陳興浩，李 鑫，沈海瀟，張校培，3，徐麗娜，張鶴平，葛菲菲，楊顯超，劉 健，白藝蘭，王 建，楊德全，趙洪進(jìn)

（1. 河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，河北邯鄲 056038；2. 上海市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，上海 201103；3. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，安徽合肥 230031）

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）是到目前為止在分子檢測(cè)方面應(yīng)用最廣泛的病原體檢測(cè)技術(shù)，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、核酸濃度要求低等優(yōu)點(diǎn)，可對(duì)病原進(jìn)行定性與定量檢測(cè)，但其對(duì)設(shè)備要求高，操作較為繁瑣，目前只適用于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，無法進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)快速核酸檢測(cè)。而等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的出現(xiàn)打破了PCR無法進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)快速核酸檢測(cè)的現(xiàn)狀，與其他核酸擴(kuò)增技術(shù)相比，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、反應(yīng)時(shí)間短、操作簡(jiǎn)單、對(duì)儀器設(shè)備要求低、無需熱循環(huán)等優(yōu)勢(shì)[1]。對(duì)動(dòng)物疫病進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)快速核酸檢測(cè)，及時(shí)診斷動(dòng)物疫病，對(duì)于動(dòng)物疫病防控有重大意義。目前常用的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)為重組酶擴(kuò)增技術(shù)，其中包括重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)（recombinase polymerase amplification，RPA）、酶促重組等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（enzymatic recombinase amplification，ERA）、重組酶介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（recombinase aided amplification，RAA）、多酶恒溫核酸快速擴(kuò)增技術(shù)（multienzyme isothermal rapid amplification，MIRA）。本文從原理及應(yīng)用等方面，對(duì)這幾種重組酶擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行綜述，以期為重組酶擴(kuò)增技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展與應(yīng)用提供參考。

1 重組酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)概述

1.1 技術(shù)原理

RPA是以T4噬菌體核酸復(fù)制機(jī)制為原理，通過重組酶蛋白（uvsX）、單鏈結(jié)合蛋白（gp32）和DNA聚合酶（Bsu）的作用，在體外完成核酸的恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)[2]。RPA反應(yīng)原理：第一，在腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）參與下，重組酶分別與上下游引物結(jié)合形成重組酶-引物復(fù)合體；第二，該復(fù)合體掃描雙鏈DNA模板，并識(shí)別與引物同源的靶序列；第三，定位至同源靶序列后，重組酶解開雙鏈結(jié)構(gòu)，并促使引物與模板進(jìn)行鏈交換，形成D環(huán)結(jié)構(gòu)，同時(shí)單鏈結(jié)合蛋白結(jié)合到被置換出的單鏈DNA上，穩(wěn)定D環(huán)結(jié)構(gòu)；第四，ATP水解供應(yīng)能量，改變重組酶-引物復(fù)合體構(gòu)象，重組酶解離暴露出引物的3'端，DNA聚合酶結(jié)合至引物上，啟動(dòng)DNA擴(kuò)增；第五，DNA聚合酶延伸過程中置換出的DNA單鏈與單鏈結(jié)合蛋白結(jié)合，穩(wěn)定單鏈結(jié)構(gòu)，上下游引物同步反應(yīng)，最終形成一個(gè)完整的擴(kuò)增子。ERA、RAA、MIRA的擴(kuò)增原理與RPA基本相似，其創(chuàng)新點(diǎn)分別為：ERA反應(yīng)所依賴的重組酶來源于低溫噬菌體，并且對(duì)特定位點(diǎn)氨基酸進(jìn)行替換，具有良好的擴(kuò)增速度和特異性[3]；RAA反應(yīng)所依賴的重組酶來源于細(xì)菌或真菌，具有更好的穩(wěn)定性[4]；MIRA對(duì)酶進(jìn)行了定點(diǎn)改造與修飾，使其酶體系效率更高，并對(duì)輔因子種類與濃度進(jìn)行了優(yōu)化，使其抗干擾能力與穩(wěn)定性更強(qiáng)。如果在RPA、ERA、RAA、MIRA體系中加入逆轉(zhuǎn)錄酶，還可用于RNA檢測(cè)。另外，在RPA、ERA、RAA、MIRA體系中加入熒光探針和核酸酶，便可進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)；若結(jié)合側(cè)向?qū)游黾夹g(shù)（LFD），則可實(shí)現(xiàn)可視化檢測(cè)[5]。

