李 彥，符慧靖，秦建鵬，路玉倩，梁麗雅，吳子健，馬儷珍*

（1 天津農(nóng)學(xué)院 食品科學(xué)與生物工程學(xué)院 天津300384 2 天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院 天津 300134）

鹵牛肉是一道傳統(tǒng)菜品。為適應(yīng)中餐工業(yè)化的發(fā)展需求，本試驗(yàn)將這一傳統(tǒng)菜品制成工業(yè)化的方便菜肴產(chǎn)品。目前，傳統(tǒng)醬鹵肉制品主要通過(guò)熱力殺菌來(lái)延長(zhǎng)產(chǎn)品貨架期。熱力殺菌包括高溫殺菌和低溫殺菌。高溫殺菌雖可以有效地殺滅微生物，但會(huì)導(dǎo)致肉制品色澤變暗、風(fēng)味變差、營(yíng)養(yǎng)流失、脂肪氧化程度加?。坏蜏貧⒕m可以保證產(chǎn)品感官品質(zhì)不被破壞，但會(huì)使未被殺滅的殘存微生物芽孢在適宜條件下迅速生長(zhǎng)，導(dǎo)致產(chǎn)品品質(zhì)下降。因此將低溫殺菌與添加復(fù)配的天然防腐劑/抗氧化劑結(jié)合，在保證產(chǎn)品感官品質(zhì)的同時(shí)可延長(zhǎng)產(chǎn)品貨架期[1]。

隨著人們生活水平的提高，追求安全、健康、營(yíng)養(yǎng)的食品逐漸成為人們的主流需求。傳統(tǒng)的肉制品加工中，常用的化學(xué)防腐劑有苯甲酸、山梨酸鉀、脫氫乙酸等[2]。研究表明，某些化學(xué)防腐劑存在致癌、致毒等安全隱患，如苯甲酸、亞硝酸鹽類(lèi)等[3]，因此，天然食品添加劑受到廣泛關(guān)注。許多研究表明，天然保鮮劑如天然香辛料提取物不僅可以改善肉品風(fēng)味，還能較好地延長(zhǎng)產(chǎn)品貨架期[4]，有抗癌的醫(yī)學(xué)價(jià)值[5]。樊曉盼等[6]發(fā)酵的牛骨調(diào)味基料不僅有抑菌、抗氧化作用，也有部分代替亞硝酸鹽發(fā)色的作用。天然防腐劑，如茶多酚[7]、殼聚糖[8]、乳酸鏈球菌素[9]、溶菌酶[10]等對(duì)肉制品有很好的抑菌和抗氧化效果，其中茶多酚、殼聚糖對(duì)亞硝酸鹽有很好的清除效果，溶菌酶對(duì)增強(qiáng)人體免疫力有一定作用[11]。蜂膠作為一種天然藥物，不僅具有抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、抗癌等藥理功效[12]，被添加到食品中，還有抑菌和成膜作用，減少微生物侵染，起到防腐保鮮作用[13]。在使用這些天然添加劑時(shí)，普遍認(rèn)為多種生物活性的化學(xué)物質(zhì)之間的協(xié)同作用，要大于個(gè)體效應(yīng)的總和[14]。許多研究者通常將這些防腐劑進(jìn)行復(fù)配，從而達(dá)到更好的效果。García-García 等[15]研究香辛料提取物——香芹酚、麝香草酚和丁香酚在液體模擬體系中對(duì)李氏桿菌的殺菌效果，結(jié)果其抗菌效果是：三元混合物>二元混合物>單獨(dú)使用。朱雪蕊等[16]將溶菌酶0.1%、茶多酚1.0%、聚賴氨酸0.03%復(fù)配，添加到紅腸中，在4℃貯藏溫度下，產(chǎn)品的保質(zhì)期可達(dá)90 d。

本文在前期預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上制定3 個(gè)具有較好防腐效果的天然復(fù)合添加劑，分別是復(fù)合香辛料精油（Compound spice，CS）、發(fā)酵牛骨調(diào)味基料（Fermented beef flavoring，F(xiàn)BF）、復(fù)合天然防腐劑（Compound natural preservative，CNP）。本試驗(yàn)將其應(yīng)用于鹵牛肉加工中，測(cè)定其感官品質(zhì)，貯藏過(guò)程中的理化指標(biāo)、微生物多樣性和風(fēng)味變化，研究這3 種天然復(fù)合添加劑對(duì)鹵牛肉品質(zhì)及貨架期的影響，為實(shí)際生產(chǎn)提供試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

