酒，并在3 種白酒樣品中分別加入按標(biāo)準(zhǔn)工作曲線濃度最高點(diǎn)的0.1倍、0.5倍和0.9倍的標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成低中高3種濃度的加標(biāo)樣品溶液，按照給定分析方法的全過(guò)程進(jìn)行處理和測(cè)定，記錄6 個(gè)平行樣的測(cè)定結(jié)果，按全程序每個(gè)樣品平行測(cè)定6 次，分別計(jì)算每個(gè)樣品的加標(biāo)回收率，統(tǒng)計(jì)其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，見(jiàn)表2、表3、表4。

表2 樣品1加標(biāo)回收率計(jì)算

表3 樣品2加標(biāo)回收率計(jì)算

表4 樣品3加標(biāo)回收率計(jì)算

參考公式：

加標(biāo)回收率=(加標(biāo)試樣測(cè)定值-試樣測(cè)定值)/加標(biāo)量×100%

由表2 可知，本實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)結(jié)果的重復(fù)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（變異系數(shù)）均小于10 %，且加標(biāo)回收率均在95%～115%之間，滿足方法驗(yàn)證學(xué)要求。

2.4 與國(guó)標(biāo)法比對(duì)

選擇市面上常見(jiàn)的3 種香型白酒，濃香、清香和醬香，按照本方法和食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基甲酸乙酯的測(cè)定GB 5009.223—2014 分別進(jìn)行樣品前處理以及上機(jī)檢測(cè)。本方法采用除醇方式對(duì)白酒樣品進(jìn)行前處理，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行檢測(cè)，外標(biāo)法定量分析；國(guó)標(biāo)GB 5009.223—2014采用萃取、分液及氮吹等方式對(duì)樣品進(jìn)行前處理，氣相色譜-質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)，內(nèi)標(biāo)法定量分析。3種香型白酒的檢測(cè)比對(duì)結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 方法結(jié)果比對(duì) (μg/L)

由表5 可知，不同香型白酒氨基甲酸乙酯含量差別比較大，將本方法和國(guó)標(biāo)方法的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，相對(duì)偏差均小于10 %，由此可知，對(duì)于不同濃度的白酒樣品，本方法與國(guó)標(biāo)方法檢測(cè)結(jié)果相差不大，能滿足檢測(cè)要求。

3 結(jié)論

本研究利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析了白酒中氨基甲酸乙酯化合物的分子信息，利用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，建立了快速、穩(wěn)定、靈敏的可定性定量分析氨基甲酸乙酯的方法。該方法可在8 min內(nèi)完成，經(jīng)過(guò)多種方法學(xué)驗(yàn)證，其檢測(cè)范圍內(nèi)線性良好（r=0.999）；檢出限0.01 mg/L；定量限0.02 mg/L；精密度小于10 %；回收率大于95%；并且在與國(guó)標(biāo)方法檢測(cè)結(jié)果比較中，檢測(cè)結(jié)果相對(duì)偏差均小于10 %。對(duì)于不同香型白酒，氨基甲酸乙酯濃度各異。由結(jié)果可知本方法與國(guó)標(biāo)方法偏差較小，滿足使用要求。與國(guó)標(biāo)中的檢測(cè)方法相比本方法前處理更加方便快捷，便于日常對(duì)白酒中氨基甲酸乙酯的含量進(jìn)行監(jiān)控。綜上所述本方法可以對(duì)白酒中氨基甲酸乙酯進(jìn)行實(shí)際的定性定量分析檢測(cè)。