喬丹丹，李斯琦，格日勒?qǐng)D，滿都呼，吳金迪，莎日娜*

（1 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 呼和浩特010018 2 呼和浩特市綠碧電子科技有限公司 呼和浩特 010010）

水溶液的結(jié)晶由兩個(gè)變化過程組成：首先是晶核的形成過程，其次是晶體的生長過程。冰晶的成核過程主要是由熱力學(xué)條件決定，而冰晶的生長過程主要由動(dòng)力學(xué)條件決定。肉中溶液的冷凍并不是瞬時(shí)完成的，溶液熱量的轉(zhuǎn)移與形態(tài)改變需要有過程，主要分為3 個(gè)階段：液態(tài)降溫階段、相變階段和固態(tài)降溫階段。其中，每個(gè)階段都伴隨著熱量的傳遞與溫度的改變，并引起冷凍介質(zhì)相的轉(zhuǎn)變[1-4]。常規(guī)冷凍對(duì)于食品的影響主要在于食品冷凍時(shí)冰晶的形成過程，然而，結(jié)晶的過程是隨機(jī)的，細(xì)胞內(nèi)、外溶液濃度不同，結(jié)晶所需的過冷度不同，使胞內(nèi)結(jié)晶難以生成，胞外結(jié)晶大量生長，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)[5-6]。冰晶的形成對(duì)冷凍肉類的質(zhì)量起著至關(guān)重要的作用，冰晶體積過大可能會(huì)對(duì)組織造成不可逆的損傷，導(dǎo)致解凍時(shí)汁液損失增加[7-10]。

等離子電場(chǎng)（靜電場(chǎng)）技術(shù)主要是通過設(shè)備營造低溫等離子體環(huán)境，當(dāng)設(shè)備通電時(shí)，等離子體體系中粒子之間發(fā)生非彈性碰撞，為化學(xué)反應(yīng)提供激發(fā)能量，產(chǎn)生高反應(yīng)性的活性粒子，主要包括活性氧（Reactive oxygen species，ROS）、活性氮（Reactive nitrogen species，RNS）、激發(fā)態(tài)粒子、OH 自由基等[11-13]。低溫等離子體被稱為氣、液、固三態(tài)之外的第4 態(tài)物質(zhì)，主要存在于自然界中，也可以通過人工方式獲得[14-15]。

等離子電場(chǎng)技術(shù)主要作用于過冷階段和初始凍結(jié)的發(fā)生，等離子電場(chǎng)的引入可以改變過冷階段的吉布斯自由能（△G0），從而影響冰核的形成[16]。在晶體形成過程中，生成的晶核越多，晶核與水分接觸的總面積越大，結(jié)晶的時(shí)間越短，生成晶體的體積越小[17]。當(dāng)引入電場(chǎng)時(shí)，結(jié)晶過程更加可控，水分子的極化和重新排列使冰晶的形成更加均勻和細(xì)小，同時(shí)與常規(guī)冷凍技術(shù)相比，電場(chǎng)輔助冷凍所需的能量更低[18-19]。

羊肉因具有肉質(zhì)細(xì)嫩、味美多汁、易消化吸收等特點(diǎn)，備受廣大消費(fèi)者的青睞。然而，由于我國地域廣大、幅員遼闊，因此受地理環(huán)境和經(jīng)濟(jì)條件的限制，常規(guī)冷凍貯藏（-18～-20 ℃）羊肉成為主要的貯藏和流通方式，在冷凍貯藏過程中如何更好地保障肉品質(zhì)是關(guān)鍵問題[20-21]。等離子電場(chǎng)技術(shù)作為一項(xiàng)節(jié)能型新技術(shù)，具有環(huán)保、無污染等特點(diǎn)[22-23]，滿足現(xiàn)代食品工業(yè)向綠色食品生產(chǎn)方式轉(zhuǎn)變的發(fā)展趨勢(shì)，更是目前食品生產(chǎn)中所提倡的。

