景榮先 曾 媛 張國林

1.南京醫(yī)科大學附屬蘇州醫(yī)院 蘇州市立醫(yī)院藥學部，江蘇蘇州 215002；

2.輝瑞 （中國）研究開發(fā)有限公司中國藥物研發(fā)部臨床藥理部，上海 201203；

3.蘇州市藥品檢驗檢測研究中心，江蘇蘇州 215104

單克隆抗體（monoclonal antibody，mAb）已成為抗腫瘤治療領(lǐng)域發(fā)展最為迅猛的生物藥類型[1-2]。目前已批準上市的治療性mAb 類藥物有70 余種，結(jié)構(gòu)多為兩條重鏈和兩條輕鏈經(jīng)二硫鍵和非共價鍵聯(lián)合形成的免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）大分子。mAb 類藥物抗原表位、理化性質(zhì)和生物活性均一性程度較高，能特異性與靶標分子結(jié)合，免疫原性低，患者耐受性好。但由于其分子量大、立體結(jié)構(gòu)復雜，在生產(chǎn)、純化、貯存和運輸?shù)冗^程中易產(chǎn)生變異體，影響藥物的安全性、有效性、穩(wěn)定性和生物學活性，甚至產(chǎn)生免疫原性導致嚴重后果[3-4]。

程序性死亡受體-1（programmed cell death protein 1，PD-1）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等都是mAb 藥物的靶點[5-6]。腫瘤細胞高表達細胞程序性死亡-配體1/2（programmed cell death ligand 1/2，PD-L1/L2），抑制T 細胞功能，導致腫瘤細胞無法被殺滅，而PD-1 mAb 藥物可以阻斷這一通路，恢復T 細胞功能，使免疫細胞繼續(xù)殺傷腫瘤細胞。血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）參與多種惡性腫瘤的發(fā)生和細胞遷移、凋亡過程，是腫瘤治療的關(guān)鍵靶點之一。隨著臨床需求的增加和抗VEGF mAb 原研藥（安維?。＠狡冢瑖鴥?nèi)相關(guān)生物類似藥貝伐珠單抗的研發(fā)如火如荼，并已有9 個品種獲批。目標產(chǎn)品質(zhì)量概況（quality target of product profile，QTPP）是產(chǎn)品質(zhì)量屬性的前瞻性總結(jié)和預期目標，是與產(chǎn)品質(zhì)量、安全和有效性相關(guān)的質(zhì)量屬性。質(zhì)量屬性可分作關(guān)鍵的和非關(guān)鍵的：質(zhì)量屬性是否作為關(guān)鍵質(zhì)量屬性（critical quality attributes，CQAs）主要通過評價其超出可接受范圍時對產(chǎn)品安全性和有效性的影響程度[7-8]。

研究mAb 類生物制品CQAs、分析其雜質(zhì)檢測結(jié)果準確可靠的影響因素對產(chǎn)品治療控制和臨床用藥安全具有重要的價值。

1 單抗類藥物的CQAs

CQAs 是mAb 類藥物符合預期用途的關(guān)鍵屬性，通常根據(jù)產(chǎn)品特點及QTPP 方面切入分析。mAb 的CQAs 主要包括等電點、單體、大小變異體、電荷變異體、N-糖基化修飾、唾液酸含量、生物學活性等，是影響藥品安全性和有效性的重要指標。CQAs 與產(chǎn)品的高級結(jié)構(gòu)、生物活性及免疫原性等均密切相關(guān)。單體是PD-1 mAb 藥物的作用基礎(chǔ)，分子大小變異體是最常見的變異體類型，也是影響抗體穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素。分子大小變異體影響抗體的活性和效價，使蛋白單體濃度降低，增加藥物的免疫原性。鑒定分子大小變異體的種類，分析其形成的機制和對產(chǎn)品質(zhì)量的影響并采取適當控制措施是單抗類產(chǎn)品整個生命周期中都需要關(guān)注的問題。分子大小變異體包括高分子量變異體（high molecular weight，HMW）和低分子量變異體（low molecular weight，LMW）。前者主要是mAb 藥物發(fā)生聚合形成二聚體或多聚體形成的，后者是由于mAb 藥物發(fā)生降解或分子發(fā)生斷裂形成低分子量蛋白造成的。分子大小變異體隨時間變化率可提供聚體的功能特征，且對應(yīng)著mAb 藥物產(chǎn)品的有效期。

