田艷杰, 石愛民, 劉 哲, 王 強(qiáng)1,, 劉紅芝1,, 代 蕾1,

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院1,青島 266109)

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所;農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品加工綜合性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2,北京 100193)

(青島特種食品研究院3,青島 266109)

原花青素又稱縮合單寧,是由黃烷-3-醇單體縮合形成不同聚合度的黃酮類化合物,廣泛存在于葡萄籽、藍(lán)莓、花生紅衣等植物中,具有抗氧化、抗菌抗炎、抗心血管疾病,抗腫瘤等多種生物活性[1-5]。由于其含有多個(gè)酚羥基,研究表明其抗氧化比VC和VE更有效[6],因此常被用做天然的抗氧化劑,應(yīng)用于食品、藥品、化妝品等多方面。但原花青素容易受到光、熱、pH等因素的影響,導(dǎo)致其生物利用度比較低,進(jìn)而影響了其生物活性的發(fā)揮,因此研究人員開始利用納米顆粒[7]、乳液[8]、微膠囊[9,10]、脂質(zhì)體[11]等進(jìn)行包埋,以提高原花青素穩(wěn)定性進(jìn)而提高其生物利用度。

脂質(zhì)體是一種由磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)組成的球形囊泡,具有疏水尾部和親水頭部,可以同時(shí)運(yùn)載親水性物質(zhì)和親脂性物質(zhì)。脂質(zhì)體可將親水分子封裝在內(nèi)部水性內(nèi)腔中,其粒徑在幾十納米到幾微米之間,具有生物相容性好、生物利用度高、提高藥物穩(wěn)定性、促進(jìn)吸收等優(yōu)點(diǎn),因此廣泛應(yīng)用于食品、化妝品等行業(yè)[12-14]。徐素吟等[15]通過優(yōu)化脂質(zhì)體包埋紅曲色素,包埋率最高為(49±2.6)%,研究發(fā)現(xiàn)包埋后的紅曲色素穩(wěn)定性顯著提高;Lee等[16]采用開發(fā)了花青素脂質(zhì)體制劑,對比發(fā)現(xiàn)通過脂質(zhì)體可以增強(qiáng)花青素的皮膚滲透性且可以保持較高的抗氧化活性。脂質(zhì)體對不穩(wěn)定的色素具有一定的保護(hù)作用且效果較為明顯,因此被廣泛研究。

目前研究的原花青素脂質(zhì)體過程中多使用乙醚等有機(jī)試劑或添加合成小分子乳化劑,會(huì)對人體產(chǎn)生一定危害。本研究優(yōu)點(diǎn)在于沒有使用乙醚和乳化劑制備原花青素脂質(zhì)體,通過脂質(zhì)體增加原花青素的穩(wěn)定性,進(jìn)而提高其生物利用度。通過對原花青素脂質(zhì)體制備工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,以包封率為研究指標(biāo),得到最優(yōu)制備參數(shù),通過粒徑、透射電子顯微鏡(TEM)和傅里葉紅外光譜等對脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)進(jìn)行表征,為原花青素脂質(zhì)體的制備和應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

主要材料:原花青素(純度>95%)、卵磷脂(磷脂酰膽堿>90%)、膽固醇(純度>95%)。無水乙醇(分析純)。

1.2 儀器與設(shè)備

EYELA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,KQ-500DE型超聲波清洗機(jī),3K-15型高速冷凍離心機(jī),UV-2550型紫外可見分光光度計(jì),Mastersizer-3000 型馬爾文粒度儀,JEM-1400型透射電子顯微鏡。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 原花青素脂質(zhì)體的制備

參考王蕾等[17]略作修改制備原花青素脂質(zhì)體。稱取卵磷脂和膽固醇,加入無水乙醇,待兩者溶解,加入一定質(zhì)量濃度的原花青素溶液,超聲,得到均一的乳液,40 ℃去除乙醇,膠態(tài)后加入一定量的pH為7的PBS緩沖溶液,蒸發(fā)得到水性懸浮液,得到原花青素脂質(zhì)體粗懸液。超聲處理2 min,即得到分散較好的原花青素脂質(zhì)體。