本研究以羊背最長肌為試驗(yàn)材料，通過施加等離子電場(chǎng)輔助肉品冷凍貯藏，探究等離子電場(chǎng)在肉品保藏中的作用，為等離子電場(chǎng)技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)和試驗(yàn)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮羊背最長?。汉艉秃铺貣|瓦窯菜市場(chǎng)；O.C.T.冷凍切片包埋劑，美國SAKURA 公司；蘇木精伊紅染液，白鯊生物科技有限公司；中性樹膠，上海華靈康復(fù)器械廠。

1.2 儀器與設(shè)備

京制00000246 號(hào)電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；KT300 探針溫度計(jì)，北京利爾金?？萍加邢薰荆籇M4000B 顯微鏡，德國LEICA 公司；等離子電場(chǎng)設(shè)備，呼和浩特市綠碧電子科技有限公司；MEV 冷凍切片機(jī)，德國SLEE 公司；BC/BD-100HEGW 海爾電冰柜，青島海爾特種電冰柜有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 等離子電場(chǎng)輔助冷凍曲線的繪制 將新鮮的羊背最長肌切成50 g 的方形塊，選取12 塊肉樣隨機(jī)分為4 組，以自然冷凍（未施加電場(chǎng)）的肉樣為對(duì)照組，等離子電場(chǎng)（冰箱內(nèi)裝有等離子電場(chǎng)設(shè)備）環(huán)境下冷凍的肉樣為試驗(yàn)組。將試驗(yàn)組羊肉分別置于1，3 kV/m 和5 kV/m 的場(chǎng)強(qiáng)下，用聚乙烯自封袋包裝后分別置于-20 ℃和-35 ℃冰箱中冷凍。溫度測(cè)定均采用探針式溫度計(jì)，每隔10 min記錄1 次數(shù)據(jù)。

1.3.2 肌肉組織形態(tài)及冰晶觀察 參考劉曉蘭等[24]的方法，將肉樣切成約3 mm×3 mm×5 mm 的長方體肉柱，置自封袋內(nèi)，于-20 ℃和-35 ℃冰箱中冷凍，備用。冷凍48 h 后取出，迅速投入固定液中固定，然后切片、HE 常規(guī)染色、封片。切片觀察使用DM4000B 顯微鏡4 倍物鏡（帶有DFC450 攝像頭及圖像分析軟件LAS V4.4）并拍攝組織圖像。對(duì)肉樣形成的冰晶進(jìn)行計(jì)算和分析。

1.3.2.1 冷凍羊肉冰晶面積的測(cè)定 冰晶面積測(cè)定采用圖像分析軟件LAS V4.4 和Image J。

1.3.2.2 冷凍羊肉冰晶粒徑（相當(dāng)直徑）的計(jì)算粒徑定義為與研究對(duì)象具有相等面積的直徑（d），計(jì)算公式：

式中，A——冰晶面積（由圖像分析軟件進(jìn)行面積抓取），μm2。

1.3.2.3 冷凍羊肉冰晶圓度的計(jì)算 圓度（R）計(jì)算公式：

式中，p——周長（由圖像分析軟件進(jìn)行面積抓?。?，μm。R 值介于0 和1 之間，其值越大，對(duì)象越圓。

1.3.3 熱力學(xué)變化 將肉樣解凍后的汁液在415 nm 處測(cè)定吸光值。此處為氧合肌紅蛋白特征吸收峰，代表系統(tǒng)的分子微觀運(yùn)動(dòng)狀態(tài)數(shù)，計(jì)算體系的熵（S），公式：

式中，k——玻爾茲曼常數(shù)；Ω——系統(tǒng)分子的微觀狀態(tài)數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

以上試驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3 次重復(fù)試驗(yàn)的平均值，用Excel 2016 和SPSS 26.0 等統(tǒng)計(jì)軟件統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 等離子電場(chǎng)輔助對(duì)羊肉凍結(jié)和解凍速率的影響

肉樣凍結(jié)溫度分別為-20 ℃和-35 ℃。為研究等離子電場(chǎng)對(duì)羊肉凍結(jié)過程的影響，對(duì)不同電場(chǎng)強(qiáng)度處理肉樣的中心溫度變化進(jìn)行比較。