1.2 技術(shù)優(yōu)點(diǎn)

重組酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)反應(yīng)迅速，30 min內(nèi)可得出結(jié)果[6]；操作簡(jiǎn)便，無需復(fù)雜專業(yè)的實(shí)驗(yàn)室，非專業(yè)人員亦可完成樣本檢測(cè)；靈敏度可達(dá)100～101copies/反應(yīng)，引物結(jié)合熒光探針，特異性高；擴(kuò)增期間不需要復(fù)雜儀器，反應(yīng)溫度為25～42 ℃（表1）[7]；后續(xù)可以開發(fā)為熒光檢測(cè)試驗(yàn)、側(cè)流層析試紙條等快檢手段，可滿足不具備分子檢測(cè)技術(shù)的現(xiàn)場(chǎng)對(duì)動(dòng)物疫病進(jìn)行快速核酸檢測(cè)的需求。

表1 重組酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)總結(jié)及簡(jiǎn)稱

1.3 技術(shù)難點(diǎn)

瓊脂糖凝膠電泳成像在檢測(cè)前需要進(jìn)行產(chǎn)物純化；沒有PCR的熱循環(huán)來避免引物之間的結(jié)合，恒定溫度下反應(yīng)難以避免部分非特異性擴(kuò)增；擴(kuò)增引物長(zhǎng)度均要求30～35 bp，引物太短會(huì)影響特異性、靈敏度和擴(kuò)增速度，引物設(shè)計(jì)有難度[8]；RPA是英國(guó)TwistDx公司開發(fā)的技術(shù)，其成本極高，供貨周期長(zhǎng)，在國(guó)內(nèi)很難實(shí)現(xiàn)大面積應(yīng)用和量產(chǎn)；ERA、RAA、MIRA均為國(guó)內(nèi)開發(fā)的技術(shù)，具有自主專利，不必?fù)?dān)心在后期成品研發(fā)中觸及專利違規(guī)情況，在今后國(guó)內(nèi)乃至國(guó)際市場(chǎng)的競(jìng)爭(zhēng)中具有顯著優(yōu)勢(shì)，可以穩(wěn)定大批量生產(chǎn)，但市場(chǎng)認(rèn)知度還比較低，需要進(jìn)一步積累數(shù)據(jù)，引物設(shè)計(jì)上延續(xù)了RPA或RAA等技術(shù)的特點(diǎn)，需要較長(zhǎng)的引物或探針序列，不利于當(dāng)下PCR用戶的快速切換；4種技術(shù)靈敏度較高，因而容易受到氣溶膠污染而導(dǎo)致假陽性出現(xiàn)[9]。

2 重組酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)應(yīng)用研究進(jìn)展

2.1 病毒檢測(cè)

Liu等[10]建立了基于實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)的牛A群輪狀病毒（bovine rotavirus A，BRVA）RT-RPA檢測(cè)方法（real-time RT-RPA）和結(jié)合側(cè)流層析的RT-RPA檢測(cè)方法（LFD RT-RPA）。這兩種檢測(cè)方法均對(duì)BRVA具有高特異性，與其他引起牛腹瀉的病原體無交叉反應(yīng)。以BRVA標(biāo)準(zhǔn)RNA為模板，real-time RT-RPA和LFD RT-RPA的檢出限分別為1.4×102和1.4×101copies/μL。與實(shí)時(shí)熒光定量PCR相比，real-time RT-RPA和LFD RT-RPA的診斷特異性均為100%，診斷敏感性分別為98.39%和100%，kappa系數(shù)分別為0.985和1.000。

Wang等[11]建立了一種檢測(cè)H5亞型禽流感病毒（H5 subtype avian influenza virus）的逆轉(zhuǎn)錄重組酶輔助擴(kuò)增（RT-RAA）方法，其與新城疫病毒（NDV）、傳染性支氣管炎病毒（IBV）無交叉反應(yīng)，靈敏度為103copies/μL，特異性為100%。與已有的RT-qPCR方法比較，RT-RAA方法在420份禽類臨床樣本中的kappa系數(shù)為0.983，禽臨床樣本檢測(cè)靈敏度為97.26%，特異性為100%。