牛肋腹部肉（脂肪含量<10%）、牛肋排（脂肪含量20%），天津天穆牛羊肉批發(fā)部；食鹽、白糖、花椒、白酒等，天津王頂?shù)躺藤Q(mào)城世紀(jì)華聯(lián)超市；葡萄糖、復(fù)合磷酸鹽、抗壞血酸鈉，鄭州凱之裕食品添加劑有限公司；復(fù)合香辛料精油，天津市春合科技開(kāi)發(fā)有限公司；殼聚糖、桂皮，江蘇味太美食品有限公司；茶多酚，鄭州裕和食品添加劑有限公司；溶菌酶，河南嘉致化工產(chǎn)品有限公司；蜂膠，中龍蜂產(chǎn)品加工廠；乳酸鏈球菌素（Nisin），恒康食品添加劑有限公司。

三氯甲烷、三氯乙酸、2-硫代巴比妥酸、丁基羥基茴香醚、乙二胺四乙酸、氯化鉀，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；營(yíng)養(yǎng)瓊脂，青島高科技工業(yè)園海博生物科技有限公司；配制試劑所用的水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

CM-5 色差儀，日本Konica Minolta 公司；STARTER3100 pH 計(jì)，美國(guó)Ohaus 公司；T6 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；BVBJ-30F 真空攪拌機(jī)，嘉興艾博實(shí)業(yè)有限公司；GCMS-QP2010Plus 氣相色譜-質(zhì)普聯(lián)用儀，日本島津公司；65 μm PDMS/DVB 萃取頭，美國(guó)Supelco 公司；美國(guó)Hamilton 微量進(jìn)樣針10 mL，天津市琛航科技儀器有限公司；HeraclesII 超快速氣相電子鼻，法國(guó)Alpha M.O.S 公司。

1.3 方法

1.3.1 天然復(fù)合添加劑的配制

1.3.1.1 CS 的制備 以肉質(zhì)量計(jì)，分別將花椒精油、八角精油、麻椒精油、丁香精油、迷迭香精油以441.0，337.0，17.0，14.0，137.0 μL/kg 進(jìn)行復(fù)配。

1.3.1.2 FBF 的制備 參考樊曉盼等[17]的方法，將按牛肋排∶蒸餾水=1∶4（質(zhì)量比）置于高壓滅菌鍋，在0.1 MPa，121 ℃條件下高壓浸提4 h；將浸提液冷卻后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.06%的風(fēng)味蛋白酶和0.03%的復(fù)合蛋白酶，置于搖床內(nèi)，在50 ℃，130 r/min 條件下酶解4.5 h，結(jié)束后沸水浴滅酶20 min；將商業(yè)復(fù)合菌VHI-41 在含1.5%葡萄糖的牛奶中活化2 h，接種于酶解液中，接種量為2×107CFU/g，在30 ℃，130 r/min 的搖床中發(fā)酵12 h，結(jié)束后水浴滅菌20 min，冷卻；在發(fā)酵液中分別添加1.2%木糖、1.2%葡萄糖、0.9%半胱氨酸、0.45%甘氨酸、0.45%丙氨酸、1.8% VB1，于110 ℃下美拉德反應(yīng)60 min，冷卻后于4 ℃靜置12 h；過(guò)濾后即得到FBF，置于4 ℃冷藏備用。

1.3.1.3 CNP 的制備 以水質(zhì)量計(jì)，將殼聚糖、蜂膠、乳酸鏈球菌素、溶菌酶、茶多酚分別以0.5%，0.1%，0.075%，0.075%，0.5%的比例配置成天然復(fù)合防腐液，備用。

1.3.2 鹵牛肉的制作

1.3.2.1 原料肉的切分 將牛肋腹部肉切分成70 g 左右的小斜方塊。

1.3.2.2 真空滾揉 按肉質(zhì)量的20%配好腌制液（腌制液的配方見(jiàn)表1），將牛肉塊和腌制液倒入真空滾揉機(jī)中，轉(zhuǎn)速為5～6 r/min，正轉(zhuǎn)10 min，反轉(zhuǎn)10 min，中間停5 min，總時(shí)間為50 min。

