張高嘉， 孔 巖， 李 玲， 焦 嬌， 徐丹丹， 曹育嘉， 劉夢雨綜述， 張志珺，3審校

本篇綜述首先概述了細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs），同時(shí)對(duì)目前使用的用于富集外周血不同 腦細(xì)胞來源細(xì)胞外囊泡（brain cell-derived extracellular vesicles，BCDEVs）特異性分子標(biāo)記物進(jìn)行概述，最后重點(diǎn)介紹了外周血BCDEVs 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)（centralnervous system，CNS）疾病中的應(yīng)用，以闡明其作為生物標(biāo)志物的潛力，以及它們?cè)趯?shí)現(xiàn)這一目標(biāo)時(shí)所面臨的挑戰(zhàn)。

1 EVs概述

EVs 是一組由各種類型的細(xì)胞經(jīng)過多個(gè)不同階段的演變釋放到細(xì)胞外環(huán)境的納米級(jí)異質(zhì)性脂質(zhì)雙層膜囊泡［1，2］，存在于所有人體體液中，包括CSF、血液、尿液、母乳和唾液等［3～8］，其內(nèi)包含幾乎所有類別的生物分子，如核酸（細(xì)胞核及線粒體DNA、長鏈RNA 和miRNA）、蛋白質(zhì)（結(jié)構(gòu)蛋白和/或酶蛋白）、代謝物和脂類［9，10］，其內(nèi)容物的不同取決于它們的起源細(xì)胞和該細(xì)胞所處的生理及病理狀態(tài)［1，11，12］，這些不同分子在調(diào)節(jié)一系列生物過程的細(xì)胞-細(xì)胞通信中發(fā)揮重要作用［13～17］。在過去十年間，人們對(duì)EVs 的類別和特征及其生理和病理作用的認(rèn)識(shí)不斷加深，根據(jù)其大小及生物起源不同主要分為3 種類型：外泌體、微囊泡（microvesicles，MVs）和凋亡小體［18］。凋亡小體是由細(xì)胞程序性死亡形成的最大的膜性囊泡（500～4 000 nm），凋亡細(xì)胞經(jīng)歷多個(gè)階段的演變，最終導(dǎo)致包裹在不同的膜結(jié)合囊泡中的細(xì)胞內(nèi)容物的破壞形成凋亡小體［19，20］，常以腔內(nèi)存在細(xì)胞器和/或核內(nèi)容物為特征。雖然通常與EVs無關(guān)，但在各種條件下，溶酶體囊泡分泌或分泌性自噬等非常規(guī)分泌過程可能會(huì)將大量細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)釋放到細(xì)胞外環(huán)境中而形成與EVs相似的膜性囊泡結(jié)構(gòu)［21］。MVs，也稱胞外體、微?；蛎撀淠遗荩笮?00～1 000 nm，直接由質(zhì)膜向外出芽形成［22］，MVs 與凋亡小體的區(qū)別不僅在于大小，還在于它們的形成、內(nèi)容物和膜特異性抗原。外泌體是一種由多泡體（multive bodies，MVB）與胞膜融合后分泌到細(xì)胞外環(huán)境的一組直徑介于30～150 nm 的含有特殊標(biāo)記物的膜性小囊泡［23，24］，其表面或腔內(nèi)含有特殊標(biāo)記物包括Alix、TSG101、HSC70、HSP90、CD81、CD9、CD63 等［15，25］。外泌體起初被認(rèn)為是一種細(xì)胞廢棄物［26］，然而隨著研究技術(shù)的進(jìn)步，人們發(fā)現(xiàn)外泌體代表了一種新的細(xì)胞間通訊方式，并參與了廣泛的生理和病理過程［15］。MVs和外泌體在大小上存在重疊，雖然根據(jù)他們的生物發(fā)生過程可以明確區(qū)別不同類型EVs，但到目前為止，由于缺乏特定的標(biāo)記和技術(shù)方法，還沒有一種策略可以在復(fù)雜的生物流體樣本中對(duì)這兩種類型的EVs 進(jìn)行無可爭議的表征和/或物理分離［27～30］，因此本綜述中，使用總體術(shù)語EVs進(jìn)行表述。

2 用于富集外周血不同BCDEVs 特異性分子標(biāo)記物

BCDEVs 是由不同神經(jīng)細(xì)胞分泌的含有來自其生成細(xì)胞生物分子的細(xì)胞外納米囊泡，在外周血血漿或者血清中可通過不同EVs特異性表面標(biāo)記物富集不同亞型BCDEVs，這為CNS 疾病的診斷及療效評(píng)估開辟了新的范式。來自華盛頓大學(xué)西雅圖分校的Zhang 團(tuán)隊(duì)［31］和加州大學(xué)舊金山分校的Goetzl 團(tuán)隊(duì)［32］首先開創(chuàng)了這一領(lǐng)域，分別先后建立了外周血NDEVs 的富集方法。目前用于富集外周血NDEVs特異性分子標(biāo)記物有L1 細(xì)胞黏附分子（L1-Cell adhesion Molecule，L1CAM）［33～35］、神經(jīng)細(xì)胞黏附分子（neural cell adhesion molecule，NCAM）［36，37］和突觸體相關(guān)蛋白-25（synaptosomal associated protein-25，SNAP25）［38］，其中L1CAM 分子是最常用的外周血NDEVs 特異性分子標(biāo)記物。最近來自浙江大學(xué)的Zhang團(tuán)隊(duì)又新鑒定了一種分子標(biāo)記物N-甲基-D-天冬氨酸受體2A（N-methyl-D-aspartate receptor 2A，NMDAR2A），發(fā)現(xiàn)NMDAR2A 與L1CAM 共同存在于NDEVs，可被用于富集外周血NDEVs 特異性分子標(biāo)記物［33］。隨后Goetzl 課題組又創(chuàng)建了外周血ADEVs的富集方法［39］，目前用于富集外周血ADEVs 特異性分子標(biāo)記物多采用谷氨酰胺天冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體［glutamine aspartate transporter，GLAST（又稱作astrocyte cell surface antigen-1，ACSA-1［39］或excitatory amino acid transporter 1，EAAT1［38］）］，目前報(bào)道的僅有一項(xiàng)研究同時(shí)使用水通道蛋白4（aquaporin-4，AQP4）和膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）用于分離血漿ADEVs［40］。隨后華盛頓大學(xué)西雅圖分校的Zhang 團(tuán)隊(duì)［41］和日本京都醫(yī)科大學(xué)Tokuda 團(tuán)隊(duì)［38］分別采用不同的特異性分子標(biāo)記物［前者使用2，3-環(huán)核苷酸-3-磷酸二酯酶（2，3-cyclic nucleotide-3-phosphodiesterase（CNPase），后者使用少突膠質(zhì)細(xì)胞髓磷脂糖蛋白（oligodendrocyte-myelin glycoprotein，OMG）］創(chuàng)建了外周血ODEVs富集方法。由威克森林醫(yī)學(xué)院Deep 團(tuán)隊(duì)利用小膠質(zhì)細(xì)胞特異性分子標(biāo)記物I 型跨膜蛋白119（Type-I transmembrane protein 119，TMEM119）成功建立了食蟹猴外周血MDEVs 富集方法［42］，隨后東南大學(xué)神經(jīng)精神研究所Zhang 團(tuán)隊(duì)首次利用TMEM119 在人血漿中分離MDEVs［43］。最近來自威克森林醫(yī)學(xué)院Deep 團(tuán)隊(duì)又分別利用PDGFRβ 和CD31 建立了外周血血漿PDEVs 和EDEVs［44］。雖然目前已經(jīng)建立了利用特異性分子標(biāo)記物富集外周血不同BCDEVs 方法，然而用于分離各種BCDEVs 特異性分子標(biāo)記物并非各自神經(jīng)細(xì)胞所特有，在其他類型細(xì)胞中也都有表達(dá)。如L1CAM 蛋白不僅在神經(jīng)元中表達(dá)，在腎臟和脂肪組織中也有表達(dá)［38］，同時(shí)最近的一項(xiàng)研究表明，存在于人血漿中的L1CAM 可能與NDEVs 無關(guān)［45］。因此迫切需要尋找更加特異性的不同腦細(xì)胞分子標(biāo)記物用于富集外周血不同亞型BCDEVs。