Wei等[12]成功構(gòu)建了用于豬細(xì)小病毒（porcine parvovirus，PPV）檢測(cè)的ERA-CRISPR/Cas12a方法，其檢出限為3.75×102copies/μL，與其他豬病病毒不發(fā)生交叉反應(yīng)，與qPCR數(shù)據(jù)的符合率為100%。

Chen等[13]采用等溫?cái)U(kuò)增-多酶恒溫快速擴(kuò)增技術(shù)（RT-MIRA）快速檢測(cè)嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2型（SARS-CoV-2），其檢測(cè)ORF1ab基因的95%檢出限為49.5 copies/mL，N基因的95%檢出限為48.8 copies/mL，與其他呼吸道病原體，如嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒（SARS-CoV）、中東呼吸綜合癥冠狀病毒（MERS-CoV）、甲型流感病毒、乙型流感病毒、人腺病毒、呼吸道合胞病毒、人副流感病毒沒有交叉反應(yīng)。對(duì)243份核酸樣本分別進(jìn)行RT-MIRA和qPCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)陽性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值均為100%；與qPCR比較，兩種方法的kappa系數(shù)為1.00。

此外許多研究者基于這幾種擴(kuò)增技術(shù)對(duì)其他病毒均建立了檢測(cè)方法（表2）。

表2 重組酶擴(kuò)增技術(shù)在病毒檢測(cè)方面的應(yīng)用

2.2 細(xì)菌檢測(cè)

Gumaa等[19]建立了針對(duì)布魯氏菌bp26基因IS711插入序列的結(jié)合側(cè)流層析試紙（LFD-RPAIS711）的SYBR-Green重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)，用于檢測(cè)來自不同類型家畜的布魯氏菌。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time PCR）、虎紅平板凝集試驗(yàn)（RBPT）對(duì)兩種RPA的敏感性和特異性進(jìn)行比較。結(jié)果顯示：real-time RPA和LFD RPA的檢出限分別為4 copies/μL和6 copies/μL；兩種方法分別在40 ℃和37 ℃條件下，20 min內(nèi)檢測(cè)到帶有目標(biāo)序列的6個(gè)菌落形成單位（CFU），與real-time PCR和PCR的結(jié)果沒有顯著差異；兩種方法均與流產(chǎn)衣原體、剛地弓形蟲、鼠傷寒沙門菌和大腸桿菌無交叉反應(yīng)。

杜秋明等[20]建立了用于檢測(cè)多殺性巴氏桿菌的RAA熒光檢測(cè)方法。該方法在39 ℃恒溫條件下20 min內(nèi)即可特異性檢出多殺性巴氏桿菌，與鴨疫里默氏桿菌、副豬嗜血桿菌、支原體、鏈球菌、大腸桿菌、附紅細(xì)胞體、新孢子蟲無交叉反應(yīng)，最低檢出限為10 copies/μL，組內(nèi)和組間重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)均小于10%。用該方法對(duì)45份臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)陽性率為33.33%，與熒光定量PCR方法檢測(cè)結(jié)果一致。

王淑娟等[21]采用MIRA熒光法，結(jié)合金屬有機(jī)骨架免疫磁珠富集功能，開發(fā)了大腸桿菌O157:H7快速富集和檢測(cè)方法。該方法檢測(cè)大腸桿菌O157:H7菌體的檢測(cè)限為1.18×105CFU/mL，菌體DNA檢測(cè)限為9 pg/μL，檢測(cè)過程可在20 min內(nèi)完成。47株菌（24株目標(biāo)菌和23株非目標(biāo)菌）的特異性驗(yàn)證結(jié)果與real-time PCR一致。

此外有許多研究者基于這幾種擴(kuò)增技術(shù)建立了其他細(xì)菌的檢測(cè)方法（表3）。

表3 重組酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在細(xì)菌檢測(cè)方面的應(yīng)用