表1 腌制液配方（以100 kg 牛肉計(jì)）Table 1 Formula of pickling solution（Based on 100 kg beef）

以添加20%腌制液進(jìn)行真空滾揉加工的鹵牛肉為對(duì)照組（Control check，CK），試驗(yàn)組包括3組：1）復(fù)合香辛料精油（Compound spice，CS）組：20%腌制液，再添加946 μL/kg（以肉質(zhì)量計(jì)）的CS；2）發(fā)酵牛骨調(diào)味基料（Fermented beef flavoring，F(xiàn)BF）組：20%腌制液，再添加2% FBF；3）復(fù)合天然防腐劑（Compound natural preservative，CNP）組：20%腌制液，再添加50 mL/kg（以肉質(zhì)量計(jì)）的CNP。

1.3.2.3 腌制 牛肉塊從真空滾揉機(jī)中取出后放入不銹鋼容器中，其上覆保鮮膜以防止肉表面氧化，放入0～4 ℃冷庫(kù)中靜腌12 h。

1.3.2.4 煮制 在煮鍋中加入與牛肉等質(zhì)量的水，放入香辛料包（香辛料配方見(jiàn)表2），待沸騰后放入腌制好的牛肉塊，大火煮制30 min，撇去浮沫，改為小火燜制1 h，出鍋前加入味精和曲酒。

表2 煮制香辛料配方（以100 kg 牛肉計(jì)）Table 2 Formula of cooking spices（based on 100 kg beef）

1.3.2.5 包裝 待牛肉出鍋冷卻后，采用高溫蒸煮袋進(jìn)行真空包裝，每袋100 g，封裝完成后檢查真空狀態(tài)和封口密封的完整性。

1.3.2.6 低溫殺菌 將真空包裝后的產(chǎn)品放入煮鍋中進(jìn)行沸水殺菌30 min，隨即撈出用流動(dòng)水迅速冷卻，在常溫（20～25 ℃）條件中貯存48 h 后再進(jìn)行第2 次相同的殺菌處理方式。

1.3.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 將上述處理的4 組產(chǎn)品放置于10 ℃的環(huán)境下貯藏，在貯藏的0，14，30，60，90，120，150 d 測(cè)定其感官評(píng)分、pH 值、TBARS 值、亞硝酸鹽殘留量、紅度值，并在貯藏的第90 天利用16S rDNA 高通量測(cè)序進(jìn)行微生物多樣性分析，采用電子鼻、GC-MS 對(duì)4 組鹵牛肉的風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定。

1.3.4 感官評(píng)定 根據(jù)GB/T 23586-2009 《醬鹵肉制品》對(duì)醬鹵肉制品感官要求，鹵牛肉的外觀形態(tài)、色澤、滋氣味、質(zhì)地進(jìn)行評(píng)分（評(píng)分表見(jiàn)表3），對(duì)不同編碼的樣品感官打分，每項(xiàng)指標(biāo)9 分，結(jié)果取平均值。

表3 鹵牛肉感官評(píng)分表Table 3 Sensory evaluation table of braised beef

1.3.5 指標(biāo)測(cè)定

1.3.5.1 pH 值 按照GB 5009.237-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品 pH 值的測(cè)定》 中肉及肉制品pH 值測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.5.2 紅度值 將攪碎的碎肉樣平鋪在石英皿中，保證底部被鋪滿，沒(méi)有縫隙，采用色差儀進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定前用白板矯正。

1.3.5.3 硫代巴比妥酸值（Thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）參照GB 5009.181-2016 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中丙二醛的測(cè)定》執(zhí)行。

1.3.5.4 菌落總數(shù) 按GB 4789.2-2016 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.5.5 微生物多樣性分析 將樣品送至北京奧維森基因科技有限公司，采用擴(kuò)增子測(cè)序方法分析樣品16S rDNA 的V3-V4 區(qū)段、細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)等，擴(kuò)增區(qū)段引物序列為：ACTCCTACGGGAGGCAGCAG，GTGGACTACHVGGGTWTCTAAT。

