田文杰 ，侯瑞澤，杜澤光，李改珍，侯雷平，李梅蘭*

（1.山西省曲沃縣智慧菜谷發(fā)展服務中心，山西 曲沃 043400；2.山西農業(yè)大學園藝學院，山西 太谷 030801）

轉錄因子是一種可以與DNA 特異性結合，保證基因以特定的強度在特定的時空表達，從而進一步調控基因轉錄的蛋白質，其在植物生長發(fā)育、細胞周期調控、環(huán)境應答等過程中扮演著重要角色[1～3]。鋅指（zinc finger，ZF）蛋白最早發(fā)現(xiàn)于非洲爪蟾卵母細胞ⅢA，是一類具有鋅指結構域的、對基因調控起重要作用的轉錄因子家族[4]。鋅指結構域由半胱氨酸（Cys）和/或組氨酸（His）組成，通過鋅離子形成“指”狀四面體結構，因而將含有這種結構的蛋白質統(tǒng)稱鋅指蛋白。根據(jù)其結構和功能的不同，鋅指蛋白可分為大約14 個基因家族[5]，包括WRKY 和AP2/ERF 等基因家族，其功能也涉及DNA 識別、RNA 包裝、細胞凋亡等眾多領域，是植物已知較大的轉錄因子家族之一[6]。根據(jù)鋅指結構序列和功能的差別，又可以將鋅指蛋白分為十大類——C2H2、C2C2、C2HC、C2HC5、C3H、C3HC4、C4、C4HC3、C6和C8，其中C3H（CCCH） 型鋅指蛋白占比僅0.8%[7，8]。近年來，越來越多的研究表明，C3H 型鋅指蛋白在調節(jié)植物生長發(fā)育以及脅迫響應中起著重要作用。

C3H 型鋅指蛋白，其特征是含有一個或多個由3個Cys（C）和一個His（H）殘基構成的鋅指基序[9]，現(xiàn)對其定義為C-X4-15-C-X4-6-C-X3-H，X 代表任何氨基酸[10，11]。而在植物中，C-X7/8-C-X5-C-X3-H 基序更為常見[12]。區(qū)別于其他類型的鋅指蛋白，C3H 型鋅指蛋白已被廣泛證明是具有RNA 加工作用的RNA 結合蛋白[13]。目前，在擬南芥中已經鑒定出68 個C3H 型鋅指蛋白家族成員[14]，分為11 個亞族，其功能涉及到擬南芥生長發(fā)育的多個階段。如，PEI1是一種胚胎特異性轉錄因子[15]，可在胚胎頂端區(qū)域作用于擬南芥胚胎的發(fā)生過程。HUA1 蛋白是一個可以參與一種新的花調節(jié)機制的RNA 結合蛋白[16]，通過與AGAMOUSpre-mRNA 結合來調節(jié)花形態(tài)的發(fā)生。FES1 可以與FRI 形成轉錄復合體作用于開花調節(jié)因子FLC，從而提高擬南芥的越冬活性[17]。而在另一種模式作物水稻中，共鑒定出67 個C3H 型鋅指蛋白家族成員，分屬8 個亞族[18]。水稻C3H 鋅指蛋白主要參與水稻的生長發(fā)育和脅迫響應，其中OSDOS 蛋白可以整合發(fā)育信號參與茉莉酸途徑以延緩衰老[19]。SAW1可以調節(jié)水稻中赤霉素的穩(wěn)態(tài)和花藥的發(fā)育[20]?？梢?，C3H 型鋅指蛋白具有重要的研究價值。

普通白菜（Brassica campestrisL. ssp.chinensisMakino），又稱小白菜，屬十字花科蕓薹屬植物[21]，是維生素頗為豐富的蔬菜之一，因而受到人們的廣泛喜愛。但其是種子春化型作物，在春季易產生先期抽薹的現(xiàn)象，影響產品質量。因此，培育耐抽薹品種，使作物在合適的時間抽薹開花，是重要的研究內容。但截至目前，在普通白菜中有關C3H 型鋅指蛋白的研究還較少。為了全面了解這一新興RNA 結合蛋白家族在普通白菜中的作用，利用生物信息學技術對普通白菜全基因組進行鑒定，分析其成員的蛋白理化性質、系統(tǒng)進化和染色體的分布等，并對其在不同時期的表達模式進行分析，旨為進一步了解C3H 類鋅指蛋白在普通白菜中的功能奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 普通白菜C3H 基因家族鑒定及蛋白質理化性質分析