1.1 電荷異質(zhì)性

電荷異質(zhì)性是mAb 藥物變異體的另一類型[9]。細胞培養(yǎng)條件變化、純化工藝及產(chǎn)品儲存條件變化等均會引起mAb 藥物電荷異質(zhì)性。mAb 藥物電荷異質(zhì)性會影響單抗的穩(wěn)定性，對其功能和組織分布及藥代動力學均有明顯的影響。電荷變異體分析是mAb 藥物質(zhì)量控制的重要參數(shù)。酸性變異體與堿性變異體是mAb 藥物電荷變異體的主要類型，其中門冬酰胺脫酰胺和糖化修飾是酸性變異體的常見來源。

1.2 等電點（isoelectric point，pI）

等電點是反映mAb 電荷異質(zhì)性的關(guān)鍵指標，可體現(xiàn)藥物電荷與空間構(gòu)象的均一性[10]。采用等點聚焦電泳（iso-electric focusing，IEF）分析時，酸性變異體的表觀pI 小于抗體主峰，而采用陽離子交換色譜（cation exchange chromatography，CEX）分析時，酸性變異體的保留時間小于抗體主峰。mAb的C 端發(fā)生Lys 修飾及N 端谷氨酰胺的不完全環(huán)化是堿性變異體的主要來源。門冬氨酸異構(gòu)化及甲硫氨酸氧化也是堿性變異體的重要原因。采用IEF 分析時，堿性變異體的表觀pI 大于抗體主峰，而采用CEX 分析時，堿性變異體的保留時間大于抗體主峰。mAb 藥物電荷異質(zhì)性分析可以作為批間一致性評價的參考指標，也可通過分析電荷的分布情況監(jiān)測整個生產(chǎn)工藝流程，推動產(chǎn)品生產(chǎn)工藝的優(yōu)化。mAb 藥物電荷變異體的檢測技術(shù)主要包括離子交換色譜（ion exchange high performance liquid chromatography，IEX-HPLC）、毛細管等電聚焦電泳（capillary iso-electric focusing， cIEF）和全柱成像毛細管等電聚焦電泳（imaging capillary electrofocusing electrophoresis，iCIEF）等[11-15]。

mAb 藥物變異體的產(chǎn)生是一個動態(tài)過程，分析引起變異體的因素并采取應(yīng)對措施可以有效降低變異體的發(fā)生率。分析變異體隨時間變化的趨勢并采取措施對產(chǎn)品實施質(zhì)量控制比檢測終產(chǎn)品變異體更為重要，而揭示單抗類產(chǎn)品容易發(fā)生聚集的機制，并從產(chǎn)品設(shè)計和工藝改進以降低變異體的發(fā)生比分析變異體的時間變化趨勢更重要。