3 外周血BCDEVs 作為CNS 退行性疾病生物標(biāo)志物研究

3.1 阿爾茨海默病（Alzheimer's disease，AD）

3.1.1 外周血BCDEVs 作為AD 診斷生物標(biāo)志物 外周血BCDEVs 作為一種新興的生物標(biāo)志物已引起大家廣泛關(guān)注，通過檢測這些囊泡所包含的生物分子和數(shù)量變化，可為AD 的早期診斷提供新途徑。既往研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，AD 患者血漿NDEVs 內(nèi)T-Tau、P-T181-Tau、P-S396-Tau、Aβ1-42［7］、P-Tau231、pSer312-IRS-1、pY-IRS-1［46］、組織蛋白酶D（Cathepsin D）、溶酶體相關(guān)膜蛋白1（lysosomeassociated membrane protein 1，LAMP-1）、泛素化蛋白、熱休克蛋白70（heat shock protein 70，HSP70）［47］、突觸素、突觸足蛋白、突觸結(jié)合蛋白-2、神經(jīng)粒蛋白（neurogranin，NRGN）、生長相關(guān)蛋白43（growthassociated protein 43，GAP-43）、突觸蛋白酶1（synapsin 1）［48］、TDP-43［49］、miR-132-3p、miR-212［50］、血清NDEVs 內(nèi)SNAP-25［51］、血漿ADEVs 內(nèi)C1q、C4b、C3d、因子B、因子D、Bb、C3b、C5b-C9 末端補(bǔ)體復(fù)合物、白介素-6、腫瘤壞死因子α 和IL-1β 水平發(fā)生顯著改變［52］，其中P-S396-Tau、P-T181-Tau、Aβ1-42、組織蛋白酶D、LAMP-1、泛素化蛋白、HSP70、神經(jīng)素蛋白2α（neurexin 2α，NRXN2α）、谷氨酸GluA4 受體和磷酸化IRS-1 等候選分子甚至可在AD 臨床發(fā)病1～10 年前出現(xiàn)異常［32，46，47，53，54］，在一項(xiàng)起始認(rèn)知功能正常平均隨訪3.5 年后進(jìn)展為AD 的大樣本研究中發(fā)現(xiàn)，與認(rèn)知功能正常對(duì)照組相比，起始認(rèn)知功能正常后進(jìn)展為AD 患者血漿NDEVs 直徑增大，囊泡內(nèi)PTau181、P-Tau231、pSer312-IRS-1 和pY-IRS-1 水平升高，對(duì)AD 疾病預(yù)測準(zhǔn)確度高達(dá)89.6%（敏感性=81.8%，特異性=85.8%）［46］。并且突觸結(jié)合蛋白、突觸素和NRGN 水平高低與簡易智力狀態(tài)檢查（minimental state examination，MMSE）及AD 評(píng)估量表-認(rèn)知子量表（AD assessment scale-cognitive subscale，ADAS-cog）評(píng)分顯著相關(guān)，具有較高的疾病診斷效能，其診斷準(zhǔn)確度高達(dá)82.6%（敏感性=87.5%，特異性=70.6%）［48，51］，這些BCDEVs內(nèi)候選分子由于受到脂質(zhì)雙分子層的保護(hù)，具有較高的穩(wěn)定性［55］，與腦組織［50］或CSF［36］中存在一致性差異性改變。除了囊泡內(nèi)候選分子，研究者還發(fā)現(xiàn)AD 患者血漿NMDAR2A陽性EVs 濃度較對(duì)照組明顯下降［33］，血漿NDEVs 直徑顯著增大［46］。以上結(jié)果表明，外周血NDEVs 或ADEVs 及其內(nèi)分子具有代表中樞作為AD 診斷生物標(biāo)志物潛能，具有較高的診斷靈敏性和特異性。

3.1.2 外周血BCDEVs 作為AD 鑒別診斷生物標(biāo)志物 外周血BCDEVs 除了可作為AD 潛在診斷生物標(biāo)志物外，其內(nèi)一些候選分子還可作為AD與其他認(rèn)知功能障礙性疾病包括遺忘型輕度認(rèn)知功能損害（amnestic mild cognitive impairment，aMCI）和FTD等鑒別診斷生物標(biāo)志物。研究發(fā)現(xiàn)，與aMCI患者相比，AD 患者血漿NDEVs 內(nèi)Aβ42、T-Tau 和P-T181-Tau 水平顯著升高［36］，與FTD 患者相比，AD 患者血漿NDEVs內(nèi)組織蛋白酶D、LAMP-1和泛素化蛋白水平顯著升高［47］。與對(duì)照組相比，AD 患者血漿NDEVs 內(nèi)GAP-43 和突觸蛋白酶1 水平下降，而在FTD 患者中未發(fā)現(xiàn)上述分子異常［48］。AD 患者血漿ADEVs 中β-淀粉樣前體蛋白裂解酶1（β-site amyloid precursor protein-cleaving enzyme 1，BACE-1）和可溶性淀粉樣前體蛋白β（soluble amyloid precursor protein β，sAPPβ）水平明顯高于正常對(duì)照組，膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（glial-derived neurotrophic factor，GDNF））水平明顯低于正常對(duì)照組，但在FTD 中未觀察到血漿ADEVs中上述3種蛋白存在差異性表達(dá)［39］。同時(shí)另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，AD患者胰島素抵抗水平（P-serine 312-IRS-1/P-pantyrosine-IRS-1）顯著高于FTD 患者，且在臨床發(fā)病前1～10 年，AD 患者胰島素抵抗水平已明顯高于FTD患者［54］。

