徐海剛，熊 智，沈 暉，彭繼賓，范明宣，李浩然，潘 春，唐明瑞

（1.西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南昆明 650000；2.貴州輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院輕工化工系，貴州貴陽 550000）

紅稗始載于滇南本草，是云南民間習(xí)用藥，別稱山紅稗、山高粱、野紅米草、野高粱、水高粱、野雞稗、紅米和土稗子[1]。紅稗中含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素及礦質(zhì)元素，作為一種藥食兼用的植物，其營養(yǎng)和藥用價(jià)值均較高。以紅稗為原料進(jìn)行深加工，可開發(fā)出新型營養(yǎng)產(chǎn)品，提高紅稗產(chǎn)品的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[2]。米酒含有多種對(duì)人體機(jī)能健康有益的營養(yǎng)成分，如蛋白質(zhì)、氨基酸、礦物質(zhì)元素和維生素等，有增強(qiáng)食欲、免疫力等功效[3]。以貴州習(xí)水紅稗為原料，采用米酒液態(tài)發(fā)酵法，可得到一款出酒率較高、風(fēng)味協(xié)調(diào)、營養(yǎng)物質(zhì)含量高的米酒。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

材料：紅稗（貴州習(xí)水，市售）；糖化發(fā)酵劑（笑仙甜酒曲Q303、屈氏甜酒曲甜味型、安琪甜酒曲甜味型、尚川甜酒曲，市售）；純凈水；過濾紗布。

試劑：硫酸銅、次甲基藍(lán)、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、亞鐵氰化鉀、濃硫酸（以上使用試劑均為分析純），葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品。

儀器設(shè)備：SPX-250BIII 培養(yǎng)箱、WK2102 美的電磁爐、X-04 蒸鍋、JY3002 電子天平、F80-A20GA3 萬分之一分析天平、ZNHW 電熱套、蒸餾燒瓶、冷凝管、酒精計(jì)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)流程紅稗→清洗→浸泡→蒸煮→攤晾→拌曲→入缸糖化→投水發(fā)酵→過濾、澄清→成品

1.2.2 操作要點(diǎn)

紅稗清洗：選用新鮮、顆粒飽滿無霉變的紅稗米，用清水淘洗并除去雜物。

浸泡：使紅稗米中的淀粉充分吸水膨脹，疏松淀粉顆粒之間連接，便于蒸煮糊化。

蒸煮：要求蒸煮后的紅稗米外硬內(nèi)軟、疏松不糊且均勻一致。

攤晾：采用自然攤晾方法自然降溫至30～45 ℃，進(jìn)行拌曲。

拌曲：適量加入甜酒曲并充分拌勻，裝入發(fā)酵瓶中，不超過總量三分之二。

發(fā)酵、糖化：在溫度26～34 ℃條件下進(jìn)行恒溫發(fā)酵。第1 天為糖化過程，糖化結(jié)束后添加適量純凈水進(jìn)行發(fā)酵，并注意避免雜菌污染。

過濾、澄清：選用紗布過濾掉殘余酒糟，得到澄清酒液。

1.2.3 理化指標(biāo)檢測

總酸的測定：參照GB/T 13662—2018 黃酒（總酸滴定法）[4]。

總糖的測定：參照GB/T1 3662—2018 黃酒（亞鐵氰化鉀滴定法）。

酒精度：參照GB 5009.225—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)酒中乙醇濃度的測定》酒精計(jì)法[5]測定酒精度。

出酒率測定：出酒率=(酒醪總量×酒醪酒精度)/原料總量×100%[6]

1.2.4 感官評(píng)價(jià)

參照NY/T 1885—2017《綠色食品 米酒》[7]感官要求，由專業(yè)的10 人組成評(píng)分小組，依次對(duì)米酒的外觀形態(tài)、香氣香味、口味、風(fēng)格4 個(gè)指標(biāo)進(jìn)行感官綜合評(píng)分，感官評(píng)分結(jié)果取平均值[2]。評(píng)價(jià)指標(biāo)及評(píng)分值見表1。

表1 紅稗米酒感官評(píng)價(jià)指標(biāo)

1.2.5 糖化發(fā)酵劑對(duì)紅稗米酒出酒率、感官品質(zhì)的影響

分別選取笑仙甜酒曲Q303、屈氏甜酒曲甜味型、安琪甜酒曲甜味型、尚川甜酒曲4 種糖化發(fā)酵劑，考察對(duì)紅稗米酒的出酒率、感官評(píng)分綜合影響。