在擬南芥官網TAIR（https：//www.arabidopsis.org/）上獲取已知C3H 基因家族成員蛋白質序列的FASTA格式，以其作為模板，利用TBtools 的Blast 功能（Evalue 值設置為10-5） 將其與白菜數(shù)據(jù)庫NHCCDB（http：//tbir.njau.edu.cn/NhCCDbHubs/index.jsp） 中下載的普通白菜基因組進行比對（Brassica campestris（syn.Brassica rapa）ssp.chinensis（Cultivar NHCC001）v1.0 Genome） 獲取候選基因，通過NCBI 上（CDsearch）對候選基因的保守結構域進行預測，篩選得到含有C3H 類結構域的成員，然后按其染色體測序順序依次命名，并在在線網站ExPASy（https：//www.expasy.org/）上對其蛋白質的理化性質進行分析。

1.2 普通白菜C3H 基因染色體定位

從NHCCDB 上獲取基因的染色體位置信息，利用Tbtools 軟件對其進行可視化。

1.3 普通白菜C3H 基因家族系統(tǒng)進化樹構建及共線性分析

利用MEGA7.0 軟件對普通白菜和擬南芥2 個物種的C3H 蛋白序列進行進化樹構建，采用最大似然法（設置Bootstrap 值為1 000，其余參數(shù)按照默認設置），保存Newick 結果文件，并通過iTOL 在線網站（https：//itol.embl.de/）進行美化。

利用Tbtools 軟件和Mcscan 功能對普通白菜物種內的C3H 成員進行共線性分析，并對所得數(shù)據(jù)進行可視化。

1.4 普通白菜C3H 基因家族保守基序及基因結構分析

通過Tbtools 軟件分析BrcC3H 成員的保守基序（將最大基序檢索值設置為10，其他參數(shù)默認，得到xml 格式結果文件）。將普通白菜的gff 文件、保守基序xml 格式預測文件結合1.1 CD-search 預測的保守結構域（Domain） 文件、1.3 Newick 結果文件在Tbtools 軟件上進行一體可視化。

1.5 普通白菜C3H 基因表達模式分析

根據(jù)本課題組的普通白菜的轉錄組數(shù)據(jù)，對普通白菜C3H 家族基因不同時期的表達情況進行分析。

2 結果與分析

2.1 普通白菜C3H 類鋅指蛋白基因家族成員鑒定、染色體定位和理化性質分析

通過擬南芥C3H 類鋅指蛋白基因家族68 個成員的蛋白序列，在Tbtools 上進行Blast 同源比對，并通過Interpro 和Smart 驗證其蛋白序列結構域，最終鑒定到84 個C3H 蛋白，并根據(jù)其在染色體中的順序命名為BrcC3H1～BrcC3H84（表1）。對蛋白質理化性質進行預測發(fā)現(xiàn)，C3H 蛋白的氨基酸數(shù)目為156～1 542 個，其中，BrcC3H10 的氨基酸數(shù)目最少，BrcC3H2 的氨基酸數(shù)目最多；相對分子量為17.26～172.69 ku，差異明顯；等電點為4.96～10.84，其中堿性蛋白居多，共49 個，酸性蛋白35 個；不穩(wěn)定系數(shù)為25.57～104.91，除BrcC3H3、BrcC3H10、BrcC3H16、BrcC3H31、BrcC3H42 和BrcC3H77 為穩(wěn)定蛋白外，其他蛋白均不穩(wěn)定；親水性均為負值，表明該家族蛋白均是親水性蛋白。

表1 C3H 基因家族蛋白質理化性質分析Table 1 Analysis of physical and chemical properties of C3H gene family proteins

續(xù)表

染色體定位結果顯示，普通白菜84 條C3H 基因不均勻地分布在10 條染色體上（圖1），1 條定位未知。其中，定位在A03 號染色體上的基因最多，有15 個；定位在A02、A04 號染色體上的基因最少，各有5 個。

2.2 普通白菜C3H 類鋅指蛋白基因家族系統(tǒng)進化樹及共線性分析

為了更好地了解C3H 類鋅指蛋白基因家族的特性，采用最大似然法，對普通白菜C3H 家族的84 個成員蛋白進行聚類分析，并參考擬南芥C3H 亞家族的分類對普通白菜C3H 成員進行分類。聚類分析結果（圖2） 顯示，普通白菜C3H 家族可分為4 個亞家族——C3H-A、C3H-B、C3H-C 和C3H-D，成員數(shù)量分別為16 個、21 個、22 個和23 個，其中D 家族成員最多。共線性分析結果（圖3）顯示，65 對染色體片段發(fā)生復制事件，說明基因復制是造成C3H 家族進化的重要原因。

圖2 普通白菜C3H 類鋅指蛋白的系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of C3H zinc finger proteins in B. campestris ssp. chinensis