由圖1 可知，幾組羊肉樣品在-20 ℃的凍結(jié)冷凍曲線趨勢(shì)大體一致，溫度降低過程都經(jīng)過冷凍前期急劇、最大冰晶生成期平緩和冷凍后期快速3 個(gè)階段。其中，對(duì)照組總凍結(jié)時(shí)長為710 min，通過最大冰晶生成帶的時(shí)間為130 min；1 kV/m 等離子電場(chǎng)環(huán)境下冷凍的總凍結(jié)時(shí)長為580 min，通過最大冰晶生成帶的時(shí)間為120 min；3 kV/m 等離子電場(chǎng)環(huán)境下冷凍的總凍結(jié)時(shí)長為470 min，通過最大冰晶生成帶的時(shí)間為80 min；而5 kV/m 等離子電場(chǎng)環(huán)境下冷凍肉樣僅用時(shí)340 min 達(dá)到凍結(jié)溫度，通過最大冰晶生成帶的時(shí)間為70 min，與對(duì)照組相比差異顯著（P<0.05）。試驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)輔助不同等離子場(chǎng)強(qiáng)處理的肉樣在冷凍過程中都不同程度地縮短了通過最大冰晶生成帶所需時(shí)間，說明輔助等離子電場(chǎng)影響肉樣凍結(jié)過程中水的相變過程，且輔助電場(chǎng)強(qiáng)度越大，凍結(jié)速率越快，凍結(jié)時(shí)間越短。

圖1 羊肉樣品-20 ℃凍結(jié)過程中心溫度變化曲線圖Fig.1 The curve of the change of central temperature of mutton samples during freezing at -20 ℃

由圖2 可知，-35 ℃環(huán)境下肉樣凍結(jié)速率更快，相比于-20 ℃凍結(jié)時(shí)下降趨勢(shì)也更為陡峭。其中，對(duì)照組總凍結(jié)時(shí)長為350 min，通過最大冰晶生成帶的時(shí)間為110 min；1 kV/m 等離子電場(chǎng)環(huán)境下冷凍的總凍結(jié)時(shí)長為250 min，通過最大冰晶生成帶的時(shí)間為100 min；3 kV/m 等離子電場(chǎng)環(huán)境下冷凍的總凍結(jié)時(shí)長為210 min，通過最大冰晶生成帶的時(shí)間為80 min；而5 kV/m 等離子電場(chǎng)環(huán)境下冷凍的肉樣僅用時(shí)160 min 達(dá)到凍結(jié)溫度，通過最大冰晶生成帶的時(shí)間為40 min，與對(duì)照組相比差異顯著（P<0.05），說明等離子電場(chǎng)環(huán)境下-35℃冷凍可以有效加快肉品的凍結(jié)速率和通過最大冰晶生成帶的時(shí)間，且對(duì)冰晶的生成也有較好的影響。

圖2 羊肉樣品-35 ℃凍結(jié)過程中心溫度變化曲線Fig.2 The curve of the change of central temperature of mutton samples during freezing at -35 ℃

肉類冷凍過程關(guān)鍵是通過最大冰晶生成帶所需時(shí)間越短冷凍效果越好。綜合以上不同條件冷凍試驗(yàn)結(jié)果可知，深冷凍即-35 ℃條件下肉中水分通過最大冰晶區(qū)所需時(shí)間為110 min；而輔助3 kV/m 和5 kV/m 等離子電場(chǎng)后常規(guī)冷凍即-20 ℃條件下冷凍肉中水分通過最大冰晶生成帶所需時(shí)間分別為80 min 和70 min，少于無輔助電場(chǎng)深冷凍（-35 ℃）時(shí)間，說明輔助適當(dāng)?shù)牡入x子電場(chǎng)后常規(guī)冷凍溫度即可達(dá)到深冷凍效果且縮短冷凍時(shí)間，從而節(jié)約能源。

2.2 等離子電場(chǎng)輔助對(duì)羊肉冷凍后微觀結(jié)構(gòu)的影響

羊肉在不同條件下（無電場(chǎng)及1，3 kV/m 和5 kV/m 等離子電場(chǎng)）冷凍（-20 ℃和-35 ℃）后的冰晶形態(tài)如圖3 和圖4 所示：新鮮羊肉的肌纖維組織分布均勻且密集，肌纖維之間空隙很小。肌肉在凍結(jié)過程中組織內(nèi)水分結(jié)晶，體積膨脹，冰晶的生長過程導(dǎo)致肌肉組織受到破壞。