3.1.3 外周血BCDEVs 作為AD 進(jìn)展及預(yù)后生物標(biāo)志物 既往研究發(fā)現(xiàn)，在AD 發(fā)病前6～11 年的臨床前期，血漿NDEVs中NRXN2α、谷氨酸GluA4受體和神經(jīng)素1（Neuroligin 1，NLGN1）水平較正常對(duì)照均顯著降低，并且其水平高低隨癡呆進(jìn)展而顯著下降［53］，而在另一項(xiàng)經(jīng)過5～12 年隨訪后確診為AD 的縱向隊(duì)列研究中發(fā)現(xiàn)，AD 患者血漿ADEVs 中補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白CD59、CD46、衰變加速因子和1 型補(bǔ)體受體水平顯著低于對(duì)照組，這些補(bǔ)體分子在AD起始認(rèn)知功能正常階段就已降低，隨著認(rèn)知功能損害的加重其水平進(jìn)一步降低［52］。以上結(jié)果提示上述血漿BCDEVs 中候選分子可作為AD 疾病進(jìn)展及預(yù)后生物標(biāo)志物。

3.1.4 外周血BCDEVs 作為AD 風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測生物標(biāo)志物 外周血BCDEVs 還可作為疾病預(yù)測性診斷生物標(biāo)志物，糖尿病患者輕度認(rèn)知功能障礙（Mild cognitive impairment，MCI）發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加，并可增加MCI向AD 轉(zhuǎn)化風(fēng)險(xiǎn)［56～58］，Zhang 等人［59］研究發(fā)現(xiàn)，與2-型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus，T2DM）認(rèn)知功能正常組相比，T2DM 合并AD 或進(jìn)展MCI 患者血漿NDEVs 內(nèi)NADH 泛醌氧化還原酶核心亞基S3（NADH ubiquinone oxidoreductase core subunit S3，NDUFS3）和琥珀酸脫氫酶復(fù)合亞基B（Succinate dehydrogenase complex subunit B，SDHB）水平顯著降低，同時(shí)與T2DM 穩(wěn)定MCI 患者相比，T2DM 進(jìn)展MCI患者血漿NDEVs 內(nèi)NDUFS3 和SDHB 水平下降，并且在隨訪期間，血漿NDEVs 內(nèi)低NDUFS3 和SDHB水平與進(jìn)展MCI 患者海馬和灰質(zhì)萎縮率及AD 特征性皮質(zhì)厚度降低相關(guān)［59］。在對(duì)MCI 轉(zhuǎn)化為AD 的預(yù)測性生物標(biāo)志物研究中發(fā)現(xiàn)，與3 年內(nèi)MCI 穩(wěn)定組相比，3 年內(nèi)MCI 轉(zhuǎn)化為AD 患者組血漿ADEVs 中C1q、C4b、因子D、Bb 片段、C5b、C3b 和C5b-C9 水平顯著升高，抑制性CPs衰變加速因子、CD46、CD59和1 型補(bǔ)體受體水平顯著降低［60］。而在另一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)，與認(rèn)知正常對(duì)照和穩(wěn)定MCI 患者相比，MCI 轉(zhuǎn)化為AD 患者血漿NDEVs 中P-S396-Tau、P-T181-Tau和Aβ1-42 水平顯著升高，而NRGN 和抑制因子1 沉默轉(zhuǎn)錄因子水平顯著降低，同時(shí)作者將MCI 轉(zhuǎn)化為AD 患者血漿NDEVs 注射到小鼠海馬CA1區(qū)后可明顯增加該腦區(qū)P-Tau 陽性細(xì)胞數(shù)比例［61］。以上結(jié)果表明，外周血BCDEVs 有作為T2DM 或MCI 向AD 疾病轉(zhuǎn)化風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測性診斷生物標(biāo)志物，同時(shí)將AD患者血漿NDEVs 注射到小鼠海馬CA1區(qū)后P-Tau 陽性細(xì)胞數(shù)比例增高，也進(jìn)一步證明了囊泡內(nèi)致病性蛋白的存在，為利用外周血BCDEVs 作為介質(zhì)研究AD 潛在發(fā)病機(jī)制提供可能依據(jù)。

3.1.5 外周血BCDEVs 作為探索AD 潛在發(fā)病機(jī)制生物標(biāo)志物 Goetzl 等人通過對(duì)血漿ADEVs 和NDEVs 中Aβ42 肽生成系統(tǒng)系列蛋白成分定量分析后發(fā)現(xiàn)，AD 患者血漿ADEVs 中BACE-1、γ-分泌酶、可溶性Aβ42、sAPPβ、sAPPα、GDNF、P-T181-Tau 和P-S396-Tau水平均顯著高于血漿NDEVs中各相應(yīng)蛋白水平［39］，提示ADEVs 中豐富的Aβ42 肽生成系統(tǒng)系列蛋白可能在維持神經(jīng)元內(nèi)Aβ42 肽生成系統(tǒng)蛋白動(dòng)態(tài)平衡發(fā)揮關(guān)鍵作用，為AD關(guān)于神經(jīng)細(xì)胞之間相互作用在疾病發(fā)病機(jī)制研究中提供了新思路［39］。既往研究表明，AD 患者腦內(nèi)存在神經(jīng)元自噬-溶酶體功能障礙［62，63］，研究者通過對(duì)AD患者血漿NDEVs內(nèi)不同類型溶酶體蛋白進(jìn)行定量分析后發(fā)現(xiàn)，在AD診斷前的數(shù)年里，血漿NDEVs 中組織蛋白酶D、LAMP-1、泛素化蛋白和HSP70 溶酶體蛋白水平存在顯著性差異改變，以上結(jié)果進(jìn)一步證明了AD患者在疾病早期階段可能已出現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞自噬-溶酶體通路功能障礙［47］。在另一項(xiàng)研究中，Kapogiannis 等人在發(fā)現(xiàn)來自AD 患者外周血ADEVs 中補(bǔ)體水平整體升高后［52］，隨后在另一項(xiàng)研究中，將外周血免疫富集的ADEVs 和NDEVs 作用于大鼠元代皮質(zhì)神經(jīng)元和人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（human-induced pluripotent stem cells，h-iPSCs），使用多種細(xì)胞和分子實(shí)驗(yàn)技術(shù)驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)，AD 患者血漿ADEVs 可通過激活補(bǔ)體誘導(dǎo)神經(jīng)元上膜攻擊復(fù)合物表達(dá)，引起神經(jīng)元細(xì)胞膜破壞和神經(jīng)突密度降低，從而引起大鼠元代皮質(zhì)神經(jīng)元和h-iPSCs 細(xì)胞活力降低，并在另一組經(jīng)尸檢診斷的AD 患者中得到進(jìn)一步的驗(yàn)證［64］。以上結(jié)果表明ADEVs 可通過補(bǔ)體介導(dǎo)的途徑對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞產(chǎn)生直接損傷作用，為深入了解AD病理生理機(jī)制提供了新思路，同時(shí)循環(huán)中ADEVs 很容易被神經(jīng)元內(nèi)化吸收，這也促使改良ADEVs 在AD 腦靶向治療中的應(yīng)用，為將來藥物研發(fā)提供一定的啟示。既往研究表明，AD 的疾病進(jìn)展和嚴(yán)重程度與保護(hù)神經(jīng)元抵抗不同應(yīng)激轉(zhuǎn)錄因子缺乏有關(guān)［65，66］，Goetzl等人通過對(duì)AD 患者血漿NDEVs 內(nèi)介導(dǎo)神經(jīng)元抵抗不同應(yīng)激的細(xì)胞存活因子定量分析后發(fā)現(xiàn)，AD 患者血漿NDEVs內(nèi)介導(dǎo)神經(jīng)元抵抗不同應(yīng)激的細(xì)胞存活因子包括低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白6、熱休克因子-1和阻遏元件1沉默轉(zhuǎn)錄因子水平均顯著降低［67］，該研究表明，AD 患者腦內(nèi)神經(jīng)元病理性死亡可能與神經(jīng)元存活所需細(xì)胞存活因子缺失有關(guān)，揭示了神經(jīng)元細(xì)胞外囊泡中細(xì)胞存活因子水平降低與AD發(fā)病機(jī)制之間的潛在關(guān)系，為AD的治療提供了新的思路和方向。