1.3.2 原花青素脂質(zhì)體包封率測定

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。用PBS緩沖溶液配置1 mg/mL的原花青素,然后進(jìn)行稀釋成梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液,于紫外分光光度計(jì)280 nm處測吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以不同濃度的原花青素標(biāo)準(zhǔn)溶液為橫坐標(biāo),以吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到濃度(x)與吸光度(y)標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.014 5x+0.010 8(R2=0.999),表明原花青素質(zhì)量濃度在20～80 μg/mL線性關(guān)系良好。

包封率測定。參考王利媛等[18]方法采用超速離心法測定原花青素脂質(zhì)體包封率,將原花青素脂質(zhì)體于4 ℃下,經(jīng) 12 000 r/min 的高速離心30 min后,取上清液測定脂質(zhì)體的包封率(W游離)。計(jì)算公式如下:

包封率=(W總-W游離)/W總×100%

式中:W總為原花青素脂質(zhì)體中添加原花青素的總含量;W游離為原花青素脂質(zhì)體中未包埋的游離原花青素含量。

1.3.3 原花青素脂質(zhì)體單因素實(shí)驗(yàn)

根據(jù)1.3.1方法制備原花青素脂質(zhì)體,考察膽固醇/卵磷脂、原花青素質(zhì)量濃度(mg/mL)、水相/有機(jī)相對包封率的影響。

1.3.3.1 卵磷脂與膽固醇的質(zhì)量比對質(zhì)體包封率的影響

固定原花青素質(zhì)量濃度、有機(jī)相/水相為一定值,將卵磷脂與膽固醇的質(zhì)量比值設(shè)定為1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6制備原花青素脂質(zhì)體,測定不同膽固醇/卵磷脂下的脂質(zhì)體的包封率。

1.3.3.2 原花青素質(zhì)量濃度對脂質(zhì)體包封率的影響

固定膽固醇/卵磷脂、有機(jī)相/水相為一定值,將原花青素質(zhì)量濃度設(shè)定為0.25、0.5、1、1.5、2 mg/mL制備原花青素脂質(zhì)體,測定不同原花青素質(zhì)量濃度下的脂質(zhì)體的包封率。

1.3.3.3 水相與有機(jī)相的體積比對脂質(zhì)體包封率的影響

固定膽固醇與卵磷脂的質(zhì)量比、原花青素質(zhì)量濃度為一定值,將水相比有機(jī)相的體積比設(shè)定為1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6制備原花青素脂質(zhì)體,測定不同水相與有機(jī)相的體積比下脂質(zhì)體的包封率。

1.3.4 原花青素脂質(zhì)體響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

以包封率為響應(yīng)值,在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,基于Box-Behnken響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案以卵磷脂與膽固醇的質(zhì)量比(A)、原花青素質(zhì)量濃度(B)、有機(jī)相與水相的體積比(C)為自變量,以原花青素的包封率為指標(biāo),進(jìn)行三因素三水平下的優(yōu)化,以確定原花青素脂質(zhì)體的最佳制備工藝參數(shù),具體如表1所示。

表1 原花青素脂質(zhì)體響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平

1.3.5 原花青素脂質(zhì)體理化性質(zhì)

1.3.5.1 微觀結(jié)構(gòu)及粒徑

TEM觀察:取一滴原花青素脂質(zhì)體于蠟板上,以銅網(wǎng)帶膜的一面蘸取少量,濾紙吸取多余液滴,自然晾干后,體積分?jǐn)?shù)為2%的磷鎢酸染色 3 min,重復(fù)染色 3 次后,采用透射電鏡觀察并拍照。

粒徑:參考鄭景霞等[19]方法研究將原花青素脂質(zhì)體稀釋10倍后,采用馬爾文粒度儀測定其粒徑分布。測試角度 173°,測試溫度為(25±0.1)℃,測試次數(shù)為3次。

1.3.5.2 FTIR

參考宋恭帥等[20]方法紅外光譜測定采用溴化鉀(KBr)壓片法,稱取適量原花青素、空白脂質(zhì)體、原花青素脂質(zhì)體凍干粉與溴化鉀粉末混合,在400～4 000 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行紅外掃描。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,使用SPSS 21.0和Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,使用Origin 2021軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 原花青素脂質(zhì)體單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 膽固醇/卵磷脂對脂質(zhì)體包封率的影響