1.2.6 紅稗米酒生產(chǎn)工藝單因素試驗(yàn)

以產(chǎn)品的出酒率、感官評(píng)價(jià)為檢驗(yàn)指標(biāo)，分別考察菌種接種量、液料比、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度對(duì)紅稗發(fā)酵米酒產(chǎn)品質(zhì)量的影響，單因素試驗(yàn)因素水平見表2。

表2 單因素試驗(yàn)因素水平表

1.2.7 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇菌種接種量（A）、液料比（B）、發(fā)酵時(shí)間（C）、發(fā)酵溫度（D）4 個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，以紅稗米酒出酒率（R）為響應(yīng)指標(biāo)，確定紅稗米酒生產(chǎn)最佳工藝條件，因素及水平如表3所示。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)表

2 結(jié)果與分析

2.1 糖化發(fā)酵劑對(duì)紅稗米酒出酒率、感官品質(zhì)的影響

用同種原料、同類酒曲釀造的米酒，其氨基酸總量差異甚小，不同類酒曲發(fā)酵釀造的米酒其氨基酸含量相差比較大，且米酒風(fēng)味差異較大，呈味氨基酸含量比也有明顯區(qū)別[8]。從圖1 試驗(yàn)結(jié)果可知，笑仙Q303 甜酒曲發(fā)酵出酒率和感官評(píng)分均最高，分別為45%、86 分，所得產(chǎn)品香氣舒適、口感協(xié)調(diào)，因此選定笑仙甜酒曲Q303 作為紅稗米酒糖化發(fā)酵劑。

圖1 糖化發(fā)酵劑對(duì)紅稗米酒出酒率和感官品質(zhì)的影響

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 菌種接種量對(duì)紅稗米酒出酒率、感官品質(zhì)的影響

由圖2 可知，隨著菌種接種量的增加，紅稗米酒的出酒率逐漸增加，在0.5%時(shí)達(dá)到最高，感官評(píng)分86 分，此時(shí)的紅稗米酒特征明顯，米酒口感品質(zhì)最佳，酒體質(zhì)地均勻，顏色透徹飽滿。菌種添加量為0.6%時(shí)，出酒率和感官評(píng)分均出現(xiàn)下降趨勢，此時(shí)酒體顏色過深，酒體渾濁酸澀味加重[9]。所以最適的菌種接種量為0.5%。

圖2 菌種接種量對(duì)紅稗米酒出酒率和感官品質(zhì)的影響

2.2.2 液料比對(duì)紅稗米酒出酒率、感官品質(zhì)的影響

由圖3 可知，加水量較少時(shí)，由于葡萄糖含量較高，此時(shí)乙醇含量也相對(duì)較高，所得成品口味偏甜；隨著加水量增多，乙醇占比降低，酒味淡薄，米酒風(fēng)味不明顯；加水量在150%時(shí)，出酒率47%，感官得分82 分，米酒口感品質(zhì)佳，酒體質(zhì)地均勻。因此選定發(fā)酵液料比為150%。

圖3 液料比對(duì)紅稗米酒出酒率和感官品質(zhì)的影響

2.2.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)紅稗米酒出酒率、感官品質(zhì)的影響

由圖4 可見，產(chǎn)品的出酒率隨著時(shí)間的增加逐漸提高，在7 d 時(shí)達(dá)到最大值為47 %，之后趨于穩(wěn)定。產(chǎn)品的感官評(píng)分在發(fā)酵5～7 d 呈上升趨勢，第7 天時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)為87 分，之后逐漸降低。在發(fā)酵前期，隨著時(shí)間的增加，產(chǎn)品中的酒精含量逐漸提高，導(dǎo)致出酒率也隨之提高，繼續(xù)延長發(fā)酵時(shí)間，產(chǎn)品中的苦澀味加重，酒味的刺激感變得更強(qiáng)，因此選定發(fā)酵時(shí)間為7 d。