3.2 突觸核蛋白病

突觸核蛋白病是一組以錯(cuò)誤折疊的α-syn 沉積在神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞為主要病理特征的臨床和病理學(xué)異質(zhì)性疾病，主要包括帕金森?。╬arkinson disease，PD）和多系統(tǒng)萎縮（multisystem atrophy，MSA）等［68］。目前關(guān)于外周血BCDEVs 在突觸核蛋白病中作為生物標(biāo)志物研究主要圍繞致病性蛋白α-syn 展開，顯示出較好的疾病診斷、預(yù)測及療效評(píng)估效果。

3.2.1 帕金森?。≒arkinson disease,PD）

3.2.1.1 外周血BCDEVs 作為PD 診斷生物標(biāo)志物 既往研究表明，外周血BCDEVs中α-syn、DJ-1和Lnc-POU3F3 水平異常可作為PD 診斷生物標(biāo)志物［31，69］。Zhang 等人研究發(fā)現(xiàn)，與HC 相比，PD 患者血漿NDEVs 中α-syn 水平顯著升高，血漿NDEVs 內(nèi)α-syn 與統(tǒng)一帕金森病評(píng)定量表（Unified Parkinson's Disease Rating Scale，UPDRS）之間存在顯著相關(guān)性（r=0.176，P=0.004），并且血漿NDEVs 中α-syn 水平在區(qū)分PD患者與對(duì)照組敏感性和特異性接近CSF α-syn［31］。而在另一項(xiàng)研究中，Liu 等人發(fā)現(xiàn)，與HC 相比，早期PD血漿NDEVs中a-syn水平顯著升高，并且與PD 患者UPDRS Ⅲ/（Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ）評(píng)分（r=0.29，P=0.04；r=0.36，P=0.01）、非運(yùn)動(dòng)癥狀問卷評(píng)分（r=0.30，P=0.039）和Sniffin Sticks 16 項(xiàng)評(píng)分（r=-0.29，P=0.04）相關(guān)［69］。而在另一項(xiàng)聯(lián)合多中心、大樣本及多隊(duì)列研究中發(fā)現(xiàn)，無論是發(fā)現(xiàn)隊(duì)列還是驗(yàn)證隊(duì)列，與對(duì)照組相比，PD患者血清NDEVs中α-syn水平均顯著升高，在區(qū)分PD 和對(duì)照組方面兩隊(duì)列表現(xiàn)出一致的準(zhǔn)確性，ROC 分析AUC 均達(dá)到了0.86（發(fā)現(xiàn)對(duì)列：敏感性=82%，特異性=71%；驗(yàn)證隊(duì)列：敏感性=85%，特異性=74%）［34］。除了a-syn，研究者還對(duì)外周血BCDEVs 中其他潛在候選分子包括DJ-1 和Lnc-POU3F3 進(jìn)行定量分析，以評(píng)估其作為PD 診斷生物標(biāo)志物潛能。在一項(xiàng)橫斷面隊(duì)列研究中，Wang 等人發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，PD 患者血漿NDEVs 中DJ-1 和a-syn 水平同步顯著升高，同時(shí)NDEVs 中DJ-1 與asyn顯著正相關(guān)（r=0.902，P＜0.001）［70］。而在另一項(xiàng)橫斷面研究中，Zou 等人發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，PD 患者血漿NDEVs 中Lnc-POU3F3 和a-syn 水平同步顯著升高，并且與α-syn 顯著正相關(guān)（r=0.658，P=0.009）［71］。以上結(jié)果表明，血清或血漿NDEVs 中α-syn、DJ-1與Linc-POU3F3可作為PD潛在診斷生物標(biāo)志物。

3.2.1.2 外周血BCDEVs 作為PD 鑒別診斷生物標(biāo)志物 在一項(xiàng)聯(lián)合多中心、大樣本、橫斷面及縱向隊(duì)列研究中，Tofaris 等人［34］對(duì)多種神經(jīng)變性譜系疾病包括路易體譜系疾病［包括快動(dòng)眼睡眠行為障礙（rapid eye movement sleep behaviour disorder，RBD）、運(yùn)動(dòng)性PD、PD 伴癡呆、DLB、MSA］和其他類型神經(jīng)退行性病變［包括FTD、進(jìn)行性核上性麻痹（progressive supranuclear palsy，PSP）和皮質(zhì)基底節(jié)變性（corticobasal syndrome，CBS）］血清NDEVs 內(nèi)syntenin-1、clusterin 和α-syn 3 種蛋白水平進(jìn)行定量分析后發(fā)現(xiàn)，RBD、PD 和DLB 患者血清NDEVs 中α-syn升高的水平約是MSA 或其他蛋白病包括FTD、PSP 和CBS 的2 倍，差異有顯著性。而與RBD、PD 和MSA 相比，F(xiàn)TD、PSP 和CBS 患者血清NDEVs 中clusterin水平顯著升高。血清NDEVs中α-syn在鑒別PD和其他非典型帕金森綜合征具有較高的效能，ROC分析AUC 為0.85（敏感性=0.80，特異性=0.74），聯(lián)合α-syn 和clusterin 可顯著提高PD 與其他非典型帕金森綜合征鑒別診斷效能，ROC 分析AUC 為0.98（敏感性=0.94，特異性=0.96），即使在PD 發(fā)病前驅(qū)期也具有較高的鑒別診斷效能（RBD vs 其他非典型帕金森綜合征，AUC=0.98，敏感性=0.95，特異性=0.93）［34］。而在另一項(xiàng)橫斷面研究中，Dutta 等人發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合血清/血漿NDEVs 和ODEVs 中α-syn 可以更好的區(qū)分PD 和MSA 患者，與MSA 患者相比，PD 患者血清/血漿NDEVs 和ODEVs 中α-syn 水平均顯著下降，與NDEVs 中α-syn 相比，ODEVs 中α-syn 水平可以更好的區(qū)分PD 和MSA 患者，其ROC 分析AUC為0.87（敏感性=73.0%，特異性=82.7%）。而當(dāng)聯(lián)合NDEVs 和ODEVs 兩種BCDEVs 后，即ODEVs 中α-syn/NDEVs 中α-syn，其鑒別PD 和MSA 兩種疾病效能更高，其ROC 分析AUC 為0.90（敏感性=89.8%，特異性=86.0%），具有較高的鑒別診斷靈敏性和特異性［72］。