圖3 普通白菜C3H 家族成員的共線性分析Fig.3 Colinear analysis of C3H family members in B. campestris ssp. chinensis

2.3 普通白菜C3H 類鋅指蛋白基因家族保守基序及基因結構分析

通過在線網站MEME 對84 個C3H 蛋白序列進行保守基序分析（表2），共鑒定出10 種不同類型的Motif，將其命名為Motif1～Motif10。所有成員均包含C3H 型Motif，其中C-X8-C-X5-C-X3-H 型居多，其次是C-X7-C-X5-C-X3-H 型，二者合計占總數(shù)的一半以上，說明C-X8/7-C-X5-C-X3-H 型是普通白菜中C3H 型蛋白的主要形式。通過對保守基序結果進行可視化分析，發(fā)現(xiàn)84 個成員各包含1～7 個保守基序，4 個亞族間保守基序差異明顯，其中，C3H-A 亞族主要包含Motif 1、Motif 2、Motif 4、Motif 8 和Motif 9，C3H-B 亞族主要包含Motif 2 和Motif 7，C3H-C 亞族主要包含Motif 3、Motif 5、Motif 6、Motif 7 和Motif 10，C3H-D 亞族主要包含Motif 2 和Motif 7，而不同亞族內基序保守。

表2 C3H 基因家族蛋白質保守基序分析Table 2 Conservation motif analysis of C3H gene family proteins

通過NCBI 上的CD-search 功能對普通白菜84 個C3H 家族成員的結構域進行分析，發(fā)現(xiàn)所有蛋白均包含C3H 型結構域（圖4），除此之外，還包含多種其它結構域，說明普通白菜該家族成員功能比較廣泛。其中根據(jù)亞族的不同又各有特征：C3H-A 亞族成員多數(shù)包含Ank（錨蛋白，Ankyrin）；C3H-B 亞族成員部分包含YTH1（YT521B homology）；C3H-C 亞族成員多數(shù)包含重復的C3H 型結構域；C3H-D 亞族成員少數(shù)包含KH（K-homology）結構域，同時RRM（RNA recognition motif）結構域在各亞族里較為常見。

圖4 普通白菜C3H 類鋅指蛋白基因家族保守基序（A）及保守結構域（B）Fig.4 Conservative motifs and domains of C3H zinc finger protein gene family in B. campestris ssp. chinensis

為了進一步了解普通白菜C3H 家族特征，對84個基因的基因結構進行分析，結果（圖5）表明，普通白菜C3H 家族成員基因長度差異明顯，基因結構也有所區(qū)別。普通白菜C3H 家族基因包含CDS 1～14 個，其中CDS 數(shù)量為1 個和7 個的居多，分別有15個和18 個，合計占成員總數(shù)的39.3%。

圖5 普通白菜C3H 類鋅指蛋白基因家族的基因結構Fig.5 Gene structure of C3H zinc finger protein gene family in B. campestris ssp. chinensis

2.4 普通白菜C3H 類鋅指蛋白基因不同時期表達模式分析

為研究普通白菜C3H 基因在普通白菜花芽分化不同階段的表達特性，利用普通白菜不同時期莖尖的轉錄組數(shù)據(jù)進行分析，結果（圖6）顯示，有69 個普通白菜C3H 基因在花芽分化不同階段均有表達，但不同時期的表達差異明顯，其中有10 個BrcC3H 基因在花芽分化臨界期有高表達、在花芽分化中后期表達降低，如BrcC3H11、BrcC3H18、BrcC3H23、BrcC3H27、BrcC3H38和BrcC3H52，猜測其可能參與普通白菜花芽的形成。在花芽分化臨界（S0）、花芽分化1 級（S1）和花芽分化3 級（S3）時期高表達的普通白菜C3H 基因相對較少，其中BrcC3H59、BrcC3H6和BrcC3H61分別為這3 個時期差異表達最顯著的基因，猜測他們可能對花芽分化的進程具有促進作用。

圖6 普通白菜C3H 類鋅指蛋白基因家族基因在花芽分化不同時期莖尖表達情況Fig.6 Expression of C3H zinc finger protein gene family genes at different stages of flower bud differentiation in stem tips of B. campestris ssp. chinensis

3 結論與討論

隨著植物全基因組測序的不斷完成，C3H 類鋅指蛋白基因家族已經在水稻、玉米、擬南芥等多種作物中被鑒定出來。本研究通過生物信息學方法比對擬南芥C3H 類鋅指蛋白基因家族，在普通白菜中鑒定出84個成員。該數(shù)據(jù)多于水稻（67 個）、玉米（68 個）[22]和擬南芥（68 個）中的數(shù)量，同樣數(shù)量較多的還有同為蕓薹屬的白菜（117 個）[23]和甘藍（110 個），說明C3H類鋅指蛋白基因家族在不同物種中存在差異。