1.3.5.6 HeraclesII 超快速電子鼻分析 稱取3 g攪碎的樣品于頂空進(jìn)樣瓶中，放置于50 ℃恒溫水浴鍋中煮制24 min，用進(jìn)樣針吸取5 mL 氣體，注射到電子鼻儀器中，分析參數(shù)為：進(jìn)樣口溫度200℃；進(jìn)樣持續(xù)時(shí)間40 s；捕集集阱初始溫度40 ℃；捕集阱分流速度10 mL/min；捕集阱最終溫度200℃；柱溫的初始溫度50 ℃；柱溫的程序升溫方式0.5 ℃/min-100 ℃，1 ℃/min-200 ℃；采集時(shí)間140 s；FID 檢測(cè)器溫度260 ℃。

1.3.5.7 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)（GC-MS）檢測(cè) 稱取2 g 絞碎的鹵牛肉樣品于20 mL 的頂空瓶中，加入5 mL 的飽和氯化鈉溶液，將老化的萃取頭插入樣品瓶，注意不要接觸到樣品，恒溫60 ℃吸附45 min后拔出，萃取頭在GC 進(jìn)樣口（240 ℃）下解吸附4 min。

GC 條件如下：DB-WAX 毛細(xì)管色譜柱（30 m×250 μm × 0.25 μm）；載氣（He）流速：1 mL/min，不分流進(jìn)樣；起始溫度45 ℃，2 min，后以6 ℃/min速率升到230 ℃，保持5 min；運(yùn)行時(shí)間：38 min。

MS 條件如下：離子源溫度230 ℃，界面溫度250 ℃，MS 四極桿溫度150 ℃，溶劑延遲3 min，質(zhì)量掃描范圍m/z 30～500。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)中每個(gè)處理包含3 個(gè)平行試樣，結(jié)果取平均值。試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，采用SPSS 21.0 軟件的ANOVA 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，差異顯著性用鄧肯多重比較進(jìn)行試驗(yàn)判定；采用Origin 9.0 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 天然復(fù)合添加劑對(duì)鹵牛肉感官品質(zhì)貯藏過(guò)程中的影響

天然復(fù)合添加劑對(duì)鹵牛肉感官品質(zhì)貯藏過(guò)程中的影響見(jiàn)圖1 所示。由圖1 可以看出添加不同天然復(fù)合添加劑的鹵牛肉的外觀形態(tài)、色澤、滋氣味、質(zhì)地隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，其中，外觀形態(tài)各試驗(yàn)組之間沒(méi)有顯著性差異，而CNP 組的色澤顯著低于其它組（P<0.05），這是因?yàn)镃NP 組中含有蜂膠提取物，蜂膠為棕褐色或深褐色，會(huì)影響鹵牛肉的色澤，使得牛肉色澤發(fā)黃、發(fā)暗。CS 組的滋氣味評(píng)分最高且顯著高于CK 組（P<0.05），這是因?yàn)橄阈亮暇秃刑卣餍缘膿]發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)[18]，能夠遮蓋原料肉的膻味，并且賦予肉制品誘人的獨(dú)特香味。在質(zhì)地方面，貯藏各試驗(yàn)組差異不明顯，CS 組在各項(xiàng)指標(biāo)中都表現(xiàn)出優(yōu)越性。

圖1 天然復(fù)合添加劑對(duì)鹵牛肉貯藏過(guò)程中感官品質(zhì)的影響Fig.1 Effects of natural compound additives on sensory quality of stewed beef during storage

2.2 天然復(fù)合添加劑的使用對(duì)鹵牛肉貯藏過(guò)程中理化性質(zhì)的影響

天然復(fù)合添加劑對(duì)鹵牛肉貯藏過(guò)程中理化性質(zhì)變化的影響見(jiàn)表4 所示，由表4 可知，所有組別的pH 值在貯藏過(guò)程中整體呈下降趨勢(shì)，其中CK組在貯藏后期（60～150 d）顯著下降（P<0.05），這是因?yàn)檎婵瞻b條件下，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，乳酸菌繁殖產(chǎn)酸積累造成的。CNP 組的pH 值在貯藏過(guò)程中（0～120 d）一直顯著低于其它試驗(yàn)組（P<0.05），是因?yàn)樘砑拥腃NP 中茶多酚含有羧酸類(lèi)物質(zhì)導(dǎo)致CNP 組產(chǎn)品的pH 始終低于其它組（P<0.05）[19]，CS 組與FBF 組pH 值下降較為緩慢，說(shuō)明其添加的CS 和FBF 均能較好的抑制微生物的生長(zhǎng)繁殖。