3.2.1.3 外周血BCDEVs 作為PD 進(jìn)展生物標(biāo)志物 Tofaris 等人對(duì)PD 患者進(jìn)行平均（40.3±8.5）個(gè)月隨訪后發(fā)現(xiàn)，血清NDEVs 中α-syn 隨著PD 疾病進(jìn)展而穩(wěn)定升高［34］，而Liu 等人進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在對(duì)早期PD 患者進(jìn)行平均22 個(gè)月隨訪后發(fā)現(xiàn)，與基線血漿NDEVs 內(nèi)a-syn 水平相比，Cox 回歸分析顯示血漿NDEVs內(nèi)a-syn水平的縱向升高與PD運(yùn)動(dòng)癥狀進(jìn)展相關(guān)（hazard ratio=8.92，95%CI1.10～71.4，P=0.039）［69］。以上結(jié)果表明，血漿NDEVs中a-syn水平可作為PD疾病進(jìn)展?jié)撛谏飿?biāo)志物。

3.2.1.4 外周血BCDEVs 作為探索PD 藥物治療潛在作用機(jī)制生物標(biāo)志物 在一項(xiàng)關(guān)于PD 隨機(jī)安慰劑對(duì)照研究中發(fā)現(xiàn)，艾塞那肽可通過調(diào)節(jié)胰島素信號(hào)通路改善PD運(yùn)動(dòng)功能［73］，為了探索艾塞那肽改善PD 運(yùn)動(dòng)功能潛在作用機(jī)制，MRCP 等人通過血清NDEVs 評(píng)估艾塞那肽改善PD 患者運(yùn)動(dòng)功能是否與接受艾塞那肽治療后PD患者腦胰島素和Akt信號(hào)通路活性增強(qiáng)有關(guān)［35］。研究者富集接受艾塞那肽-PD試驗(yàn)的60 例受試者血清NDEVs，并對(duì)其內(nèi)腦胰島素和Akt 信號(hào)通路蛋白進(jìn)行定量分析后發(fā)現(xiàn)，與接受安慰劑治療PD 患者相比，艾塞那肽治療48 周時(shí)PD患者血清NDEVs 內(nèi)酪氨酸磷酸化IRS-1 及其下游底物包括總Akt和磷酸化雷帕霉素機(jī)制性靶點(diǎn)（mechanistic target of rapamycin，mTOR）表達(dá)升高，同時(shí)血清NDEVs 中總mTOR（F4，50=5.34，P=0.001）和磷酸化mTOR（F4，50=4.38，P=0.04）與UPDRS 中第三部分非藥物治療評(píng)分的改善顯著相關(guān)。本研究結(jié)果表明，艾塞那肽改善PD 患者運(yùn)動(dòng)功能可能通過使PD 患者腦胰島素信號(hào)傳導(dǎo)正?；⑴c腦內(nèi)Akt 和mTOR 級(jí)聯(lián)的激活有關(guān)［35］。這為以后使用靶向神經(jīng)元通路的藥物進(jìn)行臨床試驗(yàn)時(shí)，使用基于NDEVs 生物標(biāo)志物闡明藥物靶點(diǎn)參與提供了一種簡單實(shí)用的方法。

3.2.2 MSA 不同于PD 病理特點(diǎn)為α-syn 聚集在神經(jīng)元細(xì)胞為主，MSA患者腦內(nèi)病理性α-syn主要聚集在少突膠質(zhì)細(xì)胞，因此，Zhang 等人對(duì)MSA 患者血漿ODEVs 水平及其內(nèi)α-syn 進(jìn)行定量分析，以評(píng)估其作為MSA 診斷及鑒別診斷生物標(biāo)志物潛力。與PD 患者相比，MSA 患者血漿ODEVs 濃度顯著下降，且具有較好的疾病診斷能力（MSA vs. HC，AUC=0.85，敏感性=3.9%，特異性=71.9%）和鑒別診斷能力（MSA vs. PD，AUC=0.77，敏感性=61.8%，特異性=81.3%）。與PD 患者相比，MSA 患者血漿ODEVs 內(nèi)α-syn 水平顯著降低，隨后通過一系列細(xì)胞及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明導(dǎo)致MSA 患者血漿ODEVs內(nèi)α-syn水平降低原因是由中樞分泌進(jìn)入外周血漿中ODEVs 數(shù)量減少引起，而與每個(gè)ODEVs 中裝載的α-syn 數(shù)量無關(guān)。為了驗(yàn)證MSA 患者中樞到達(dá)外周血漿ODEVs 減少潛在機(jī)制，研究者在MSA 轉(zhuǎn)基因小鼠和原代少突膠質(zhì)細(xì)胞中進(jìn)一步驗(yàn)證了導(dǎo)致MSA 患者血漿ODEVs數(shù)量減少可能與腦內(nèi)α-syn 過量表達(dá)聚集介導(dǎo)的干擾syntaxin4 和VAMP2 之間的相互作用，進(jìn)而導(dǎo)致可溶性N-乙基馬來酰亞胺敏感融合因子附著蛋白受體復(fù)合物的功能障礙，最終引起少突膠質(zhì)細(xì)胞MVB 釋放過程障礙［41］。以上結(jié)果表明，血漿ODEVs 及其內(nèi)α-syn 水平具有作為MSA 診斷及鑒別診斷生物標(biāo)志物潛力，MSA 患者血漿中減少的ODEVs 可能與少突膠質(zhì)細(xì)胞病理性α-syn 聚集增加有關(guān)，然而外周血ODEVs 作為MSA 生物標(biāo)志物的潛力仍需要進(jìn)一步的探索。

4 外周血BCDEVs 作為多發(fā)性硬化（multiple sclerosis，MS）生物標(biāo)志物研究

MS 是一種免疫介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病，約15%患者表現(xiàn)為原發(fā)進(jìn)展型MS（primary progressive MS，PPMS）［74，75］，臨床中對(duì)于MS 分型診斷仍較困難，為了尋找MS 不同亞型生物標(biāo)志物，Agliardi等人對(duì)MS 患者不同亞型［臨床孤立綜合征（clinically isolated syndrome，CIS）、PPMS和復(fù)發(fā)緩解型MS（relapsing remitting MS，RRMS）］及HC 血清ODEVs中髓鞘堿基蛋白（myelin basic protein，MBP）進(jìn)行定量分析，探討其作為MS分型診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物潛力。結(jié)果顯示，與HC 相比，CIS（P＜0.001）、RRMS（P＜0.001）和PPMS（P＜0.001）血清ODEVs中MBP濃度顯著升高，此外，與RRMS（P=0.004）和CIS（P=0.03）相比，PPMS 患者血清ODEVs 內(nèi)MBP 濃度顯著增加。HC 與MS 患者（CIS、RRMS 和PPMS）血清ODEVs 中MBP 水平ROC 分析AUC 為0.96（敏感性=97.84%，特異性=100.00%），PPMS 與RRMS+CIS 血清ODEVs 中MBP 水平ROC 分析AUC 為0.80（敏感性=66.67%，特異性=87.50%）。Pearson 相關(guān)性分析顯示，血清ODEVs 中MBP 水平分別與擴(kuò)展殘疾狀態(tài)量表（r=0.32，P＜0.01）和多發(fā)性硬化嚴(yán)重程度評(píng)分（r=0.32，P＜0.01）顯著正相關(guān)。以上結(jié)果表明血清ODEVs 中MBP 水平可作為MS 分型診斷和監(jiān)測疾病進(jìn)展?jié)撛谏飿?biāo)志物。