通過基因定位，將普通白菜C3H 基因定位于10條染色體上，且大部分染色體上定位到5～9 條染色體，其中在染色體A03 和A05 上分布較多，分別有15 條和12 條，同時發(fā)現(xiàn)有部分普通白菜C3H 基因分布較為密集，可能在生物學上發(fā)揮相似功能。對普通白菜C3H 類鋅指蛋白基因家族進化研究表明，普通白菜C3H 類鋅指蛋白基因家族可分為3 個亞族，且各亞族間差異明顯，在各亞族發(fā)現(xiàn)有部分基因序列相似度較高，猜測是基因進化中序列片段復制的的結果。共線性分析結果印證了我們的猜想，在普通白菜基因組的10 條染色體上均檢測到大量基因同源，這也與之前白菜進化中發(fā)生多倍體化的研究相符合。

目前，對C3H 型鋅指蛋白的Motif 模型定義多為C-X4-15-C-X4-6-C-X3-H 的形式。同時，由于2 個Cys（C）中的氨基酸種類與數(shù)量不盡相同，造成了成員間的差異性[24]。本研究從普通白菜C3H 基因家族成員中鑒定了10 種Motif，其中C-X7-C-X5-C-X3-H和C-X8-C-X5-C-X3-H 是普通白菜C3H 基因Motif的主要形式，二者占總數(shù)的比例分別為57.14%和40.48%，合計占比達到97.62%，較擬南芥（82.24%）、玉米（79.44%）和水稻（78.67%）占比更高，同時還發(fā)現(xiàn)有C-X11-C-X5-C-X3-H 和C-X8-C-X4-C-X3-H 型的Motif，這在其他植物中比較少見。結構域研究發(fā)現(xiàn)，除C3H 結構域外，還存在著多種其他類型的結構域，如Ank 結構域、KH 結構域和RRM 結構域等，這一現(xiàn)象并非偶然，在其它物種如甘藍型油菜[25]和煙草[26]中的C3H 家族成員中也發(fā)現(xiàn)有類似的結構域，這些結構域參與DNA 或RNA 的結合、脅迫響應和開花調節(jié)等多項生物進程[27～32]，多樣的結構域也說明不同物種的C3H 家族成員有著較為廣泛的功能，以幫助植物適應各種環(huán)境[30，31]。

開花是植物重要的生物學過程，擬南芥C3H 型鋅指蛋白HUA1 蛋白可以作為RNA 結合蛋白參與花的發(fā)育，并通過與AGAMOUSpre-mRNA 結合來調節(jié)花形態(tài)的發(fā)生。另一個擬南芥C3H 型鋅指蛋白FES1，可以與FRI 形成轉錄復合體調節(jié)開花調節(jié)因子FLC的表達，從而提高擬南芥的越冬活性。同時在C3H 成員中鑒定到的多種其他結構域也被證明具有調節(jié)開花相關的功能[32，33]，故結合轉錄組數(shù)據(jù)對普通白菜C3H基因花芽分化不同階段的表達特性進行分析。結果顯示，在鑒定出的84 個成員中，有69 個普通白菜C3H 基因在花芽分化不同階段均有表達；在未表達的15個基因中，有4 個基因（BrcC3H54、BrcC3H68、BrcC3H69和BrcC3H71）同屬C3H-B 亞族，且其親緣關系接近，同時其結構域均同時存在有C3H 結構域和YTH1 結構域，猜測C3H 結構域和YTH1 結構域同時存在可能影響普通白菜C3H 基因在花芽分化時期的表達。

本研究對普通白菜C3H 類鋅指蛋白基因家族進行了鑒定與分析，共鑒定到84 個成員，并利用生物信息學分析不同家族成員的理化性質、染色體位置、保守基序、基因結構等，發(fā)現(xiàn)其均有差異，進化樹分析結果表明普通白菜C3H 家族同一亞族成員可能有類似的功能。通過對不同成員在花芽分化不同時期的表達模式進行分析，發(fā)現(xiàn)有10 個BrcC3H基因在花芽分化臨界期有高表達，且在花芽分化中后期表達降低，其中BrcC3H23、BrcC3H38和BrcC3H52的表達特征尤為顯著，猜測其可能參與普通白菜花芽的形成。BrcC3H48、BrcC3H6和BrcC3H61可能對花芽分化的進程具有促進作用。本研究為后續(xù)了解普通白菜C3H類鋅指蛋白基因家族成員的功能提供了重要參考依據(jù)。