1.3 糖基化

大部分mAb 是由中華倉鼠卵巢細胞（Chinese hamster ovary cells，CHO）表達系統(tǒng)生產(chǎn)的。mAb生產(chǎn)過程中易受到各種內(nèi)外部因素影響而發(fā)生翻譯后修飾（post-translational modification，PTM）而產(chǎn)生變異體影響mAb 的穩(wěn)定型和與目標抗原的結(jié)合活性，并可能產(chǎn)生免疫原性。糖基化（glycosylation）和糖化（glacation）修飾是最常見的PTM 類型[16-17]。糖化為非酶促化學修飾反應(yīng)，主要是還原糖（葡萄糖、半乳糖等）的醛基與生物大分子（核酸、蛋白質(zhì)等）的伯氨基發(fā)生縮合反應(yīng)形成Schiff 堿，進一步發(fā)生Amadori 重排并形成穩(wěn)定的共價鍵的狀態(tài)。在抗體藥物中，糖化主要發(fā)生在重鏈互補決定區(qū)3 的Lys 上。糖化是重組抗體藥物異質(zhì)性的重要原因，對該類藥物的結(jié)構(gòu)、理化特性和穩(wěn)定型及安全性造成不利影響。糖基化為酶促化學修飾反應(yīng)，即在糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下，非糖生物大分子與糖共價結(jié)合的反應(yīng)[18]。N-糖基化和O-糖基化是最常見的糖基化連接方式。mAb 的翻譯后糖基化修飾會影響藥物的穩(wěn)定型、溶解性和空間結(jié)構(gòu)及生物活性等，也會對該類藥物在體內(nèi)的代謝和分布造成一定的影響。目前，F(xiàn)DA 和EMEA 及中國藥典等均要求對mAb 藥物的糖化水平進行分析。mAb 的糖基化是其CQAs 之一。N-糖基化和O-糖基化是PD-1 mAb 藥物的主要糖基化修飾。N-糖基化即寡糖連接到門冬酰胺上，其經(jīng)典的保守序列為Asn-AASer/Thr-AA。PD-1mAb 藥物上N-糖基化的發(fā)生與宿主細胞、培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件有關(guān)。mAb 藥物糖化的重鏈和輕鏈在還原的十二烷基硫酸鈉-毛細管電泳（capillary electrophoresis-sodiumdodecyl sulfate，CE-SDS）表現(xiàn)為峰圖展寬，且輕鏈在紫外光或激光誘導熒光檢測可出現(xiàn)肩峰，可用于PD-1 mAb藥物的糖型分析。采用常規(guī)紫外檢測器或熒光檢測器的親水作用色譜和毛細管電泳等是基于標記的糖型分析手段[19-20]。O-糖基化是在糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下，在Ser 或Thr 上連接糖鏈的過程。O-糖基化糖鏈結(jié)構(gòu)復雜，無典型的核心結(jié)構(gòu)和通用的內(nèi)切酶，分析難度較大。O-糖基化的分析策略通常是采用β 消除釋放O-糖鏈，對釋放的糖鏈進行熒光標記后進行色譜分離和熒光檢測器檢測。

1.4 生物學活性

生物學活性是單抗類藥物篩選、表征和放行的重要屬性，也是穩(wěn)定性研究的重要指標。雖然儀器分析技術(shù)的進步為單抗分子結(jié)構(gòu)的確定提供了新的思路和手段，但其高級結(jié)構(gòu)及其翻譯后修飾的研究仍存在諸多局限性。生物學活性分析是分析單抗類生物制品高級結(jié)構(gòu)研究的重要措施。目前，單抗類藥物生物學活性分析的方法主要有細胞毒性法、細胞增殖抑制法、補體依賴的細胞毒性法、抗體依賴的細胞介導的細胞毒性法和報告基因法等[21-26]。生物學活性是反映生物學性質(zhì)的重要方法，是體現(xiàn)單抗類藥物特定生物學效應(yīng)的量值，是藥物高級結(jié)構(gòu)確證的補充，是單抗類藥物的關(guān)鍵質(zhì)量屬性之一。

2 小結(jié)

mAb 已成為抗腫瘤治療領(lǐng)域發(fā)展最為迅猛的生物藥物類型。但由于其分子量大、立體結(jié)構(gòu)復雜，在生產(chǎn)、純化、貯存和運輸?shù)冗^程中易產(chǎn)生變異體，影響藥物的安全性、有效性、穩(wěn)定性和生物學活性，甚至產(chǎn)生免疫原性造成嚴重后果。研究mAb 類生物制品CQAs、分析其雜質(zhì)檢測結(jié)果準確可靠的影響因素對產(chǎn)品治療控制和臨床用藥安全具有重要的價值。

mAb 的CQAs 主要包括等電點、單體、大小變異體、電荷變異體、N-糖基化修飾、唾液酸含量、生物學活性等，是影響藥品安全性和有效性的重要指標，與產(chǎn)品安全性和有效性均密切相關(guān)。