楊文博，嚴漢池

（天津大學 生命科學學院，天津 300072）

水楊酸（Salicylic acid， SA）是一種β 羥基酚酸，廣泛存在于植物中。20 世紀90 年代，SA 作為主要植物激素進入人們的視野［1］。NPR 家族蛋白為SA受體，在細胞核內作為關鍵共轉錄因子參與SA介導的植物生理過程。植物NPR1基因首次由Dong等人發(fā)現并克隆獲得［2-3］。正常植物中的NPR1基因為組成型表達，在蛋白水平上受SA 調控［4］。NPR1 以寡聚體形式存在于細胞質中，當植物細胞內SA濃度水平上升，寡聚體NPR1 發(fā)生解聚并進入到細胞核中發(fā)揮生物學功能［2-3］。隨著植物NPR 研究的不斷深入，NPR 結構及生理功能已被揭示。本文就NPR 在植物SAR、形態(tài)發(fā)育、冷脅迫、晝夜節(jié)律中生物學功能發(fā)揮及NPR1、NPR1-TGA3、NPR4 空間結構的最新研究進展進行歸納總結，為闡明植物NPR 復雜分子作用機制奠定基礎，為解決植物育種及脅迫條件下培養(yǎng)問題提供新思路。

1 NPR生物信息學分析

植物NPR 蛋白包含3 個結構域，分別為BTB/POZ 結構域、ANK repeat 結構域和SBD［5-6］。擬南芥中共存在6 種NPR 蛋白，分別為AtNPR1（At為擬南芥）、AtNPR2、AtNPR3、AtNPR4、AtNPR5、AtNPR6［7］。NPR 同源序列比對結果顯示（見表1），AtNPR1、AtNPR2、AtNPR3 和AtNPR4 各結構域較為保守，AtNPR5和AtNPR6 的SBD 保守性較低。AtNPR5/AtNPR6-SBD 低保守性是由于NPR 在進化過程中，不同成員間功能差異性所造成的［8］。在不同農作物中，NPR1各結構域保守性較高（見表1），這與NPR1在農作物體內感知SA 及生物學功能發(fā)揮密切相關。對比擬南芥NPR與不同農作物NPR1保守性（見表1），兩者的BTB/POZ 結構域及ANK repeat 結構域保守性較高。BTB/POZ結構域和ANK repeat結構域的高保守性對于維系NPR 空間結構穩(wěn)定、寡聚體形成和生物學功能發(fā)揮起著至關重要的作用。

表1 NPR全長及各結構域保守性分析Tab.1 Conservative analysis of NPR full length and each domain

2 NPR生物學功能

2.1 NPR調控植物SAR反應

在自然界中，植物不斷面臨各種病原微生物的入侵。病原微生物不僅會導致植物各類疾病，還會使農作物產量降低10%~40%［4］。為了高效抵御病原微生物感染，植物進化出了一套復雜的先天免疫防御系統(tǒng)。植物先天免疫防御系統(tǒng)包含PTI 與ETI［9-10］。植物開啟PTI與ETI反應后，會激活抵抗繼發(fā)性感染的防御機制，即SAR。SAR 是植物產生的廣譜抗性反應，使植物在受到后續(xù)病原體攻擊時能夠更快、更強烈、更有效地激活防御反應［11］。NPR1通過激活病程調控（Pathogenesis related， PR）基因的表達，對SA介導的SAR反應產生調控作用［12］。

Weigel等人通過酵母雙雜交實驗在擬南芥中發(fā)現了能夠與NPR1 發(fā)生相互作用的抑制性蛋白NIMIN1、NIMIN2 和NIMIN3［13］。NIMIN 蛋白是NPR1阻遏物，在SA 介導的SAR 反應中抑制PR基因表達［14］。當SA 濃度處于較低水平時，細胞核內NIMIN3 與NPR1 結合，抑制下游PR基因表達。隨著SA 濃度的逐漸提高，NIMIN2 替代NIMIN3 與NPR1的C 末端結合，激活早期SA 以及NPR1 依賴性基因NIMIN1的表達。NIMIN1被表達后，取代NIMIN2與NPR1 發(fā)生作用。NIMIN1 對NPR1 的作用是短暫的，NIMIN1 不穩(wěn)定性將促進NPR1 對PR基因的激活（見圖1 A）［15］。