2.3 寄生蟲檢測(cè)

Onchan等[26]建立了一種基于18S rRNA區(qū)域的RPA-LFD檢測(cè)方法，用于快速準(zhǔn)確檢測(cè)犬血液樣本中的巴貝斯蟲。該方法對(duì)犬巴貝斯蟲具有特異性，與其他寄生蟲無交叉反應(yīng)，在40 ℃條件下用時(shí)至少10 min，檢測(cè)限至少為22.5 copies/μL。利用該方法共檢測(cè)了30例臨床樣本，并與常規(guī)PCR（cPCR）進(jìn)行了比較，結(jié)果用RPA-LFD檢出陽性8例（26.67%），cPCR檢出陽性7例，RPA-LFD和cPCR的kappa系數(shù)＞0.9，檢測(cè)結(jié)果吻合度較高。

葉鈺瀅等[27]建立了一種用于快速檢測(cè)日本血吸蟲特異性基因片段的重組酶介導(dǎo)核酸等溫?cái)U(kuò)增核酸試紙條檢測(cè)方法。以重組質(zhì)粒為模板，建立的日本血吸蟲特異性基因片段核酸試紙條檢測(cè)方法最低檢測(cè)限為10 copies/μL；以成蟲基因組DNA為模板，最低檢測(cè)限為1 pg/μL。該方法檢測(cè)華支睪吸蟲、曼氏血吸蟲、十二指腸鉤口線蟲、埃及血吸蟲、巴貝斯蟲和衛(wèi)氏并殖吸蟲基因組DNA結(jié)果均為陰性。

2.4 其他微生物檢測(cè)

Xia等[28]采用RAA和LFD相結(jié)合的方法，建立了一種簡(jiǎn)單、快速、直觀的滑膜支原體（MS）RAA-LFD檢測(cè)方法。在38 ℃恒溫條件下，RAA可在20 min內(nèi)擴(kuò)增出目的基因，5 min內(nèi)LFD可觀察到擴(kuò)增產(chǎn)物，與雞敗血支原體（MG）、多殺性巴氏桿菌（P.multocida）、大腸桿菌（E.coli）、NDV、IBV、傳染性法氏囊病病毒（IBDV）和禽呼腸孤病毒（ARV）沒有交叉反應(yīng)。RAA-LFD法靈敏度高，檢測(cè)限為10 copies/μL，與常規(guī)PCR檢測(cè)結(jié)果符合率為95.3%，與實(shí)時(shí)定量PCR（qPCR）檢測(cè)結(jié)果符合率為98.4%。

Zhao等[29]建立了一種特異性檢測(cè)牛支原體DNA的RPA-LFD方法。該方法在39 ℃條件下30 min內(nèi)成功檢測(cè)到牛支原體DNA，每次反應(yīng)檢測(cè)限為20 copies。與qPCR方法比較，該方法特異性強(qiáng)，與其他牛病原體無交叉反應(yīng)；敏感性為99.00%，特異性為95.61%，kappa系數(shù)為0.902。

Jiao等[30]建立了一種檢測(cè)鸚鵡熱衣原體的RAALFD方法，其檢測(cè)靈敏度低至1×100copies/μL，與其他病原體無交叉反應(yīng)，在感染鸚鵡熱衣原體1 d后的小鼠糞便樣品中均檢出陽性。

3 展望

目前，等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)雖然存在著市場(chǎng)認(rèn)可度低、通量低、無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的難點(diǎn)，但相較于傳統(tǒng)的核酸擴(kuò)增技術(shù)來說，其具有操作簡(jiǎn)單快速、設(shè)備及學(xué)習(xí)成本低等優(yōu)勢(shì)，完全符合簡(jiǎn)單快速、低成本，不需專業(yè)實(shí)驗(yàn)人員，使用便攜式儀器的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)需求。等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)仍需改進(jìn)，比如在試劑穩(wěn)定性、通量等方面。隨著科技的不斷進(jìn)步，等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)也會(huì)愈發(fā)成熟，將會(huì)真正實(shí)現(xiàn)便攜式現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，更好地服務(wù)于動(dòng)植物檢疫乃至人類疫病防控。