張 云，胡慧嫻，陳麗婷，亞勝男，徐爭元*

（1.皖南醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)工程學(xué)教研室，安徽蕪湖 241002；2.蕪湖市中醫(yī)醫(yī)院血液凈化中心，安徽蕪湖 241000）

結(jié)直腸癌在世界范圍內(nèi)癌癥發(fā)病率中排名第三，約占所有癌癥發(fā)病總數(shù)的10%，死亡率位居第二[1]，近幾年在中國結(jié)直腸癌(Colorectal Cancer,CRC)的發(fā)病率有著明顯的上升趨勢[2]。一般來說，不健康的生活方式可能占CRC 病因的70%[3]，如肥胖、飲酒、糖尿病、不健康的飲食習(xí)慣和缺乏運動等因素對結(jié)直腸癌的發(fā)展有重要影響[4]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，胰島素抵抗和高胰島素血癥與結(jié)直腸癌密切相關(guān)[5]。此外，大量流行病學(xué)研究表明，與非糖尿病患者相比，結(jié)直腸癌在糖尿病患者中更為普遍[6]。一些觀察結(jié)果表明，糖尿病與特定器官(如肝臟、胰腺和結(jié)腸等)癌癥發(fā)病率升高之間存在關(guān)聯(lián)。胰島素調(diào)節(jié)的異常通過胰島素樣生長因子1(Insulin-like Growth Factor 1，IGF-1)受體等信號通路成為糖尿病和肥胖相關(guān)腫瘤發(fā)生的基礎(chǔ)[7]。為了探討糖尿病和結(jié)直腸癌間的關(guān)聯(lián)，本研究篩選了結(jié)直腸癌患者的差異表達基因和糖尿病相關(guān)基因并取交集，對交集基因集做功能富集分析和蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析，進一步篩選出其中的關(guān)鍵基因，并探討結(jié)直腸癌與糖尿病關(guān)聯(lián)的關(guān)鍵基因?qū)Y(jié)直腸癌患者診斷和預(yù)后生存的影響。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

研究所用數(shù)據(jù)集來自美國國家癌癥研究所(National Cancer Institute,NCI)的TCGA數(shù)據(jù)庫結(jié)直腸癌項目(COAD)(https://portal.gdc.cancer.gov/)，包含453個結(jié)直腸癌組織樣本和41個正常組織樣本?；虮磉_譜矩陣含未進行標(biāo)準(zhǔn)化的RNA-seq數(shù)據(jù)(counts)和每千個堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的片段(Fragments Per Kilobase of exon model per Million mapped fragments,FPKM)標(biāo)準(zhǔn)化RNA-seq 數(shù)據(jù)。驗證所用數(shù)據(jù)集來自美國國立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)的GEO數(shù)據(jù)庫中的GSE39582(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)，包含566 個結(jié)直腸癌組織樣本和19 個正常組織樣本[8]。表達譜矩陣為RNA-seq數(shù)據(jù)。使用R(version 4.2.2)及R軟件包分析與處理。

1.2 糖尿病相關(guān)基因的確定

在GeneCards 數(shù)據(jù)庫中(https://www.genecards.org/)[9]搜索“diabetes”找到糖尿病相關(guān)基因，通過相關(guān)性評分＞15 篩選到264 個高相關(guān)性基因，將其作為后續(xù)分析使用待選基因。

1.3 差異表達分析

在TCGA數(shù)據(jù)庫中使用R軟件包DESeq2比較表達譜數(shù)據(jù)(counts)以確定COAD樣本和正常樣本之間的差異表達基因[10]，閾值設(shè)置為|log2FoldChange|＞2，P＜0.05，其中FoldChange 為結(jié)直腸癌樣本和正常樣本間的差異變化倍數(shù)。利用R 包ggplot2 繪制火山圖，利用pheatmap繪制熱圖。

1.4 功能富集分析

對結(jié)直腸癌中差異表達基因與糖尿病相關(guān)基因取交集，得到31 個基因，使用Venny 2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)繪制韋恩圖，并使用DAVID 平臺(https://david.ncifcrf.gov/)進行基因本體論(Gene Ontology,GO)和京都基因及基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析。其中GO 包括生物學(xué)過程(Biological Processes,BP)、細(xì) 胞成分(Cellular Components,CC)和分子功能(Molecular Functions,MF)，可視化采用R包ggplot2[11]。