圖1 NPR調控植物SARFig.1 The NPR regulating SAR in plants

NPR1 不具備DNA 結合結構域，不能直接與PR基因啟動子結合。酵母雙雜交結果顯示，NPR1 在細胞核內與部分TGA 家族成員形成NPR1-TGA 激活態(tài)復合物，促進PR基因的激活表達［16-18］。TGA 是一類具有亮氨酸拉鏈結構的轉錄因子，能夠與包括擬南芥PR基因啟動子在內的類as-1樣啟動子元件結合［19-20］。TGA 轉錄因子家族存在4 類亞家族，分別為Ⅰ類，TGA1 和TGA4；Ⅱ類，TGA2、TGA5 和TGA6；Ⅲ類，TGA3 和TGA7；IV 類，TGA9 和TGA10［21-22］。當植物受到病原微生物感染時，細胞核內活性NPR1 與TGA2、TGA3、TGA5 和TGA6 結合，增強TGA2、TGA3、TGA5 和TGA6 對PR基因啟動子的結合能力，促進PR基因的表達，使植物建立SAR反應（見圖1A）［23］。

在部分NPR1-TGA 復合物中，研究人員發(fā)現了CBP/p300（CREB binding protein/p300）家族組蛋白乙酰轉移酶（Histone acetyltransferase，HAT）組分［24］。擬南芥中存在具有HAT 活性的HAC（CBP/p300-like protein），HAC 通過形成HAC-NPR1-TGA 復合物，在PR基因啟動子上發(fā)揮組蛋白乙?；蕾囆匀旧|重編程作用，使PR基因染色質松散，激活PR基因表達，促進植物建立SAR 反應（見圖1 A）［24-25］。HAC 通過NPR1 與TGA 間的相互作用被招募到PR基因染色質，推測HAC 是NPR1 與TGA 在染色質環(huán)境中有效結合所必需的［24］。

為了防止SAR 反應的過度激活、保證細胞正常存活，植物通過NPR3/NPR4 以及HOS15（High expression of osmotically responsive genes 15）途徑抑制SAR 反應（見圖1 A）［26-27］。高濃度SA 條件下，細胞核內NPR3/NPR4 與Cullin3 形成降解復合物，介導NPR1 的降解，抑制SAR 反應［27］。HOS15 為細胞核內轉錄抑制因子，能夠與ASKs（Recombinant apoptosis signal regulation kinase）、Cullin1 和Cullin4-RING E3 泛素連接酶形成SCFHOS15E3 泛素連接酶復合物，抑制SAR反應［26］。

Dong 等人認為，NPR3/NPR4 與NPR1 存在相互作用，能夠介導NPR1 降解［16，27］。但哥倫比亞大學Zhang 等人通過酵母雙雜交、蛋白質免疫共沉淀方法均未發(fā)現NPR3/NPR4 與NPR1 之間存在相互作用，也未檢測到NPR3/NPR4 與Cullin3 之間的相互作用［28］。Zhang 等人認為，NPR3/NPR4 在抑制SAR反應中獨立于NPR1 發(fā)揮功能（見圖1 B）［28］。低濃度SA 條件下，NPR3/NPR4 與TGA 轉錄因子結合，抑制SAR 反應［28］。由于兩種結論的存在，NPR3/NPR4是否獨立于NPR1 發(fā)揮作用以及發(fā)揮作用的分子機制還需進一步探討。

2.2 NPR抑制植物幼苗頂端鉤的形成

植物幼苗在生長發(fā)育過程中會形成頂端鉤，頂端鉤為幼苗沖破土壤提供動力，保護分生組織免受機械損傷。乙烯（Ethylene，ET）調控因子EIN3/EIL1（Ethylene insensitive 3/EIN3-like 1）通過N 端DNA結合結構域與下游鉤形成基因HLS1（Hookless 1）啟動子作用，促進幼苗頂端鉤形成［29-31］。研究發(fā)現，在高濃度SA 條件下，細胞核內單體NPR1能夠與EIN3的DNA 結合結構域發(fā)生相互作用，干擾EIN3 與靶基因（包括HLS1）啟動子的結合，抑制植物幼苗頂端鉤的形成（見圖2A）［29］。

