岳 麗,王 卉,山其米克,再吐尼古麗·庫爾班,涂振東

(新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所,烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】甜高粱是一種能源作物和飼料作物,莖稈富含糖分,單產(chǎn)可達4～10 t/667m2,籽?？蛇_200～400 kg/667m2,葉蛋白是玉米葉的2倍,再生能力強,生物量是青貯玉米的2～3倍;具有適應(yīng)性強、耐旱耐熱、耐澇耐鹽堿和極端溫變等特點[1]。在我國西北、東北等地均有大面積種植,被廣泛用于動物飼料、生物質(zhì)能(乙醇、沼氣等)和生物基材等領(lǐng)域[2-3]。探究甜高粱青貯飼料中微生物的組成及多樣性對提升甜高粱飼料品質(zhì)具有重要意義。研究基于高通量測序的甜高粱青貯飼料中微生物群落、對青貯飼料的生產(chǎn)與貯藏具有實際意義。【前人研究進展】在干旱地區(qū),高粱每公頃產(chǎn)量高于玉米[4]。甜高粱40%以上的干物質(zhì)是由易發(fā)酵的糖組成[5],是一種優(yōu)質(zhì)的反芻動物的飼料來源,主要利用方式有青飼、干草和青貯。目前,多選擇青貯的方式對其進行發(fā)酵保存。青貯是一種新鮮飼料長期保存的儲存技術(shù),具有減少養(yǎng)分損失、增加飼草的利用價值、調(diào)整飼草供應(yīng)時期、提高飼草消化率和動物適口性等優(yōu)點[6],青貯可以保存甜高粱原料中的營養(yǎng)物質(zhì)?！颈狙芯壳腥朦c】青貯發(fā)酵是一種利用微生物活動來實現(xiàn)復(fù)雜的物質(zhì)轉(zhuǎn)化過程,原料中的營養(yǎng)組分和微生物菌群結(jié)構(gòu)都會對其青貯后的飼料發(fā)酵品質(zhì)產(chǎn)生較大的影響[7-9]。目前關(guān)于甜高粱青貯飼料青貯菌劑的篩選及營養(yǎng)成分的研究較多[10-13],鮮有關(guān)于甜高粱青貯飼料中微生物菌群結(jié)構(gòu)的報道。傳統(tǒng)微生物分離培養(yǎng)方法操作繁瑣、耗時耗力,且結(jié)果不準確。高通量測序近些年被大量用于環(huán)境微生物的研究,也可用于青貯微生物的研究[14-16]。需研究基于高通量測序的甜高粱青貯飼料中微生物群落?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用高通量測序技術(shù)分析未添加與添加青貯菌劑的甜高粱青貯微生物群落結(jié)構(gòu),從細菌及真菌種類、相對豐度等研究甜高粱青貯飼料微生物的多樣性,分析甜高粱青貯飼料的優(yōu)勢菌或致腐菌的種類,為甜高粱青貯專用菌劑的開發(fā)利用提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材 料

甜高粱品種:新高粱9號(T601)、新高粱3號(XT- 2),種植在新疆昌吉西部中心試驗地。

甜高粱青貯飼料:利用粉碎機將刈割的甜高粱全株粉碎至1～2 cm,加入青貯菌劑和適量的水,攪拌均勻后人工裝入青貯罐,一邊裝填一邊壓實,裝滿后蓋緊密封蓋。

1.2 方 法

1.2.1 試驗設(shè)計

設(shè)置4個不同處理,分別是新高粱9號(A)、新高粱9號+青貯菌劑(B)、新高粱3號(C)、新高粱3號+青貯菌劑(D)。每個處理重復(fù)3瓶,密封保存60 d后打開青貯發(fā)酵罐,3個重復(fù)樣品混合均勻取樣測定分析。