5 外周血BCDEVs 作為創(chuàng)傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）生物標(biāo)志物研究

TBI是指大腦遭受外部機(jī)械力創(chuàng)傷后引起腦部功能紊亂的復(fù)雜性疾病，世界范圍內(nèi)，每年約5 000多萬人罹患TBI，約一半人口一生中會(huì)發(fā)生一次或多次TBI［76］，目前已成為世界性公共衛(wèi)生問題。TBI后引起的慢性腦功能紊亂包括認(rèn)知障礙（cognitive impairment，CI）、慢性腦震蕩及創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙（posttraumatic stress disorder，PTSD），尤其是對(duì)于運(yùn)動(dòng)員或者軍人等在訓(xùn)練或者參加軍事行動(dòng)過程中較易發(fā)生輕中度TBI 的特殊人群，往往由于缺乏臨床癥狀及影像學(xué)表現(xiàn)而診斷困難，因此臨床中急需尋找一些可靠輕中度TBI 診斷生物標(biāo)志物，以便早期發(fā)現(xiàn)，早期干預(yù)。

Goetzl 等人分別納入了年齡在18～26 歲1 周內(nèi)發(fā)生運(yùn)動(dòng)相關(guān)的急性輕度TBI（mild TBI，mTBI）、超過3個(gè)月發(fā)生2～4次運(yùn)動(dòng)相關(guān)慢性mTBI及HC，富集上述受試者血漿NDEVs。與HC 相比，僅急性mTBI血漿NDEVs 濃度顯著降低，并且其內(nèi)一系列神經(jīng)功能性腦蛋白包括ras 相關(guān)的小GTPase10、annexinⅦ、泛素C 末端水解酶L1、AII 血影蛋白片段、claudin-5、氯化鈉-鉀協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1 和AQP4 水平相較于HC 顯著異常，表現(xiàn)為不同程度地升高或降低［77］。隨后Goetzl 等人又探討了慢性TBI 對(duì)CI 患者血漿NDEVs 內(nèi)蛋白水平的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在TBI 后3～12 個(gè)月內(nèi)，與TBI無CI患者相比，TBI合并CI患者血漿NDEVs內(nèi)細(xì)胞朊病毒蛋白、突觸素-3、P-T181-Tau、P-S396-Tau 和Aβ42 水平顯著升高，而claudin-5、annexin Ⅶ和AQP4在有無TBI合并CI兩組患者中均未升高［78］。而在隨后的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，Winston等人［79］發(fā)現(xiàn)TBI患者血漿NDEVs 中存在高水平Aβ42，可對(duì)體外培養(yǎng)的神經(jīng)元細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用，可損壞神經(jīng)元細(xì)胞膜的完整性，進(jìn)一步證明了TBI 患者血漿NDEVs 中神經(jīng)退行性變生物標(biāo)志物的存在［79］。以上結(jié)果提示急慢性TBI 可能引起大腦不同病理學(xué)改變，這為運(yùn)動(dòng)相關(guān)mTBI誘導(dǎo)的神經(jīng)退行性病變尋找可供參考的病因?qū)W上的生物標(biāo)志物提供新思路。同時(shí)血漿NDEVs 中神經(jīng)退行性變相關(guān)蛋白的異常，為TBI介導(dǎo)的CI潛在藥物開發(fā)提供新的治療靶點(diǎn)。

隨后Goetzl 等人通過對(duì)TBI 患者血漿ADEVs 內(nèi)神經(jīng)毒性補(bǔ)體蛋白水平定量分析，探討補(bǔ)體介導(dǎo)的TBI 潛在發(fā)病機(jī)制。發(fā)現(xiàn)急性TBI 后血漿ADEVs 水平下降，并在幾個(gè)月內(nèi)恢復(fù)正常。與HC 相比，急性TBI血漿ADEVs內(nèi)經(jīng)典途徑C4b、替代途徑因子D和因子Bb、凝集素途徑甘露糖結(jié)合凝集素、共享神經(jīng)毒性效應(yīng)物C3b 和C5b-9 末端C 復(fù)合物水平顯著升高，并且在隨后長達(dá)數(shù)十年時(shí)間里一直維持在較高水平［80］。以上結(jié)果表明補(bǔ)體系統(tǒng)的激活可能參與了TBI的病理，提示開發(fā)補(bǔ)體抑制劑可能對(duì)急性TBI有治療作用。

為了尋找外周血中與TBI 后慢性腦震蕩和PTSD相關(guān)生物標(biāo)志物，Gill等人［81］對(duì)軍人mTBI血漿NDEVs 內(nèi)Tau、Aβ42、TNFα、IL-6 和白介素-10（IL-10）水平進(jìn)行定量分析后發(fā)現(xiàn)。與無mTBI 組相比，mTBI 組血漿NDEVs 內(nèi)Tau、Aβ42 和IL-10 水平顯著升高，回歸分析顯示mTBI 后腦震蕩癥狀與NDEVs內(nèi)Tau 蛋白升高相關(guān)（B=0.70，t=2.95，P＜0.01），PTSD癥狀與NDEVs內(nèi)IL-10水平升高相關(guān)（B=0.8，t=2.60，P＜0.01）。這些發(fā)現(xiàn)表明Tau 蛋白可能參與mTBI 后慢性腦震蕩癥狀病理，同時(shí)也提示mTBI 后PTSD 可能與中樞炎癥活動(dòng)增強(qiáng)有關(guān)，為炎癥可能參與TBI后慢性PTSD提供新證據(jù)［81］。

6 外周血BCDEVs作為MDD生物標(biāo)志物研究

WHO 已將MDD 列為全球殘疾的最大單一因素［82，83］。既往研究發(fā)現(xiàn)MDD 患者血液中神經(jīng)遞質(zhì)、色氨酸代謝物、內(nèi)分泌激素、免疫細(xì)胞因子以及生長和神經(jīng)營養(yǎng)因子的濃度與HC 相比存在顯著差異［84～87］，這些基于血液生物標(biāo)志物研究增加了對(duì)MDD 相關(guān)病理生理的理解，但這些變化通常缺乏疾病特異性和關(guān)于MDD 嚴(yán)重程度或?qū)χ委煼磻?yīng)變化的預(yù)測能力。最近發(fā)表的一些文章評(píng)估了從MDD患者血漿或血清富集的NDEVs 或ADEVs 中潛在生物標(biāo)志物，例如IRS-1［88］、線粒體蛋白［89］、外泌體大小和miRNA［90］以及炎性分子［91］，為客觀識(shí)別MDD及其潛在發(fā)病機(jī)制提供了新思路。