1.5 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析

使用STRING 數(shù)據(jù)庫(https://cn.string-db.org/)[12]，對31個結(jié)直腸癌中差異表達基因與糖尿病相關(guān)基因交集基因構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)(Protein-Protein Interaction networks,PPI)，置信分?jǐn)?shù)設(shè)置為0.4。將生成的TSV文件導(dǎo)入Cytoscape 軟件(3.7.2 版本)，使用MCODE 算法得到緊密連接的子網(wǎng)絡(luò)。再使用cyto-Hubba 中的MCC、DMNC、MNC、Degree 和EPC 等五種算法各取前8 個基因再取交集，篩選出整個PPI網(wǎng)絡(luò)中的2個關(guān)鍵基因(hub genes)。

1.6 基因表達水平驗證及預(yù)后分析

分別 在 TCGA 數(shù)據(jù)庫 和 GEO 數(shù) 據(jù)庫（GSE39582）中驗證2 個關(guān)鍵基因的表達量差異。以表達量中位數(shù)為閾值對結(jié)直腸癌樣本和正常樣本進行分組分析，使用R 包ggpubr 進行表達量差異的可視化呈現(xiàn)(采用wilcoxon 檢驗)，使用R 包pROC 繪制其對應(yīng)的受試者工作特征(Receiver Operating Characteristic，ROC)曲線，并計算ROC 曲線下面積(Area Under Curve,AUC)，以評判其診斷效能。將患者按照表達量的四分位進行分組，繪制兩組間Kaplan-Meier(KM)生存曲線進行結(jié)直腸癌患者預(yù)后分析(采用log-rank檢驗)。

2 結(jié)果

2.1 差異基因

針對結(jié)直腸癌患者組織樣本和正常組織樣本進行差異分析，以log2FoldChange ＞2，P＜0.05 為閾值篩選出上調(diào)差異基因980個，以log2FoldChange ＜-2，P＜0.05 為閾值篩選出下調(diào)差異基因1 062 個，并繪制成火山圖（圖1A）。根據(jù)上述2 042 個差異基因在兩組間的表達量差異，繪制成熱圖（圖1B）。

圖1 結(jié)直腸癌相關(guān)差異表達基因的火山圖和熱圖

在GeneCards 中篩選與糖尿病相關(guān)性評分大于15 的基因，共264 個。將結(jié)直腸癌的2 042 個差異基因和糖尿病相關(guān)的264 個基因取交集，共得到31 個基因，繪制成韋恩圖（圖2）。

圖2 結(jié)直腸癌差異表達基因與糖尿病相關(guān)基因的交集基因韋恩圖

2.2 功能富集分析

對31個交集基因進行GO功能富集分析，結(jié)果顯示其參與的主要生物學(xué)過程為血糖穩(wěn)態(tài)、胰島素分泌、外分泌胰腺發(fā)育、活動響應(yīng)和對糖皮質(zhì)激素的反應(yīng)等。KEGG 富集分析結(jié)果顯示其參與的主要通路為脂肪細(xì)胞因子信號通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、AMPK 信號通路、2 型糖尿病和腎素分泌等（圖3）。

圖3 GO和KEGG富集分析

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)

為了探索31 個交集基因間的相互作用關(guān)系，我們使用STRING 數(shù)據(jù)庫構(gòu)建了 combined score ＞0.4 的PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（圖4），該網(wǎng)絡(luò)由31 個節(jié)點和125 條邊構(gòu)成。再將該網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 軟件中做進一步分析，利用MCODE 插件篩選出一個中心模塊（圖5），模塊得分為9.667，由13 個節(jié)點和58 條邊構(gòu)成。利用cytoHubba 插件中的五種算法（MCC、DMNC、MNC、Degree 和EPC）分別計算得分，各取前8 位關(guān)鍵基因（表1），再對這些算法篩選出的基因取交集，繪制韋恩圖（圖6），得到重疊的2 個關(guān)鍵基因，分別是CD36 和SERPINE1。