表4 天然復(fù)合添加劑對(duì)鹵牛肉貯藏過(guò)程中理化性質(zhì)變化的影響Table 4 Effects of natural additives on physical and chemical properties of braised beef during storage

TBARS 值整體均呈上升趨勢(shì)，并且在貯藏過(guò)程中，CS 組的TBARS 值一直顯著低于CK 組（P<0.05），F(xiàn)BF 組的TBARS 值在貯藏前期（0～60 d）顯著低于CK 組（P<0.05），而貯藏后期（90～150 d）與CK 組差異不顯著（P>0.05），說(shuō)明隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，F(xiàn)BF 的抗氧化效果減弱，吳晨燕等[20]在紅腸中證明了FBF 雖有一定的抗氧化性，但抗氧化效果不是很理想，可能是因?yàn)镕BF 中含有的脂肪也會(huì)自身氧化。CNP 組在貯藏前期（14～90 d）TBARS值與CK 組差異不顯著（P>0.05），而隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，CNP 組的抗氧化優(yōu)勢(shì)逐漸顯示出來(lái)，在貯藏終點(diǎn)，TBARS 值最低。

紅度值在整個(gè)貯藏過(guò)程中均呈下降趨勢(shì)，其中CS 組的a*值下降速率在所有組別中是最緩慢的，說(shuō)明其能很好的保持產(chǎn)品的紅度值，提升產(chǎn)品品質(zhì)。

2.3 天然復(fù)合添加劑的鹵牛肉貯藏過(guò)程中菌落總數(shù)變化的影響

由表5 可知，CK 組從第90 天開(kāi)始有微生物的生長(zhǎng)，并且隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，菌落總數(shù)顯著增加（P<0.05），到貯藏的第150 天時(shí)，菌落總數(shù)增長(zhǎng)到145 CFU/g，其它試驗(yàn)組在貯藏150 d 才有少量的菌落總數(shù)檢出，且均顯著低于CK 組（P<0.05），尤其CS 組的菌落總數(shù)在貯藏期間最低。整個(gè)貯藏期間所有組別的微生物指標(biāo)均未超標(biāo)。

表5 天然復(fù)合添加劑對(duì)鹵牛肉貯藏過(guò)程中菌落總數(shù)變化的影響（CFU/g）Table 5 Effects of natural additives on the total number of colonies of braised beef during storage（CFU/g）

2.4 天然復(fù)合添加劑對(duì)鹵牛肉貯藏中期（90 d）微生物多樣性的影響

2.4.1 高通量測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與質(zhì)量分析 稀釋曲線反應(yīng)了物種豐度隨著測(cè)序深度的變化趨勢(shì)以及新物種出現(xiàn)的速率，曲線上某一點(diǎn)斜率的斜率與物種出現(xiàn)的速率呈正相關(guān)關(guān)系[21]，由圖2 稀釋曲線圖可知，所有組別在測(cè)序前期OUT 數(shù)增長(zhǎng)較快，當(dāng)測(cè)序序列數(shù)大于20 000 時(shí)，曲線趨于平坦，說(shuō)明更多的數(shù)據(jù)只產(chǎn)生少量的OUT，表明測(cè)序數(shù)據(jù)足夠可以反應(yīng)整個(gè)樣本物種種群，測(cè)序數(shù)據(jù)合理。

2.4.2 Alpha 多樣性分析 通過(guò)樣品的多樣性分析（Alpha 分析）可以反映其微生物種群的豐度和多樣性[22]，4 組鹵牛肉樣品的Alpha 多樣性分析見(jiàn)表6 所示。其中觀測(cè)深度指數(shù)反映了物種被測(cè)出的概率，可以看出4 組產(chǎn)品的觀測(cè)深度指數(shù)均在100%，說(shuō)明所有的微生物種均被檢測(cè)到；Chao 1指數(shù)用于估計(jì)群落中的OUT 數(shù)目，即種群豐度，PD_whole_tree 指數(shù)與Shannon 指數(shù)均反映物種多樣性，前者是考慮了物種進(jìn)化距離的多樣性指數(shù)，兩者指數(shù)數(shù)值越大，表明微生物多樣性越高。由表6 可見(jiàn)，CS 組與FBF 組的Chao 1 指數(shù)要顯著低于CK 組（P<0.05），說(shuō)明CS 與FBF 組有一定的抑菌效果。CS 的Shannon 指數(shù)顯著低于CK 組（P<0.05），說(shuō)明CS 組的微生物種類(lèi)較少，菌相結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單。