膽固醇的含量會(huì)影響原花青素脂質(zhì)體的包封率,這是由于膽固醇具有調(diào)節(jié)膜流動(dòng)性以及穩(wěn)定性的作用。隨著膽固醇/卵磷脂比值的增大,原花青素脂質(zhì)體包封率逐漸增大,在m膽固醇∶m卵磷脂為1∶4時(shí)包封率達(dá)到最大,此時(shí)包封率為(80.33±1.16)%;比值繼續(xù)增大時(shí),包封率逐漸下降。大豆卵磷脂含量較低時(shí),雙分子層膜不易形成或形成不牢固,不利于原花青素的包封;而卵磷脂含量較高時(shí),脂質(zhì)體流動(dòng)性較強(qiáng)且穩(wěn)定性差,使脂質(zhì)體容易重新聚集,導(dǎo)致原花青素的泄漏[21]。

2.1.2 原花青素質(zhì)量濃度對脂質(zhì)體包封率的影響

考察原花青素質(zhì)量濃度對脂質(zhì)體包封率的影響,結(jié)果如圖1a所示。包封率隨原花青素濃度的增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢,在質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL時(shí)包封率達(dá)到最大,為(89.55±0.62)%。分析原因可能是脂質(zhì)體的內(nèi)部囊泡空間是有一定限度的,當(dāng)原花青素質(zhì)量濃度較高時(shí)超過脂質(zhì)體的包埋限度,出現(xiàn)原花青素過量現(xiàn)象,導(dǎo)致其包封率的減小[22]。

圖1 各因素對原花青素脂質(zhì)體包封率的影響

2.1.3 水相/有機(jī)相對脂質(zhì)體包封率的影響

考察了水相/有機(jī)相對脂質(zhì)體包封率的影響,結(jié)果如圖1b所示。包封率隨水相/有機(jī)相體積比值的變化呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢,當(dāng)水相與有機(jī)相體積比值為1∶3時(shí),包封率出現(xiàn)最大值。分析原因可能是當(dāng)水相較高時(shí),不能將膜材溶解完全,無法形成穩(wěn)定的乳液,容易使原花青素泄漏;水相較低時(shí),不利于脂質(zhì)體雙分子層膜結(jié)構(gòu)的形成,導(dǎo)致原花青素包埋量降低[23]。

2.2 原花青素脂質(zhì)體響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)分析

基于單因素實(shí)驗(yàn)進(jìn)行Box-Behnken實(shí)驗(yàn),研究卵磷脂與膽固醇的質(zhì)量比、原花青素質(zhì)量濃度、有機(jī)相與水相的體積比兩兩交互作用對原花青素脂質(zhì)體包封率的影響,以確定最佳制備工藝參數(shù)(見表2)。

表2 三因素三水平Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)與結(jié)果

采用Design-expert軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合,包封率(y)對A因素(x1)、B因素(x2)、C因素(x3)的二次多元回歸方程為:y=88.10+1.93x2-0.75x3+0.94x1x3+1.32x2x3-3.31x12- 3.24x22-1.90x32。由方差分析可知,包封率與3個(gè)因素之間的線性關(guān)系明顯,擬合模型F值為28.79,該模型回歸顯著(P=0.000 1<0.01),表明模型極顯著;矢擬項(xiàng)檢驗(yàn)F值為1.47,矢擬項(xiàng)不顯著(P=0.349 5>0.05);該模型R2=0.973 7,說明模型能夠解釋97.37%,響應(yīng)值Rd=0.939 9,表明該模型擬合效果良好,自變量與包封率之間線性關(guān)系顯著,可用于包封率的理論預(yù)測。模型變量中原花青素質(zhì)量濃度(因素B)對包封率的影響表現(xiàn)為極顯著(P<0.01),有機(jī)相與水相體積比表現(xiàn)為顯著(P<0.05),3個(gè)因素對包封率的影響大小為:原花青素的濃度(因素B)>有機(jī)相/水相(因素C)>卵磷脂/膽固醇(因素A)。

根據(jù)二次回歸方程擬合結(jié)果,固定一個(gè)因素水平分析其他兩個(gè)因素的交互作用[24]。交互作用的強(qiáng)弱可以用等高線的形狀來判斷,等高線為圓形時(shí)說明兩種因素交互作用不顯著,為橢圓形時(shí)交互作用顯著。結(jié)合表3方差分析,卵磷脂/膽固醇與原花青素質(zhì)量濃度交互作用對包封率的影響不顯著,卵磷脂/膽固醇與有機(jī)相/水相,原花青素質(zhì)量濃度與有機(jī)相/水相的交互作用對包封率的影響顯著,其中原花青素的濃度與有機(jī)相/水相的交互作用對包封率的影響更大。