Rong等人比較了MDD（70例）和HC（70例）血清ADEVs 內(nèi)多個(gè)炎癥因子變化后發(fā)現(xiàn)，與HC 相比，MDD 患者血清ADEVs 中干擾素-γ、IL-12p70、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α 和IL-17A 均顯著增加，單個(gè)炎癥因子ROC 分析AUC 介于0.52～0.70 之間，聯(lián)合上述多個(gè)差異表達(dá)炎癥因子ROC 分析AUC 為0.92（95%CI0.860～0.974），然而，多重比較校正后，MDD 患者上述差異表達(dá)炎癥因子與發(fā)病年齡、病程、當(dāng)前發(fā)作時(shí)間和抑郁嚴(yán)重程度等臨床特征之間無相關(guān)性［91］。

既往研究表明，外周血BCDEVs 及其內(nèi)容物可作為MDD 抗抑郁治療反應(yīng)生物標(biāo)志物。Goetzl 等人［89］在一項(xiàng)共納入20 例MDD 患者小樣本臨床研究中，通過觀察接受8 周選擇性血清素再攝取抑制劑（selective serotonin reuptake inhibitor，SSRI）治療前后MDD 患者血漿NDEVs 中14 種功能性線粒體蛋白包括線粒體動(dòng)力和功能維持類蛋白、線粒體能量產(chǎn)生類蛋白、線粒體代謝和細(xì)胞存活類蛋白和線粒體生物發(fā)生類蛋白變化后發(fā)現(xiàn)，與HC 相比，MDD 患者SSRI 治療前基線期血漿NDEVs 內(nèi)控制線粒體生物發(fā)生和許多抗氧化基因反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄2 型核呼吸因子（transcriptional type 2 nuclear respiratory factor，NRF2）、親環(huán)素D、線粒體融合蛋白2、亮氨酸拉鏈EF-手含跨膜1 蛋白的鈣通道/鈣通道增強(qiáng)劑成分、線粒體連接蛋白突觸親蛋白、肌球蛋白Ⅵ、內(nèi)膜電子傳遞復(fù)合物Ⅰ和Ⅲ、煙酰胺單核苷酸腺苷酸轉(zhuǎn)移酶2、神經(jīng)元線粒體代謝調(diào)節(jié)和保護(hù)因子人蛋白和線粒體12S rRNAC開放閱讀框蛋白均顯著降低，而促神經(jīng)退行性NADase 不育α 和含有TIR 基序的蛋白質(zhì)1 水平顯著升高。在對(duì)SSRI治療有反應(yīng)的MDD患者中，除復(fù)合物Ⅰ、NRF2和PPAR γ 輔激活劑-1α 外，其他線粒體功能蛋白水平恢復(fù)正常，而在對(duì)SSRI治療無反應(yīng)MDD患者中，上述血漿NDEVs 線粒體功能蛋白水平未見改變［89］。而在另一項(xiàng)研究中，Saeedi 等人分別從兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)（基線和隨訪8 周后）對(duì)艾司西酞普蘭治療有反應(yīng)（n=20）和無反應(yīng)（n=20）MDD 患者血漿NDEVs分析后發(fā)現(xiàn)，與HC 相比，未經(jīng)治療MDD 血漿NDEVs平均直徑變小，蒙哥馬利抑郁量表（montgomery-asberg depression rating scale，MADRS）評(píng)分變化與平均NDEVs 大小隨治療的變化之間存在顯著相關(guān)性（r=-0.196，P＜0.01），同時(shí)血漿NDEVs 內(nèi)miR-423-3p、miR-191-5p、miR-486-5p、miR-30d-5p、miR-425-5p、miR-25-3p、miR-21-5p、miR-335-5p 和miR-126-5p 水平隨抗抑郁治療反應(yīng)發(fā)生顯著性差異改變，miR-21-5p、miR-30d-5p 和miR-486-5p 三條miRNA 組合預(yù)測MDD 患者艾司西酞普蘭抗抑郁治療反應(yīng)ROC 分析AUC為0.83（敏感性=76%，特異性=84%）［90］。以上結(jié)果表明，MDD 患者血漿NDEVs大小和其內(nèi)線粒體蛋白和miRNA 水平的改變可作為評(píng)估抗抑郁藥物反應(yīng)生物標(biāo)志物。

胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)神經(jīng)可塑性、大腦代謝及全身能量代謝都至關(guān)重要［92～95］，既往研究表明，胰島素抵抗參與MDD 病理生理過程［96，97］。Nasca 等人通過對(duì)MDD 患者血漿NDEVs及其內(nèi)IRS-1和絲氨酸-312磷酸化IRS-1（pSer-IRS-1）定量分析后發(fā)現(xiàn)，與HC 相比，MDD患者血漿NDEVs濃度增加，NDEVs內(nèi)IRS-1水平升高，并且IRS-1 水平的升高與MDD 患者自殺和快感缺失相關(guān)［88］。這些發(fā)現(xiàn)為建立腦胰島素抵抗機(jī)制框架提供了新見解，也為進(jìn)一步MDD 藥物治療開發(fā)提供新的藥物靶點(diǎn)依據(jù)。

7 外周血BCDEVs 作為其他精神性疾病生物標(biāo)志物研究

除了探索BCDEVs 作為MDD 潛在生物標(biāo)志物外，研究者還探索BCDEVs 作為其他精神性疾病包括首發(fā)精神?。╢irst-episode psychotics，F(xiàn)P）、壓力誘發(fā)疲勞障礙（stress-induced exhaustion disorder，SED）和雙相情感障礙（bipolar disorder，BD）潛在生物標(biāo)志物價(jià)值。

在一項(xiàng)小樣本病例對(duì)照研究中，Goetzl 等人［98］對(duì)10名未經(jīng)治療FP患者血漿ADEVs和NDEVs內(nèi)神經(jīng)線粒體電子傳遞蛋白和補(bǔ)體蛋白進(jìn)行定量分析后發(fā)現(xiàn)。與HC 相比，F(xiàn)P 患者血漿ADEVs 和NDEVs 中NADH-泛醌氧化還原酶（復(fù)合物Ⅰ）的亞基1和6以及細(xì)胞色素b-c1 氧化酶（復(fù)合物Ⅲ）的亞基10 水平顯著降低。與HC 相比，F(xiàn)P 患者血漿ADEVs 中膠質(zhì)纖維酸性蛋白和C3b 調(diào)節(jié)蛋白水平顯著升高，神經(jīng)保護(hù)蛋白白血病抑制因子水平顯著降低［98］。隨后Goetzl 等人又對(duì)FP 患者血漿NDEVs 和ADEVs 內(nèi)線粒體神經(jīng)保護(hù)蛋白進(jìn)行定量分析后發(fā)現(xiàn)。與HC 相比，F(xiàn)P 患者血漿ADEVs 和NDEVs 內(nèi)線粒體融合蛋白2、親環(huán)素D、線粒體短開放閱讀框神經(jīng)保護(hù)及代謝調(diào)節(jié)肽人蛋白和線粒體12S rRNA-C 開放閱讀框蛋白水平顯著降低［99］。而在另一項(xiàng)對(duì)FP 患者血漿NDEVs 中線粒體鈣離子通道蛋白水平研究發(fā)現(xiàn)，與HC相比，F(xiàn)P患者血漿NDEVs中亮氨酸拉鏈EF-手含跨膜1 蛋白、瞬時(shí)受體電位陽離子通道亞家族M 成員4 和溶質(zhì)載體家族8 成員B1 或線粒體Na+/Ca2+交換物的水平顯著降低，而電壓依賴的l型鈣通道亞基α-1C水平顯著升高［100］。以上結(jié)果表明血漿BCDEVs內(nèi)線粒體蛋白和補(bǔ)體蛋白水平可能有助于預(yù)測FP，有助于了解FP 背后潛在發(fā)病機(jī)制，同時(shí)為探尋FP潛在藥物治療靶點(diǎn)提供新思路。