表6 4 組鹵牛肉樣品的Alpha 多樣性分析Table 6 Alpha diversity analysis of 4 groups of stewed beef samples

韋恩圖顯示了不同組別微生物群落的相似性與差異性，4 組鹵牛肉樣品群落OUT 韋恩圖見(jiàn)圖3，重疊部分為樣品間共有的OUT 數(shù)，沒(méi)有重疊部分為樣品特有的OUT 數(shù)。由圖3 可知，4 組樣品的OUT 總數(shù)從小到大排序?yàn)椋篊S（75）

圖3 4 組鹵牛肉樣品菌群落OUT 韋恩圖Fig.3 OUT Venn diagram of bacterial community of 4 groups of stewed beef samples

2.4.3 基于門(mén)水平微生物種群多樣性分析 由圖4 可知，4 組鹵牛肉檢測(cè)出的微生物主要是變形菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、藍(lán)藻門(mén)、擬桿菌門(mén)、放線菌門(mén)、芽單胞菌門(mén)，這與張志剛等[23]檢測(cè)到的低溫冷藏獅子頭的菌相結(jié)構(gòu)基本一致，這6 種菌門(mén)相對(duì)豐度在所檢樣品中達(dá)到了97%以上，說(shuō)明鹵牛肉在門(mén)水平的上的均相結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定。其中，變形菌門(mén)在4組鹵牛肉中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌種，相對(duì)豐度分別達(dá)到了CK（47.01%）、CS（62.85%）、FBF（58.77%）、CNP（60.18%），這是因?yàn)樽冃尉T(mén)細(xì)菌大多數(shù)具有兼性或?qū)Ｐ詤捬跆匦訹24]，真空包裝的環(huán)境為變形菌門(mén)的細(xì)菌繁殖創(chuàng)造了條件；而厚壁菌門(mén)是耐熱性較強(qiáng)的微生物，且抗逆性較強(qiáng)[25]，較低的殺菌溫度并不能將其徹底殺滅，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)能夠成為肉制品的腐敗優(yōu)勢(shì)菌屬，而4 組鹵牛肉厚壁菌門(mén)的相對(duì)豐度由高到低為：CK（18.62%）>FBF（13.64%）>CNP（13.02%）>CS（4.33%），說(shuō)明CS 能對(duì)厚壁菌門(mén)起到很好的抑制作用，增強(qiáng)產(chǎn)品安全性。

圖4 4 組產(chǎn)品在門(mén)水平的微生物群落結(jié)構(gòu)Fig.4 Microbial community structure of 4 groups of products at the phylum level

2.4.4 基于屬水平微生物種群多樣性分析 由圖5 可知，4 組鹵牛肉共檢測(cè)出44 個(gè)相對(duì)豐度大于1%的屬，細(xì)菌菌落在屬水平上存在較大差異，CK組特有的優(yōu)勢(shì)菌屬為薄層菌屬（13.49%）；CS 組為蔓花生菌屬（20.64%）、馬賽菌屬（17.39%）；FBF 組慢生根瘤菌屬（5.49%）；CNP 組為甲基桿菌屬（9.75%）、鞘脂單胞菌屬（6.34%）。其中，共有的優(yōu)勢(shì)菌屬為不動(dòng)桿菌屬（CK：11.78%、CS：9.83%、FBF：17.87%、CNP：22.51%）與未確定的變形菌門(mén)（CK：6.06%、CS：22.56%、FBF：11.24%、CNP：8.68%）。不動(dòng)桿菌屬易在潮濕的環(huán)境中生存，鹵牛肉較高的水分含量是導(dǎo)致不動(dòng)桿菌屬生長(zhǎng)的主要原因。CK 組與FBF 組共有的優(yōu)勢(shì)菌屬芽孢桿菌屬（CK：16.19%、FBF：10.31%、CNP：5.04%）的菌株具有氨基酸脫羧酶的活性，可能產(chǎn)生生物胺[26]，導(dǎo)致產(chǎn)品安全性降低，CS 組中未檢測(cè)到芽孢桿菌屬?？梢?jiàn)，經(jīng)過(guò)屬水平的微生物組成分析，CS 組的產(chǎn)品安全性更高。