圖3 -20 ℃冷凍羊肉肌肉纖維和冰晶顯微圖Fig.3 Micrograph of muscle fiber and ice crystal of -20 ℃frozen mutton

圖4 -35 ℃冷凍羊肉肌肉纖維和冰晶顯微圖Fig.4 Micrograph of muscle fiber and ice crystal of -35 ℃frozen mutton

由圖3 可見，-20 ℃無電場(chǎng)條件下冷凍羊肉形成的冰晶粒徑大，在組織內(nèi)分布混亂，肌纖維被冰晶擠壓出現(xiàn)明顯斷裂，機(jī)械損傷嚴(yán)重，視野可見冰晶面積大。經(jīng)輔助等離子電場(chǎng)處理后，1 kV/m 等離子電場(chǎng)與對(duì)照組區(qū)別較?。? kV/m 等離子電場(chǎng)環(huán)境下凍結(jié)的肉樣肌纖維排列開始變得有序，受冰晶擠壓變形現(xiàn)象得到改善，冰晶粒徑明顯變小，視野可見冰晶面積明顯縮小；5 kV/m 等離子電場(chǎng)環(huán)境下凍結(jié)的效果更好，并達(dá)到傳統(tǒng)速凍條件下肉樣的凍結(jié)效果，甚至比傳統(tǒng)速凍效果更好。這是由于等離子電場(chǎng)輔助凍結(jié)可使肉樣凍結(jié)速率加快，形成的冰晶有序粒徑小、分布均勻，對(duì)肌纖維細(xì)胞造成的擠壓損傷輕微。

如圖4 所示，在-35 ℃凍結(jié)條件下，肉樣中的冰晶粒徑基本比較小，對(duì)細(xì)胞組織構(gòu)成壓迫損傷也小，肌細(xì)胞相對(duì)完整，總體優(yōu)于-20 ℃冷凍，并且肉樣中冰晶的狀態(tài)隨電場(chǎng)強(qiáng)度的增加變得越來越好。

綜合分析圖3 與圖4 結(jié)果可知，-35 ℃（快速冷凍）與-20 ℃（常規(guī)冷凍）相比，肉樣凍結(jié)速率更快，形成的冰晶更小，從而使肌纖維受到的破壞更小。輔助等離子電場(chǎng)冷凍后，-20 ℃輔助5 kV/m 等離子電場(chǎng)冷凍其冰晶形成狀態(tài)及冷凍后肌肉細(xì)胞排列狀態(tài)完全可以達(dá)到快速冷凍效果（-35 ℃），說明輔助等離子電場(chǎng)后可以提高冷凍效率，在常規(guī)冷凍溫度下達(dá)到深冷凍效果。Jin 等[25]研究發(fā)現(xiàn)，施加靜電場(chǎng)凍結(jié)的生理鹽水凍結(jié)速率更快，形成的冰晶粒徑小且分布均勻。Xanthakis 等[26]研究發(fā)現(xiàn)12 kV 高壓靜電場(chǎng)下凍結(jié)的豬肉肌纖維微觀結(jié)構(gòu)更接近于新鮮肉樣，可以抑制豬肉凍結(jié)時(shí)冰晶的成長，與本研究結(jié)果類似。本研究僅用5 kV/m電壓，更加節(jié)能。

2.3 等離子電場(chǎng)輔助對(duì)羊肉冷凍后冰晶結(jié)構(gòu)的影響

采用LAS V4.4 和Image J 圖像分析軟件和相應(yīng)計(jì)算公式對(duì)冰晶粒徑（相當(dāng)直徑）、圓度、面積進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表1，表2 及圖5。

表1 -20 ℃冷凍方式處理肉樣的冰晶分析Table 1 Ice crystal analysis of meat samples treated by freezing at -20 ℃

表2 -35 ℃冷凍處理肉樣的冰晶分析Table 2 Ice crystal analysis of meat samples treated by freezing at -35 ℃