表3 包封率的回歸模型方差分析

驗(yàn)證實(shí)驗(yàn):通過Design-expert軟件進(jìn)行分析得到最佳工藝條件:卵磷脂與膽固醇的質(zhì)量比為3.94、原花青素質(zhì)量濃度為1.64 mg/mL、水相與有機(jī)相體積比2.88。在最優(yōu)工藝條件下制得的原花青素脂質(zhì)體包封率為(89.18±0.40)%,包封率較高,與理論值88.412%較為接近,表明模型的預(yù)測效果良好,適用于原花青素脂質(zhì)體制備工藝參數(shù)的優(yōu)化。

2.3 原花青素脂質(zhì)體的表征

2.3.1 微觀結(jié)構(gòu)

原花青素脂質(zhì)體肉眼觀察為粉色懸浮液,形態(tài)均一。透射電子顯微鏡觀察結(jié)果如圖2所示,原花青素脂質(zhì)體呈圓形或橢圓形微球體,表面較為圓整,顆粒之間的尺寸接近,大小較為均勻。透射電鏡下觀察可以觀察到原花青素脂質(zhì)體具有磷脂雙分子層結(jié)構(gòu),原花青素在透射電鏡中呈深黑色,可見原花青素嵌插或包封在納米脂質(zhì)體雙分子層膜中,這與陳瓊玲[25]的研究一致。如圖3所示,采用馬爾文粒度儀測得原花青素脂質(zhì)體平均粒徑為(190.14±8.23)nm,多分散性指數(shù)PDI結(jié)果顯示,PDI為0.45±0.05,透射電子顯微鏡顯示脂質(zhì)體粒徑與馬爾文粒度儀測量結(jié)果一致。

圖2 原花青素脂質(zhì)體及透射電鏡圖

圖3 原花青素脂質(zhì)體粒徑

2.3.2 FTIR

采用傅里葉變換紅外色譜測定原花青素、空白脂質(zhì)體和原花青素脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu),通過分析和對比樣品之間的變化,進(jìn)一步確定脂質(zhì)體對原花青素的包埋作用。原花青素、空白脂質(zhì)體和原花青素脂質(zhì)體的 FTIR 圖譜如圖4所示,原花青素在1 610、1 518、1 442、1 365、1 205、1 143、1 111、1 064 cm-1處顯示吸收帶,這些吸收帶分別是CC 伸縮振動(dòng)(芳香環(huán))、C—H 伸縮振動(dòng)(烷烴)、—C—O 伸縮振動(dòng)(醇類)、C—O—C伸縮振動(dòng)(醚)。在原花青素脂質(zhì)體的圖譜中,包埋前后發(fā)發(fā)現(xiàn)原花青素的一些吸收峰消失,分析原因可能是脂質(zhì)體與原花青素之間通過氫鍵、范德華力等相互作用導(dǎo)致特征峰消失,而特征峰減弱以及位移表明脂質(zhì)體對原花青素的包埋作用,以至于原花青素的某些特征峰消失[26]。

圖4 原花青素脂質(zhì)體紅外光譜圖

3 結(jié)論

原花青素具有多種生物活性,但存在穩(wěn)定性差,生物利用度低等缺點(diǎn),因此通過脂質(zhì)體進(jìn)行包埋,提高其生物利用度。以包封率為評價(jià)指標(biāo)進(jìn)行工藝參數(shù)的優(yōu)化,當(dāng)卵磷脂與膽固醇的比為3.94、原花青素質(zhì)量濃度為1.64 mg/mL、水相與有機(jī)相體積比為2.88時(shí),此時(shí)原花青素脂質(zhì)體的包封率為(89.18±0.40)%,具有較高的包封率;通過透射電鏡觀察脂質(zhì)體成球形,粒徑在(190.14±8.23)nm,FTIR結(jié)果顯示脂質(zhì)體成功將原花青素包埋,為原花青素在食品領(lǐng)域的開發(fā)和利用提供參考。