圖2 NPR其他生理功能Fig.2 Other physiological functions of plant NPR

2.3 NPR促進植物葉片衰老

葉片衰老有助于植物形態(tài)發(fā)育以及大量營養(yǎng)再利用。遺傳分析結果表明，NPR1、WRKY46 以WRKY6功能依賴性方式協(xié)同調控SA介導的植物葉片衰老過程［32-35］。當植物細胞內SA 水平上升時，細胞核內活性NPR1 激活WRKY46基因的表達，并與WRKY46 作用形成NPR1-WRKY46 復合物。NPR1-WRKY46 復合物識別WRKY6啟動子W-box序列（TGACCA/T），誘導WRKY6表達。WRKY6靶向葉片衰老基因，促進植物葉片衰老（見圖2B）［33］。

2.4 NPR促進植物抵抗冷脅迫

低溫是影響植物生長發(fā)育的主要非生物脅迫。低溫決定了植物的地理分布，影響了植物的生長發(fā)育及產力［36-37］。為了應對外界冷脅迫，植物進化出了受NPR1 調控的冷適應過程。當植物受到冷脅迫時，細胞質中寡聚體NPR1 通過TRXH3/TRXH5-SnRK2.8 依賴性途徑以單體形式轉移到細胞核［38］。單體NPR1 與熱休克反應調節(jié)因子（Heat shock transcription factor 1， HSFA1）相互作用，誘導熱休克反應蛋白的大量表達（見圖2C）［36，39］。熱休克反應蛋白的表達將最大限度地減少低溫對植物體的影響，使植物適應外界寒冷［40］。

2.5 NPR調節(jié)植物晝夜節(jié)律

大多數植物都具有某種特定的生物鐘，生物鐘控制植物光/暗循環(huán)下的離子穩(wěn)態(tài)、激素信號傳導、糖感應、光周期開花和壓力信號傳導等多種生理過程［18］。生物鐘能夠驅動內源性晝夜節(jié)律變化，使植物在連續(xù)光照或黑暗條件下也可以遵守大約24 小時的周期［41］。有證據表明，受細胞內SA節(jié)律性積累變化影響，NPR1 作為氧化還原感受器參與晨鐘基因LHY（Late elongated hypocotyl）以及晚鐘基因TOC1（Timing of CAB expression 1）的表達，對植物晝夜節(jié)律進行調控（見圖2D）［42-44］。植物晚鐘基因TOC1表達水平在夜晚達到峰值，NPR1 的誘導會提高TOC1在夜間的表達水平，延長植物晝夜節(jié)律周期［45-46］。晨鐘基因LHY的表達在黎明時刻達到峰值，受到NPR1 誘導后，LHY基因表達上調［43］，影響植物晝夜節(jié)律周期。

3 NPR空間結構

3.1 NPR139-410空間結構

為了獲得NPR1結構信息、闡明NPR1復雜分子作用機制，Kumar 等人通過X-ray 方法，以3.06 ? 的分辨率解析了擬南芥NPR139-410的三維空間結構［6］。NPR139-410為同源二聚體，兩個BTB/POZ 結構域以“頭對頭”的方式相互作用（見圖3A）［6，47］。結構顯示（見圖3 B），NPR1-BTB/POZ 結構域核心是由中心的3 個β 折疊（B1、B2、B3）和外側的5 個α 螺旋（A1、A2、A3、A4、A5）所組成［6，47］。在BTB/POZ 結構域C末端，存在由4 個螺旋束（A6、A7、A8、A9）所構成的BHB 結構，BTB/POZ 結構域通過BHB 與ANK repeat結構域連接（見圖3 B）［6］。NPR1-ANK repeat 結構域由3 個標準的ANK（ANK2、ANK 3、ANK 4）結構以及1 個非標準的ANK（ANK1）結構所組成（見圖3 B）。ANK1與ANK2通過環(huán)狀結構連接，ANK2、ANK3、ANK4 通過β 發(fā)夾結構連接［6］。每個ANK 結構連接橋中包含保守的組氨酸殘基（如ANK2-H300、ANK3-H334）［48］，這些組氨酸殘基在PR基因表達及SAR 反應建立中起到至關重要的作用。在擬南芥nim1-2 突變株以及npr1-1 突變株中，PR基因轉錄水平下降，SAR反應缺陷［6］。