圖5 不同冷凍處理?xiàng)l件下冰晶面積占比Fig.5 Proportion of ice crystal area under different freezing treatment conditions

由表1 可得，在溫度-20 ℃下輔助不同等離子電場(chǎng)凍結(jié)后羊肉中冰晶面積、冰晶粒徑（相當(dāng)直徑）、冰晶圓度都有不同的變化。隨著輔助電場(chǎng)強(qiáng)度的增加，冰晶面積和冰晶粒徑明顯減少，其中輔助5 kV/m 電壓的冰晶面積、冰晶粒徑（相當(dāng)直徑）均為最小，與未輔助電場(chǎng)的對(duì)照組均有顯著差異（P<0.05）。冰晶圓度越接近1 形成的冰晶越圓，對(duì)周邊肌纖維細(xì)胞的擠壓破壞越小。本試驗(yàn)結(jié)果中冰晶圓度值在0.63～0.88 之間，其中輔助5 kV/m電壓的冰晶圓度值最大，與對(duì)照組相比有顯著差異（P<0.05）。試驗(yàn)結(jié)果表明，輔助等離子電場(chǎng)冷凍后形成的冰晶面積小，冰晶粒徑（相當(dāng)直徑）小，圓度值大，對(duì)周邊羊肉肌纖維細(xì)胞造成的機(jī)械損傷小，且輔助等離子電場(chǎng)場(chǎng)強(qiáng)越大效果越顯著。

由表2 可得，在-35 ℃輔助不同等離子電場(chǎng)凍結(jié)后羊肉中冰晶面積、冰晶粒徑、冰晶圓度的變化規(guī)律與趨勢(shì)與表1 中-20 ℃溫度下輔助不同等離子電場(chǎng)凍結(jié)結(jié)果基本相似，而不同的是-35 ℃各組的數(shù)據(jù)更優(yōu)。冰晶面積和冰晶粒徑小，冰晶圓度值均在0.80 以上，3 個(gè)輔助電場(chǎng)試驗(yàn)組間沒有顯著差異（P>0.05）。-20 ℃輔助5 kV/m 電壓組的冰晶面積、冰晶粒徑（相當(dāng)直徑）和冰晶圓度值均優(yōu)于-35 ℃對(duì)照組和-35 ℃輔助1 kV/m 電壓組，特別是-20 ℃輔助5 kV/m 電壓組冰晶圓度值是所有試驗(yàn)組中最大的。

圖5 所示，在相同的冷凍溫度下，隨著輔助等離子電場(chǎng)強(qiáng)度的增加，冰晶面積比例均有明顯下降趨勢(shì)。輔助5 kV/m 等離子電場(chǎng)-20 ℃凍結(jié)的冰晶面積比例僅為3.79%，顯著低于-20 ℃無電場(chǎng)冷凍的冰晶面積比例49.89%（P<0.05），并且低于-35℃速凍的冰晶面積比例5.97%。因此，輔助5 kV/m等離子電場(chǎng)-20 ℃冷凍羊肉的方式可以代替-35℃速凍方式。

綜合以上試驗(yàn)結(jié)果，輔助等離子電場(chǎng)冷凍可有效改善冷凍速率，冰晶形成狀態(tài)，冰晶粒徑（相當(dāng)直徑）、冰晶圓度，減少冷凍過程中肌纖維細(xì)胞損傷，保持肌纖維組織的完整性。結(jié)合本次試驗(yàn)與實(shí)際應(yīng)用，從節(jié)約能源等綜合考量，確認(rèn)20 ℃輔助5 kV/m 電壓冷凍羊肉條件是最理想的冷凍條件。