圖5 4 組產(chǎn)品在屬水平的微生物群落結(jié)構(gòu)Fig.5 Microbial community structure of 4 groups of products at genus level

2.4.5 組鹵牛肉貯藏中期（90 d）揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的PCA 主成分分析 4 組鹵牛肉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)PCA 分析結(jié)果如圖6 所示，由圖6 可以看出，第1主成分的方差貢獻(xiàn)率為87.36%，第2 主成分的方差貢獻(xiàn)率為10.62%，兩者積累的總貢獻(xiàn)率為97.98%。識(shí)別指數(shù)（Discrimination index，DI）用來(lái)表征樣品之間區(qū)分度的大小，在80～100 范圍內(nèi)數(shù)據(jù)越高，效果越好，小于80 說(shuō)明數(shù)據(jù)無(wú)效[27]，本試驗(yàn)樣品識(shí)別指數(shù)為94，且樣品之間沒(méi)有存在交叉重疊區(qū)域，說(shuō)明電子鼻能夠?qū)? 組鹵牛肉很好的區(qū)分開(kāi)來(lái)。圖中每?jī)山M樣品之間的相對(duì)距離較遠(yuǎn)，說(shuō)明4 組樣品間氣味物質(zhì)相差較大[28]。因此，天然復(fù)合添加劑鹵牛肉的氣味差異影響較大。

圖6 4 組產(chǎn)品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)PCA 圖Fig.6 PCA diagram of volatile flavor substances of 4 groups of products

2.4.6 組鹵牛肉各類(lèi)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)（GC-MS）分析 香氣成分見(jiàn)表7 所示，4 組產(chǎn)品GC-MS 分析共檢測(cè)到97 種（CS：41>CK：39>CNP：28>FBF：25）揮發(fā)性香氣成分，包括烴類(lèi)、醚類(lèi)、醇類(lèi)、醛類(lèi)、含氮含硫化合物、酚類(lèi)、酸類(lèi)、酯類(lèi)以及酮類(lèi)。

表7 4 組產(chǎn)品的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)Table 7 Volatile flavor substances of 4 groups of products

烴類(lèi)（除萜烯類(lèi)化合物）主要是由于脂肪酸烷氧自由基的均裂產(chǎn)生的，其中CK、FBF、CNP 主要以飽和烴為主，飽和烴類(lèi)的閾值較高，對(duì)鹵牛肉的風(fēng)味貢獻(xiàn)較小，而CS 組檢測(cè)出10 種萜烯類(lèi)化合物，這與CS 組中添加的香辛料精油有關(guān)，萜烯類(lèi)化合物有特殊的氣味，呈味閾值較低[29]，對(duì)鹵牛肉的風(fēng)味有重要貢獻(xiàn)。

醚類(lèi)大多數(shù)具有愉快的氣味，能賦予鹵牛肉醇厚感[30]，在風(fēng)味物質(zhì)中也非常重要。其中，CS 組、FBF 組與CNP 組檢測(cè)到的醚類(lèi)物質(zhì)均多于CK組，特別茴香腦是產(chǎn)生醬香的主要物質(zhì)[31]。

醇類(lèi)化合物主要產(chǎn)生于脂肪的氧化降解以及Strecker 反應(yīng)，且飽和醇閾值較高，對(duì)鹵牛肉風(fēng)味的貢獻(xiàn)較小，不飽和醇閾值低，對(duì)風(fēng)味貢獻(xiàn)較大[32]，4 組產(chǎn)品共檢測(cè)出7 種醇類(lèi)物質(zhì)，包括6 種不飽和醇和1 種飽和醇，且不飽和醇的種類(lèi)CK=CS>FBF=CNP 組。