1.2.2 微生物多樣性

使用試劑盒提取甜高粱青貯飼料的總DNA,根據(jù)保守區(qū)設(shè)計得到引物,在引物末端加上測序接頭,進行PCR擴增并對其產(chǎn)物進行純化、定量和均一化形成測序文庫,建好的文庫先進行文庫質(zhì)檢,質(zhì)檢合格的文庫用Illumina HiSeq 2500進行測序,由百邁客生物科技有限公司完成測序。細菌主要是基于16S:V3+V4區(qū),真菌主要基于ITS1區(qū)測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用 Trimmomatic v0.33軟件,對測序得到的 Raw Reads進行過濾;使用cutadapt 1.9.1軟件進行引物序列的識別與去除,使用 FLASH v1.2.7軟件,通過overlap對每個樣品高質(zhì)量的 Reads 進行拼接,再使用 UCHIME v4.2軟件,鑒定并去除嵌合體序列,得到最終有效數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 青貯飼料樣品細菌、真菌測序

研究表明,原始序列范圍為 48 228～79 998條,過濾掉低質(zhì)量序列后細菌質(zhì)控序列范圍為44 844～75 702條,過濾嵌合體后的有效序列范圍為 44 062～74 324 條,平均長度為 425～427 個堿基對(bp),GC(%)為 51.68%～52.87%。原始序列范圍為 51 480～172 836 條,質(zhì)控序列范圍為 49 593～77 351 條,有效序列范圍為48 549～77 351條,平均長度為 178～253 個堿基對,獲得 OTU 數(shù)量范圍為 29～158。不同處理的OTU 數(shù)量未添加青貯菌劑的飼料 OTU數(shù)量高于添加青貯菌劑的,即A>B、C>D ,未添加青貯菌劑的飼料中微生物群落更豐富。表1

表1 青貯飼料樣品細菌、真菌測序統(tǒng)計

2.2 甜高粱青貯飼料中細菌多樣性

2.2.1 甜高粱青貯飼料細菌豐度和多樣性

研究表明,4 種不同處理共獲得 712 個 OTU,其中共有 OTU 數(shù)目為200 個,占比為 28.09%。A、B、C和D組分別含有 598、374、505 和 386 個 OUT。其中A>B,C>D,添加青貯菌劑后,OTU 數(shù)目隨之降低。A、B、C和 D中所特有的 OTU 數(shù)目分別為 108、14、6 和7 個。A和 B 2組的635 個 OTU 中,共有 338個 OTU,占比為 53.23%;C和 D 兩組的556 個 OTU 中,共有337個 OTU,占比為60.61%;A和C 2個處理的696個 OTU 中,共有408 個 OTU,占比為 58.62%, B和D 2個處理的519個 OTU 中,共有243個 OTU,占比為 46.8%。圖1

圖1 基于 OTU 水平的甜高粱青貯樣品中細菌群落的 Venn 圖

研究表明,甜高粱青貯飼料Ace指數(shù)在407.90～629.01,Chao 1指數(shù)在425.11～634.25,Shannon指數(shù)在2.31～5.07。4個甜高粱青貯飼料處理組的測序結(jié)果覆蓋度都大于 0.99,測定基本覆蓋了甜高粱青貯飼料中所有微生物的核心組成。相較于對照組(A、C),添加菌劑組(B、D)的 Chao1 指數(shù)和 Ace 指數(shù)均有所降低,添加青貯菌劑后甜高粱青貯中細菌的豐度降低;與添加菌劑組(B、D)相比,對照組(A、C)的Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)均較高,未添加青貯菌劑組,細菌群落多樣性較高。表2

表2 樣品細菌的 Alpha 多樣性指數(shù)

2.2.2 細菌群落組成

(1)基于門水平的青貯飼料細菌組成

研究表明,在門水平上,4個處理組樣品的優(yōu)勢菌門均為厚壁菌門(Firmicutes),其次是變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroides)、藍細菌門(Cyanobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)。放線菌門(Actinobacteria)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、梭桿菌(Fusobacteria)在甜高粱青貯飼料中有少量存在。不同處理的樣品之間微生物菌群相近,但相對豐度存在明顯差異。A、B、C和D中厚壁菌門相對豐度分別為55.45%,78.13%、60.73%、82.78%,其中新高粱9號添加菌劑組比對照組高出40.9%,新高粱3號添加菌劑組比對照組高出36.30%;第2大優(yōu)勢菌群為變形菌門,分別占樣品序列的24.11%、17.50%、20.10%、7.69%。青貯菌劑對兩個品種的甜高粱青貯飼料中細菌豐度均影響較大。