表1 cytoHubba 中5 種算法的前8 基因

圖4 PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

圖5 MCODE網(wǎng)絡(luò)模塊

圖6 cytoHubba 5種算法重疊的關(guān)鍵基因

2.4 關(guān)鍵基因的表達驗證

在TCGA數(shù)據(jù)庫中分析CD36和SERPINE1在兩組間的表達差異，并繪制成箱線圖。結(jié)果顯示CD36在結(jié)直腸癌組織中顯著低表達（P＜0.001），而SERPINE1在結(jié)直腸癌組織中顯著高表達（P＜0.001）。采用ROC曲線評判其診斷效能，曲線下面積AUC 分別為96.8%和87.0%（圖7）。選取GEO數(shù)據(jù)庫中與結(jié)直腸癌相關(guān)的GSE39582數(shù)據(jù)集進行外部驗證，結(jié)果同樣顯示CD36在結(jié)直腸癌組織中顯著低表達（P＜0.001），而SERPINE1在結(jié)直腸癌組織中顯著高表達（P＜0.01）（圖8），這表明兩個關(guān)鍵基因均可以作為有效的結(jié)直腸癌診斷標(biāo)志物。

圖7 TCGA數(shù)據(jù)庫中CD36和SERPINE1表達差異與ROC曲線

圖8 GEO數(shù)據(jù)庫中驗證CD36和SERPINE1表達差異與ROC曲線

2.5 結(jié)直腸癌患者預(yù)后分析

為了探究兩個關(guān)鍵基因和結(jié)直腸癌患者的預(yù)后及生存的關(guān)系，我們結(jié)合患者臨床數(shù)據(jù)中的生存狀態(tài)和生存期，繪制了KM 生存曲線（圖9）。結(jié)果顯示TCGA 數(shù)據(jù)庫中CD36 高表達組具有較短的生存期（P＜0.01），SERPINE1 高表達組同樣具有較短的生存期（P＜0.001）。在GEO 數(shù)據(jù)庫中結(jié)論基本一致，CD36 高表達組具有較短的生存期（P＜0.01），而SERPINE1 高表達組也具有較短生存期的趨勢，盡管這種差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖9 CD36和SERPINE1在兩個數(shù)據(jù)庫中的KM生存曲線

3 討論

一些流行病學(xué)研究已經(jīng)確定糖尿病是結(jié)直腸癌的危險因素，它們關(guān)聯(lián)的潛在病理生理機制包括高胰島素血癥、胰島素樣生長因子(IGF)軸、高血糖、脂肪組織功能障礙引起的炎癥、胃腸運動障礙和免疫監(jiān)測受損等。以往的研究證實了2 型糖尿病與結(jié)直腸癌的發(fā)生和患者的生存狀態(tài)之間具有相關(guān)性，潛在的糖尿病會對結(jié)直腸癌患者的預(yù)后產(chǎn)生不利影響[13]。

通過對糖尿病相關(guān)基因和結(jié)直腸癌差異表達基因取交集，并采用PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)等方法篩選出關(guān)聯(lián)糖尿病和結(jié)直腸癌兩種疾病的2 個關(guān)鍵基因——CD36和SERPINE1。

CD36，也被稱為清道夫受體B2，是一種多功能受體，介導(dǎo)脂質(zhì)攝取、高級氧化蛋白產(chǎn)物和免疫識別。作為跨膜蛋白，CD36 主要表達于細(xì)胞表面的膜糖蛋白，存在于多種細(xì)胞類型中，包括血小板、脂肪細(xì)胞和部分上皮細(xì)胞[14]。已有研究證明CD36 可作為如胰島素抵抗和2 型糖尿病等代謝性疾病和心血管疾病等的生物標(biāo)志物[15]。同時CD36 通過調(diào)節(jié)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的附著，影響基質(zhì)細(xì)胞的命運(脂肪細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞)，在癌癥轉(zhuǎn)移定殖、脂質(zhì)積累、細(xì)胞凋亡中發(fā)揮作用[14]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，CD36 通過介導(dǎo)的脂質(zhì)代謝促進腫瘤生長、轉(zhuǎn)移侵襲和耐藥[16]。進一步研究發(fā)現(xiàn)CD36 mRNA 高表達的CRC 患者的5年生存率低于CD36 mRNA 低表達的CRC 患者[17]。本研究結(jié)果表明CD36 在結(jié)直腸癌組織中顯著低表達，這種改變與基質(zhì)受體的缺失有關(guān)，CD36 在分離的腫瘤細(xì)胞上的正常表達證實了這一假設(shè)[18]。目前為止CD36 已被反復(fù)提出作為各種癌癥的預(yù)后標(biāo)志物，特別是上皮性癌癥(如結(jié)腸癌和乳腺癌等)。各種癌癥的臨床模型表明阻斷CD36 可能有助于阻止癌癥的轉(zhuǎn)移擴散[15]。CD36 通過促進Glypcian4(GPC4)的蛋白酶依賴泛素化來抑制β-catenin/c-myc軸參與CRC 的發(fā)展[19]。另外，CD36 通過多種分子機制參與腫瘤免疫和治療耐藥，靶向CD36 可作為腫瘤免疫治療的有效策略[20]。CD36 與代謝紊亂密切相關(guān)，并參與結(jié)直腸癌的發(fā)生、生長、腫瘤免疫和轉(zhuǎn)移性侵襲，是糖尿病和結(jié)直腸癌的不良預(yù)后標(biāo)志物[21]。