醛類(lèi)物質(zhì)的閾值較低，一般認(rèn)為是肉制品風(fēng)味物質(zhì)的主要成分之一，對(duì)鹵牛肉的風(fēng)味貢獻(xiàn)較大，醛類(lèi)物質(zhì)主要來(lái)源于脂肪氧化降解[33]。研究發(fā)現(xiàn)，壬醛由油酸氧化產(chǎn)生，有明顯的果香與脂肪香氣[34]；己醛是亞油酸的主要氧化產(chǎn)物，有青草的香氣[35]；苯甲醛是苯丙氨酸降解的產(chǎn)物，有令人愉快的堅(jiān)果、水果味[36]，CS 組檢測(cè)的己醛和苯甲醛兩種醛類(lèi)物質(zhì)，多于其它試驗(yàn)組，能賦予鹵牛肉特有的香氣風(fēng)味。

含氮、含硫化合物主要來(lái)源于氨基酸和還原糖之間的美拉德反應(yīng)以及硫胺素的熱降解，其香氣閾值較低，是肉制品中重要的呈味物質(zhì)[37]，其中含硫化合物是產(chǎn)生肉香的關(guān)鍵化合物，而含氮化合物具有烘烤香氣[38]。各試驗(yàn)組檢測(cè)出的含氮、硫化合物的種類(lèi)個(gè)數(shù)為：CNP（16）>FBF（14）>CS（12）>CK（11）。

酚類(lèi)物質(zhì)在熟牛肉中鮮有報(bào)道被檢測(cè)出來(lái)，其中丁香酚在所有試驗(yàn)組中都被檢測(cè)到，具有丁香花味，可以賦予鹵牛肉醇厚感[39]。

酸類(lèi)物質(zhì)可能是由于甘油三脂和磷脂水解產(chǎn)生的[40]，只有CK 組檢測(cè)出了酸類(lèi)物質(zhì)。酮類(lèi)物質(zhì)具有奶香和清香等令人愉快的氣味，是脂質(zhì)氧化和美拉德反應(yīng)的產(chǎn)物[41]，酸類(lèi)、酯類(lèi)、酮類(lèi)其閾值較高，對(duì)風(fēng)味特征貢獻(xiàn)較小，4 組產(chǎn)品共檢測(cè)出3種酸類(lèi)物質(zhì)、6 種酯類(lèi)物質(zhì)、9 種酮類(lèi)物質(zhì)。

3 結(jié)論

隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，4 組鹵牛肉整體上感官評(píng)分、pH 值和紅度值呈下降趨勢(shì)，TBARS 值呈顯著升高趨勢(shì)，其中CS 組的感官評(píng)分、TBARS 值和菌落總數(shù)均顯著優(yōu)于CK 組和其它2 個(gè)試驗(yàn)組（P<0.05）；4 組鹵牛肉的16S rDNA 測(cè)序結(jié)果共檢測(cè)到相對(duì)豐度大于1%有5 個(gè)門(mén)，44 個(gè)屬的微生物信息，優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為變形菌門(mén)和厚壁菌門(mén)，CS 對(duì)厚壁菌門(mén)類(lèi)的微生物有抑制作用，屬水平上共有的優(yōu)勢(shì)菌為不動(dòng)桿菌屬與未確定的變性菌門(mén)，其中CS 組未檢測(cè)到會(huì)產(chǎn)生生物胺的芽孢桿菌屬，提高了產(chǎn)品的安全性；4 組產(chǎn)品GC-MS 分析共檢測(cè)到97 種（CS：41>CK：39>CNP：28>FBF：25）揮發(fā)性香氣成分，包括烴類(lèi)、酸類(lèi)、醚類(lèi)、醇類(lèi)、醛類(lèi)、酚類(lèi)、酯類(lèi)、酮類(lèi)以及其它含氮含硫化合物，其中CS組含有較多對(duì)風(fēng)味貢獻(xiàn)較多的萜烯類(lèi)、醚類(lèi)、不飽和醇類(lèi)、醛類(lèi)、以及含氮含硫化合物。因此，CS 為較好的天然添加劑，既能夠延長(zhǎng)產(chǎn)品貨架期，提升產(chǎn)品安全性，同時(shí)，也能改善風(fēng)味，提升產(chǎn)品感官品質(zhì)。