A、C兩組物種豐度大于B、D,即未添加青貯菌劑組甜高粱青貯飼料中物種豐度較大。圖2

(2)基于屬水平的甜高粱青貯飼料細菌組成

研究表明,在屬水平上,4個甜高粱青貯飼料樣品中共檢測到 11 個細菌屬,分別為乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、腸桿菌屬(Enterobacter)、乳球菌屬(Lactococcus)、煙草屬(Nicotiana_otophora)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、綠桿菌屬(Ochrobactrum)、棒狀桿菌(Corynebacterium)等。相對豐度較高且4組甜高粱青貯飼料中均含有的主要細菌屬是乳酸桿菌屬、腸桿菌屬、乳球菌屬、棒狀桿菌。A、B、C和D樣品中乳酸桿菌屬相對豐度分別為39.45%、64.21%、53.85%、81.64%,其中新高粱9號添加菌劑組比對照組高出62.76%,新高粱3號添加菌劑組比對照組高出51.60%。A、B兩組中腸桿菌屬含量較高,分別為14.27%、12%。添加菌劑組乳酸桿菌均超過60%;相比添加青貯菌劑組,未添加菌劑組A和C中細菌組成種類較多。屬水平上,A、C兩組物種豐度大于B、D。圖3

圖 2 基于門水平的細菌組成及物種豐度聚類熱圖

圖 3 基于屬水平的細菌組成及物種豐度聚類熱圖

2.2.3 細菌群落Beta多樣性

研究表明, 4 種樣品共聚為兩大支,新高粱9號對照組(A)與添加青貯菌劑組(B)的細菌屬聚為一類,差異較小,新高粱3號對照組(C)與添加青貯菌劑組(D)細菌屬聚為另一類。細菌群落Beta多樣性與甜高粱品種相關(guān)性更大。圖4

圖4 細菌非度量多維尺度(a)和基于Beta多樣性距離的樣品層級聚類樹(b)

2.3 甜高粱青貯飼料中真菌多樣性

2.3.1 甜高粱青貯飼料真菌豐度和多樣性

研究表明,4 種不同處理共獲得 208 個 OTU,其中共有 OTU 數(shù)目為15 個,占比為 7.21%。A、B、C和D分別含有 158、67、154 和 29 個 OUT。A、B、C和 D中所特有的 OTU 數(shù)目分別為 30、31、1 和11 個。A和 B 2組的173 個 OTU 中,共有 52個 OTU,占比為30.05%;C和 D 2組的158 個 OTU 中,共有25個 OTU,占比為15.82%;A和C 2個處理的196個 OTU 中,共有116個 OTU,占比為 59.18%, B和D 2個處理的78個 OTU 中,共有18個 OTU,占比為 23.08%。圖5

圖5 基于 OTU 水平的甜高粱青貯飼料中真菌群落的 Venn 圖

4組甜高粱青貯飼料樣品的覆蓋度均大于 0.99,基本覆蓋了甜高粱青貯飼料中所有微生物的核心組成。Ace指數(shù)在42～170.43,Chao 1指數(shù)在50.04～124.18,Simpson指數(shù)在0.06～3.5,Shannon指數(shù)在0.01～0.83。甜高粱青貯飼料A的Chao 1指數(shù)124.18大于B的Chao 1指數(shù)120.95,甜高粱青貯飼料C的Chao 1指數(shù)170.74大于D的Chao 1指數(shù)50.04,未添加青貯菌劑組A、C的真菌微生物豐度高于B和D。在真菌多樣性方面,甜高粱青貯飼料A的Shannon指數(shù)0.12小于B的Shannon指數(shù)0.21,甜高粱青貯飼料C的Shannon指數(shù)0.83大于D的Shannon指數(shù)0.01。表3