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)紅稗米酒出酒率和感官品質(zhì)的影響

2.2.4 發(fā)酵溫度對(duì)紅稗米酒出酒率、感官品質(zhì)的影響

由圖5 可知，溫度為26 ℃時(shí)，由于葡萄糖含量較高，乙醇含量較低，感官品評(píng)時(shí)甜味明顯，酒味很淡，出酒率較低；在溫度28 ℃時(shí)，紅稗米酒的出酒率和感官均達(dá)到最高，出酒率45 %，感官評(píng)分86分，此時(shí)葡萄糖含量與乙醇含量較為均衡，米酒香氣突出、香味明顯、口感適中[10]；在30～34 ℃溫度范圍內(nèi)，由于溫度過高影響酵母活性，出酒率和感官評(píng)分均下降，酒體較淡薄，缺少特色。因此選定發(fā)酵溫度為28 ℃。

圖5 發(fā)酵溫度對(duì)紅稗米酒出酒率和感官品質(zhì)的影響

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果分析

2.3.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果與方差分析

通過Design-Expert8.0.6 軟件的分析，得到響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果，如表4 所示。將表4 數(shù)據(jù)帶入Design-Expert8.0.6 軟件中，得到方差分析結(jié)果[11]，如表5所示。

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

表5 出酒率回歸方程的方差分析結(jié)果

2.3.2 響應(yīng)面方差及顯著性分析結(jié)果

建立響應(yīng)面模型擬合及方差分析，以菌種接種量A、液料比B、發(fā)酵時(shí)間C、發(fā)酵溫度D 為考察因素，以出酒率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，利用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得到二次多項(xiàng)式回歸方程：

對(duì)出酒率預(yù)測數(shù)學(xué)模型進(jìn)行方差統(tǒng)計(jì)分析，如表5 所示。F 值的大小是評(píng)價(jià)各變量對(duì)響應(yīng)值影響程度的重要指標(biāo)，F(xiàn) 值越大，表明有關(guān)模型分量對(duì)響應(yīng)影響貢獻(xiàn)度越高。當(dāng)顯著性檢驗(yàn)概率P＜0.05時(shí)，揭示了該變量對(duì)響應(yīng)值影響顯著，具有數(shù)理統(tǒng)計(jì)意義[12]。由表5 可知，影響出酒率的因素按貢獻(xiàn)大小排序?yàn)椋築＞D＞A＞C，即液料比>發(fā)酵溫度＞菌種接種量>發(fā)酵時(shí)間。模型的決定系數(shù)R2為0.9673，說明模型擬合優(yōu)度較高，并且R2adj=0.9345，能夠解釋實(shí)驗(yàn)93.45 %的響應(yīng)值變化，與預(yù)測相關(guān)系數(shù)R2pred相差不大，表明該模型具備較高預(yù)測精準(zhǔn)度[13]。綜上，上述模型可用于分析和預(yù)測最優(yōu)出酒率。

2.3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)交互作用分析

根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，響應(yīng)面圖的曲面越陡峭，兩兩因素的交互作用就越明顯，相反，響應(yīng)面圖的曲面越平緩，兩兩因素的交互作用就越不顯著。等高線呈圓形表示兩因素交互作用不顯著，橢圓形或馬鞍形則表示兩因素交互作用顯著[14]。

從圖6 可以看出，菌種接種量A 和液料比B 交互作用等高線呈現(xiàn)橢圓形，表明二者交互作用對(duì)出酒率影響顯著[15]。菌種接種量A 和液料比B 的交互作用對(duì)出酒率的影響呈拋物面分布，當(dāng)菌種接種量A 一定時(shí)，隨著液料比B 的增加，出酒率先上升后下降，同理，當(dāng)液料比B不變時(shí)，隨著菌種接種量A 的提高，出酒率也呈現(xiàn)先增加后減小[16]。僅考慮二者因素作用下的最優(yōu)組合為：菌種接種量A 為0.47 %～0.53 %，液料比B 為1.4～1.6 水平組合附近。

圖6 菌種接種量液料比的交互作用對(duì)出酒率的影響

圖7所示菌種接種量A和發(fā)酵時(shí)間C的交互作用等高線呈現(xiàn)近圓形，表明菌種接種量和發(fā)酵時(shí)間交互作用對(duì)出酒率影響不顯著[17]，出酒率隨菌種接種量A 和發(fā)酵時(shí)間C 的增加均呈現(xiàn)先增后減變化。菌種接種量A 為0.47 %～0.53 %、發(fā)酵時(shí)間C為46.8～7.2 d 水平區(qū)間時(shí)的出酒率最高。