越來越多的證據(jù)表明，神經(jīng)炎癥與BD的發(fā)病有關(guān)，TNF-α 拮抗劑英夫利昔單抗可改善BD 和兒童虐待史個(gè)體亞群抑郁癥狀［101］。為了探索英夫利昔單抗抗抑郁作用機(jī)制介質(zhì)，Mansur 等人分別富集55 例成人BD在基線和治療第2周、6周、12周（終點(diǎn)）血漿NDEVs，對(duì)其內(nèi)的細(xì)胞炎癥因子進(jìn)行定量分析后發(fā)現(xiàn)，英夫利昔單抗可通過TNFR1、NF-κB 和NF-κB 抑制劑的時(shí)間相互作用來改善合并兒童虐待史BD 患者抑郁樣癥狀，在英夫利昔單抗治療患者中，血漿NDEVs 內(nèi)TNFR1 水平降低與MADRS 評(píng)分降低相關(guān)，在第6 周（r=0.672，P=0.005）比第2 周（r=0.849，P=0.985）或第12 周（r=0.801，P=0.128）更明顯，同時(shí)TNFR1 水平降低與整體大腦皮質(zhì)厚度增加相關(guān)（r=-0.581，P=0.029）。以上結(jié)果提示，英夫利昔單抗可能以兒童期創(chuàng)傷依賴的方式參與BD 患者TNFR/NF-κB神經(jīng)炎癥通路［102］。

綜上所述，外周血BCDEVs 包含的多種與疾病相關(guān)生物分子和數(shù)量變化在CNS 疾病的早期診斷、鑒別診斷、疾病預(yù)測、預(yù)后評(píng)估以及疾病機(jī)制研究方面扮演著重要的角色，顯示出較好的診斷、預(yù)后及療效評(píng)估等潛力，然而，這些生物標(biāo)志物的特異性和敏感性仍需進(jìn)一步研究和驗(yàn)證，尤其需要大規(guī)模多中心臨床研究來驗(yàn)證其作為生物標(biāo)志物的可靠性、準(zhǔn)確性和臨床應(yīng)用價(jià)值。同時(shí)目前基于BCDEVs 生物標(biāo)志物研究尚處于實(shí)驗(yàn)室研究起步階段，具體的BCDEVs 在腦內(nèi)如何包裝致病性蛋白及EVs 如何從中樞轉(zhuǎn)運(yùn)到外周的潛在機(jī)制尚不清楚。然而盡管如此，基于血液的中樞來源的生物標(biāo)志物有可能徹底改變臨床過程中識(shí)別和監(jiān)測患者的方式，代替進(jìn)行一系列冗長而繁瑣的檢測，開發(fā)一種分析血液中多種疾病相關(guān)蛋白質(zhì)組合的單一方法，將提高外周血BCDEVs 在臨床試驗(yàn)中對(duì)患者試驗(yàn)和結(jié)果監(jiān)測的診斷準(zhǔn)確性。同時(shí)基于外周血BCDEVs 研究，也可早期確定某些藥物治療的有益和/或有害結(jié)局，進(jìn)而可以指導(dǎo)制藥公司和其他研究人員在進(jìn)行臨床試驗(yàn)前期初步了解藥物對(duì)疾病的影響，以提高藥物研發(fā)效率。同時(shí)由于EVs 可雙向通過BBB，可以制造攜帶信號(hào)分子、藥物或小干擾RNA的EVs，將這些化合物通過BBB運(yùn)輸?shù)侥X部，以靶向特定的細(xì)胞亞型，這將克服BBB 本身對(duì)大腦運(yùn)送的限制，并提供良好的生物相容性、高靶向特異性和低免疫原性［103］。

8 基于外周血BCDEVs研究面臨的挑戰(zhàn)

雖然基于外周血BCDEVs 是一個(gè)迅速發(fā)展和極具前景的研究領(lǐng)域，然而，要使這些分析成為測量CNS 疾病生物標(biāo)志物的標(biāo)準(zhǔn)方法，還需要克服諸多挑戰(zhàn)。如上所述，為了富集外周血BCDEVs，需尋找更加特異性BCDEVs標(biāo)記物，如由Zhang等人鑒定的L1CAM 分子雖然顯示出神經(jīng)元細(xì)胞起源特異性［31］，并在多個(gè)研究中被證實(shí)［90，104］，然而，目前已知L1CAM 也在某些腫瘤和其他一些細(xì)胞如腎細(xì)胞中表達(dá)［105］，雖然目前沒有直接證據(jù)表明外周血中L1CAM 陽性EVs 是從腎臟和其他外周細(xì)胞類型中分泌，同時(shí)最近一篇研究甚至認(rèn)為血液中L1CAM 可能與NDEVs 無關(guān)［45］。同樣，其他CNS 不同腦細(xì)胞包括星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞來源特異性EVs 表面標(biāo)記物，以及來自受不同CNS 疾病影響的不同大腦區(qū)域的特異性分子標(biāo)記物也應(yīng)進(jìn)一步探索，以確定對(duì)每種CNS 疾病更加特異性的生物標(biāo)記物候選分子。因此，識(shí)別更具有CNS 特異性或特定于腦細(xì)胞亞群或特定腦區(qū)的EVs表面標(biāo)記物是本領(lǐng)域目前面臨的重要挑戰(zhàn)之一。外周血BCDEVs研究另一個(gè)面臨的挑戰(zhàn)是EVs的分離和表征。雖然目前已建立多種EVs 分離和表征方法，但這些分離和表征方法都有各自的局限性，并且大多數(shù)分離和表征方法還沒有建立標(biāo)準(zhǔn)化流程，使得該領(lǐng)域無法具體定義不同研究人員所研究的EVs 亞群，這也解釋了為何不同課題組實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不一致性［32，36，106］。因此，未來可進(jìn)一步開發(fā)用于單個(gè)EVs 分離和表征的新技術(shù)，使用多個(gè)標(biāo)記分子準(zhǔn)確可靠地分析單個(gè)EVs具有許多優(yōu)勢，如減少污染信號(hào)/噪聲，減少對(duì)樣品材料的要求，以及更容易定位EVs亞群，以便更快速、敏感和準(zhǔn)確地對(duì)EVs進(jìn)行分析。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：張高嘉負(fù)責(zé)設(shè)計(jì)論文框架、收集文獻(xiàn)、起草論文和論文修改；孔巖、李玲、焦嬌、徐丹丹、曹育嘉和劉夢雨論文修改；張志珺負(fù)責(zé)對(duì)文章的知識(shí)性內(nèi)容作批評(píng)性審閱及論文修改。