2.4 熱力學(xué)角度分析等離子電場(chǎng)輔助對(duì)羊肉冷凍效果的影響

肉是一種膠體體系，在冷凍過程中會(huì)發(fā)生部分玻璃化轉(zhuǎn)變，經(jīng)等離子電場(chǎng)處理，可以加速肉中冰晶凍結(jié)，以形成數(shù)量更少，體積更小的冰晶，減少對(duì)肉的傷害，增加肉的玻璃化程度。與此同時(shí)，體系的穩(wěn)定性增加[27]，熵隨之減少。S=klnΩ 是統(tǒng)計(jì)學(xué)中心概念，系統(tǒng)某一宏觀態(tài)對(duì)應(yīng)的微觀態(tài)數(shù)愈多，即它的混亂度愈大，則該狀態(tài)的熵也愈大[28]。肉樣的玻璃化程度會(huì)影響肌纖維的完整度，玻璃化程度越高，肌原纖維越完整，解凍后肉汁中肌紅蛋白含量越少，肌紅蛋白在紫外-可見區(qū)域具有特征吸收，在410 nm 波長附近的強(qiáng)吸收峰稱為Soret帶（B 帶），在空氣中轉(zhuǎn)化為氧合肌紅蛋白時(shí)Soret會(huì)發(fā)生藍(lán)移，在415 nm 左右[29-30]，因此，可使用樣品解凍后肉汁在415 nm 處的吸光值來表示系統(tǒng)的微觀狀態(tài)數(shù)Ω，并以此計(jì)算不同樣品的熵。

由表3 可知，在-20 ℃冷凍條件下，隨著電場(chǎng)強(qiáng)度的增大，所對(duì)應(yīng)的吸光值減小，且具有顯著性差異（P<0.05），表明在凍結(jié)過程中施加電場(chǎng)可顯著降低熵值。

表3 -20 ℃冷凍處理肉樣和鮮肉在415 nm 處的吸光值Table 3 Absorbance at 415 nm of meat sample frozen at -20 ℃

由表4 可知，在-35 ℃冷凍條件下，隨著電場(chǎng)強(qiáng)度的增大，所對(duì)應(yīng)的吸光值減小，且具有顯著性差異（P<0.05）。在5 kV/m 等離子電場(chǎng)下處理肉樣的吸光值與鮮肉最為接近。

表4 -35 ℃冷凍處理肉樣和鮮肉在415 nm 處的吸光值Table 4 Absorbance at 415 nm of meat sample frozen at -35 ℃

綜上所述，在-35 ℃輔助5 kV/m 電壓下冷凍效果最好，解凍后與鮮肉最為接近。-20 ℃輔助5 kV/m 電壓冷凍優(yōu)于-35 ℃無電場(chǎng)冷凍。考慮到實(shí)際生產(chǎn)中常規(guī)速凍即可達(dá)到日常使用要求，以及從節(jié)約能源的角度考量，選用-20 ℃下5 kV/m 凍結(jié)最為適合。

3 結(jié)論

1）輔助不同場(chǎng)強(qiáng)等離子電場(chǎng)時(shí)肉樣凍結(jié)速率均優(yōu)于對(duì)照組（無輔助電場(chǎng)），在-20 ℃和-35 ℃冷凍條件下，均是輔助5 kV/m 等離子電場(chǎng)組最大冰晶生期時(shí)間最短，與對(duì)照組（相同溫度無電場(chǎng)）相比均有差異顯著（P<0.05）。

2）組織切片顯示輔助不同場(chǎng)強(qiáng)（1，3，5 kV/m）等離子電場(chǎng)凍結(jié)肉樣冰晶的形態(tài)也優(yōu)于對(duì)照組。-35 ℃輔助5 kV/m 凍結(jié)冰晶面積和平均粒徑最小，肌纖維細(xì)胞斷裂破壞程度更??；-20 ℃輔助5 kV/m 凍結(jié)肉樣的冰晶圓度最大。上述兩個(gè)試驗(yàn)組和對(duì)照組（相同溫度無電場(chǎng)）相比均有顯著性差異（P<0.05）。

3）運(yùn)用玻爾茲曼公式間接分析肉樣的熵值，在-20 ℃和-35 ℃冷凍條件下，輔助5 kV/m 等離子電場(chǎng)凍結(jié)時(shí)的熵值最小，與對(duì)照組相比均具有顯著性差異（P<0.05）。

4）綜合試驗(yàn)結(jié)果和日常生產(chǎn)，以及從節(jié)約能源的考量，-20 ℃輔助5 kV/m 等離子電電場(chǎng)冷凍可作為一種新型冷凍方式應(yīng)用于生產(chǎn)。