圖7 菌種接種量發(fā)酵時(shí)間的交互作用對(duì)出酒率的影響

圖8 菌種接種量A 和發(fā)酵溫度D 交互作用等高線呈現(xiàn)橢圓形，表明二者交互作用對(duì)出酒率影響顯著[18]。出酒率隨菌種接種量和發(fā)酵溫度的增加呈先增后減變化。當(dāng)菌種接種量A 為0.47 %～0.53 %，發(fā)酵溫度D 為27.5～28.5 ℃水平區(qū)間時(shí)，出酒率較高，應(yīng)控制該條件從而優(yōu)化出酒率。

圖8 菌種接種量發(fā)酵溫度的交互作用對(duì)出酒率的影響

圖9出酒率隨液料比B和發(fā)酵時(shí)間C的增加呈先增后減變化。當(dāng)液料比B 為1.4～1.6，發(fā)酵時(shí)間C 為6.8～7.2 d 水平區(qū)間時(shí)，出酒率較高，應(yīng)控制該條件從而優(yōu)化出酒率。

圖9 液料比發(fā)酵時(shí)間的交互作用對(duì)出酒率的影響

圖10液料比B和發(fā)酵溫度D交互作用等高線呈現(xiàn)橢圓形,表明二者交互作用對(duì)出酒率影響顯著[19]。出酒率隨液料比B 和發(fā)酵溫度D 的增加呈先增后減變化。液料比B 為1.4～1.6，發(fā)酵溫度D 為27.5～28.5 ℃水平區(qū)間時(shí)，可顯著提高出酒率。

圖10 液料比發(fā)酵溫度的交互作用對(duì)出酒率的影響

圖11 發(fā)酵時(shí)間C 和發(fā)酵溫度D 的交互作用可知，出酒率隨發(fā)酵時(shí)間C、發(fā)酵溫度D 的增加呈先增后減變化，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間C 為6.7～7.2 d，發(fā)酵溫度D 為27.5～28.5 ℃水平區(qū)間時(shí)，出酒率較高，從而提高出酒率。

為進(jìn)一步準(zhǔn)確確定全局最優(yōu)解，以出酒率最大為優(yōu)化目標(biāo)，根據(jù)Design-Expert 8.0.6 軟件運(yùn)行結(jié)果[20]，在菌種接種量0.512%，液料比1.553，發(fā)酵時(shí)間6.954 d，發(fā)酵溫度27.863 ℃時(shí)，出酒率預(yù)測50.329%。

2.3.4 最優(yōu)工藝條件試驗(yàn)驗(yàn)證

根據(jù)軟件預(yù)測結(jié)果，結(jié)合實(shí)際工藝設(shè)置的可行性，為了驗(yàn)證可靠性，按照上述最佳工藝調(diào)整試驗(yàn)實(shí)際方案[21]為：菌種接種量0.5%，液料比1.5，發(fā)酵時(shí)間7 d，發(fā)酵溫度28 ℃，平行3 次結(jié)果顯示：平均出酒率為50.36%，平均感官評(píng)分為90 分。實(shí)際值與預(yù)測值相差不大，表明基于該響應(yīng)面模型分析優(yōu)化出酒率的方法有效可行。

3 結(jié)論

以糖化發(fā)酵劑、菌種接種量、液料比、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度對(duì)紅稗米酒出酒率、感官品質(zhì)的影響進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)，得到紅稗米酒的最佳工藝條件為：糖化發(fā)酵劑為笑仙甜酒曲Q303，菌種接種量0.5 %、液料比150 %、發(fā)酵時(shí)間7 d、發(fā)酵溫度28 ℃，在此工藝條件下獲得的產(chǎn)品出酒率50.36 %，酒精度7.3 %vol，感官評(píng)價(jià)90 分，總糖含量128.14 mg/mL，總酸含量為1.95 g/L，酒香濃郁、光澤透明、口感協(xié)調(diào)，符合T/GZSX 017—2020 發(fā)酵型米酒理化要求。紅稗米酒的研究開發(fā)不僅提高了紅稗的市場價(jià)值，帶來一定的經(jīng)濟(jì)效益，同時(shí)它作為低度型保健酒的定位也迎合了大多數(shù)消費(fèi)者需求，具有一定的市場銷售潛力[2]。