絲氨酸蛋白酶抑制因子1(Serpin Peptidase Inhibitor 1,SERPINE1)是絲氨酸蛋白酶抑制劑的編碼基因，在體內(nèi)可抑制纖維蛋白溶解[22]。研究證明SERPINE1 基因多態(tài)性與2 型糖尿病(T2D)有關(guān)，SERPINE1 基因編碼的纖溶酶原激活物抑制劑-1(PAI-1)水平較高時促使2 型糖尿病的發(fā)病[23]，是糖尿病的治療靶點[24]。此外，SERPINE1 被發(fā)現(xiàn)與結(jié)直腸癌的發(fā)病率密切相關(guān)，因此了解SERPINE1在體內(nèi)表達的調(diào)控機制至關(guān)重要。近期研究表明，SERPINE1 的表達與結(jié)直腸癌的進展和不良預(yù)后相關(guān)[25]。Pranteda 等人發(fā)現(xiàn)SERPINE1 可以通過P38-MAPK 通路促進結(jié)腸癌的進展[26]。SERPINE1 可以催化基底膜和ECM的降解，使癌細(xì)胞更容易入侵周圍的正常組織并促進癌癥的發(fā)展[27]。同時發(fā)現(xiàn)SERPINE1 表達上調(diào)激活上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程，導(dǎo)致結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲和增殖能力明顯升高，凋亡水平降低[28]。進一步研究證實腸上皮細(xì)胞中SERPINE1 上調(diào)有利于細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶信號的原腫瘤作用，是治療結(jié)直腸癌的潛在靶點[29]。SERPINE1 表達水平升高時可促使2 型糖尿病發(fā)病，并影響結(jié)直腸癌侵襲性，是調(diào)節(jié)糖尿病和結(jié)直腸癌進展的因素和潛在的治療靶點[30]。

本研究通過對糖尿病和結(jié)直腸癌的交集基因做富集分析，發(fā)現(xiàn)交集基因集與胰島素分泌、2 型糖尿病等過程與通路有關(guān)，而糖尿病是一種復(fù)雜的代謝性疾病，以胰島素分泌不足與胰島素抵抗引起慢性高血糖為典型特征[31]，且2 型糖尿病患者較1 型糖尿病患者更容易發(fā)生癌癥[32]。研究表明，2 型糖尿病與不同類型癌癥的發(fā)生風(fēng)險增加有關(guān)，尤其是內(nèi)分泌和胃腸道惡性腫瘤[33]。此外，2 型糖尿病可能通過慢性高血糖和高胰島素血癥與結(jié)直腸癌的發(fā)展有因果關(guān)系，可增加結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)的風(fēng)險[34-35]。根據(jù)Zhu 等人研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌、結(jié)腸癌和直腸癌合并糖尿病患者的生存期比無糖尿病患者短5年[36]。

4 結(jié)語

本研究通過關(guān)聯(lián)糖尿病與結(jié)直腸癌，篩選了2個關(guān)鍵基因，通過對CD36 和SERPINE1 進行分子功能的探討，提供了結(jié)直腸癌發(fā)病機制及進展的新見解，為后續(xù)探索糖尿病和結(jié)直腸癌的關(guān)聯(lián)提供研究基礎(chǔ)，并為結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展機制的研究及治療提供了新思路。