表3 甜高粱青貯飼料中真菌的 Alpha 多樣性

2.3.2 真菌群落組成

(1)基于門水平的青貯飼料真菌組成

研究表明,各處理組的優(yōu)勢菌門均為子囊菌門,在青貯飼料中占菌群的 85%以上。除此之外,擔(dān)子菌門有少量存在。B組子囊菌門的相對豐度相較于A 組 (93.89%)增加了5.5%,D組子囊菌門的相對豐度相較于C 組 (88.24%)增加了13.29%。A、C 2組甜高粱青貯飼料中未分類真菌相對豐度分別為5.69%、8.36%。添加青貯菌劑可提高甜高粱青貯飼料中子囊菌門所占比例,降低雜菌所占比例,減少其他真菌的產(chǎn)生。圖6

圖6 基于門水平的甜高粱青貯飼料真菌組成及物種豐度聚類熱圖

(2)基于屬水平的青貯飼料真菌組成

研究表明,4 個處理組的優(yōu)勢菌屬不同。其中 A、D 組為念珠菌,相對豐度分別為 88.3%、99.4%;B組為鐮刀菌相對豐度為 88.4%;C組優(yōu)勢菌屬為柳條菌屬,相對豐度為 74.75%。圖7

圖7 基于屬水平的甜高粱青貯飼料真菌組成及物種豐度聚類熱圖

3 討 論

3.1Alpha 多樣性主要通過ACE 指數(shù)、 Chao1 指數(shù)、Shannon 指數(shù)、Simpson 指數(shù)4個指標(biāo)來分析[17],其中 Chao1 指數(shù)和 ACE 指數(shù)用來估算群落豐富度,Shannon 指數(shù)和 Simpson 指數(shù)用來估算群落多樣性,Shannon 指數(shù)越大、Simpson指數(shù)越低,表明樣品微生物多樣性越高[18]。根據(jù)距離矩陣獲得相應(yīng)距離下的甜高粱青貯飼料樣品層次聚類(UPGMA)樹、非度量多維尺度(NMDS)分析比較不同甜高粱品種及處理在物種多樣性方面(群落組成及結(jié)構(gòu))存在的差異大小[19-20]。甜高粱是我國干旱、半干旱和高鹽堿地區(qū)畜牧業(yè)的優(yōu)質(zhì)飼草來源[21]。甜高粱可溶性碳水化合物含量較高, 緩沖能低, 容易調(diào)制品質(zhì)優(yōu)質(zhì)的青貯飼料[22]。微生物結(jié)構(gòu)與多樣性影響著青貯發(fā)酵飼料品質(zhì)與營養(yǎng)成分[23]。研究發(fā)現(xiàn),青貯菌劑能明顯提高青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì),有助于原料中營養(yǎng)成分的保留[24]。

3.2甜高粱青貯飼料中優(yōu)勢菌屬為乳酸桿菌屬、腸桿菌屬、乳球菌屬,與苜蓿青貯發(fā)酵的優(yōu)勢菌屬有相同菌屬也有差異[25],可能是由于不同青貯原料青貯微生物多樣性本身存在差異。探究不同添加劑對構(gòu)樹青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)及微生物多樣性的影響,結(jié)果說明添加劑的不同影響微生物群落的結(jié)構(gòu),添加劑組厚壁菌門的相對豐度較對照組是增加的趨勢,變形菌門的相對豐度隨著厚壁菌門相對豐度的升高而相應(yīng)降低[26]。與研究的青貯菌劑可降低細菌及真菌的相對豐度結(jié)果一致。楊寶鈺[27]研究了瘤胃液處理甜高粱秸稈對其微生物多樣性的影響,結(jié)果表明在門水平上,各處理組優(yōu)勢菌群相對豐度最高為厚壁菌門;在屬水平上,各處理組優(yōu)勢菌群相對豐度最高為乳桿菌屬,不同品種的甜高粱青貯飼料中優(yōu)勢菌屬均為乳桿菌屬。

4 結(jié) 論

4.1甜高粱青貯飼料中細菌群落主要有厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroides)、藍細菌門(Cyanobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria);真菌群落優(yōu)勢菌門為子囊菌門,在青貯飼料中占菌群的 85%以上。

4.2不同處理的甜高粱青貯飼料之間微生物菌群組成相近,但相對豐度存在明顯差異。青貯菌劑對甜高粱青貯飼料中微生物多樣性影響較大,添加青貯菌劑,可降低細菌及真菌的相對豐度。