圖3 NPR蛋白空間結構［6，54］Fig.3 NPR proteins spatial structure［6，54］

NPR1-BTB/POZ 結構域中存在由C150X4C155X1H157X2C160所組成的鋅指結合基序，能夠對Zn2+的結合進行調控［49］。當C150、C155、H157、C160發(fā)生突變后，NPR1 結合Zn2+能力顯著下降［49］。在鋅指結合基序中，D152 能夠與ANK4 中的L370 以及Q371 形成氫鍵，鎖定鋅指結構與ANK4 的空間構象，促進NPR1與轉錄因子TGA 的相互作用［6］。當D152 發(fā)生突變后，NPR1 無法與TGA 發(fā)生相互作用，PR基因的表達及SAR 反應的建立受到嚴重影響［2，50-51］。鋅指結合基序中的C156 作為氧化還原感受器，參與NPR1單體界面處的相互作用［6］。擬南芥C156 突變株中，大部分NPR1以單體形式存在，NPR1喪失與TGA 結合的能力［6］。

Kumar等人所解析的NPR139-410空間結構中不包含NPR1-SBD，但NPR4-SBC（SA binding core）與NPR1-SBD 具有很高的序列同源性，因此研究人員通過分子對接手段將NPR4-SBC 與NPR1-ANK repeat 結構域進行對接［52］。SWISS-MODE 模型顯示，NPR1-SBD由4段α螺旋（α1、α2、α3、α4）構成，并與ANK repeat 結構域存在相互作用［6］。NPR1-SBD 中α2 螺旋I450、α3-α4 螺旋連接橋中F507 和F508 與ANK3 和ANK4 的L346、L393、I397 之間形成了一個疏水界面，該疏水界面對于NPR1 與轉錄因子TGA的結合以及NPR1 的類徑素化（Small ubiquitin-like modifier，SUMO）修飾起到至關重要的作用［6，53］。

3.2 NPR1-TGA3復合物空間結構

Kumar 等人通過冷凍電鏡方法，以3.6 ? 的分辨率解析了NPR1-TGA3 激活態(tài)復合物的三維空間結構［6］。NPR1-TGA3 復合物結構以（TGA3）2-（NPR1）2-（TGA3）2形式存在，二聚體NPR1 作為“橋梁”連接兩個與DNA 結合的TGA3 二聚體（見圖3 C）［6］。結構顯示（見圖3 D），TGA3 存在NPR1 結合結構域（NPR1-interacting domain，NID）。NID 由5 個突出的長螺旋（α1、α2、α6、α7、α8）以及3 個短螺旋（α3、α4、α5）組成。4 個長螺旋α1、α2、α6、α7 形成一個拱形層，而3個短螺旋α3、α4、α5以“之”字形穿過該層并支撐α8 螺旋遠離拱形層［6］。NID 二聚體由3 個短螺旋α3、α4、α5 之間以及1 個單體中傾斜的α8 螺旋與另1個單體中的α6-α7螺旋之間的廣泛相互作用所形成［6］。在TGA-NID 內部存在棕櫚酸（見圖3 D），暗示脂質代謝在植物免疫調節(jié)中可能發(fā)揮作用［6］。

結構顯示（見圖3 E），NPR1 與TGA3-NID 存在精細的調控作用。TGA3-IND 中α5-α6 的P264、T266 和 α7-α8 的T351 形成疏水凹面，NPR1 通過ANK1 的L281、L282 與該凹面產生疏水作用［6］。同時，ANK1中的L272、S276、D277、D278、G280、E288、H290與TGA3中的Q263、D267、T352、R353、R357形成氫鍵以及鹽鍵參與NPR1與TGA3的結合［6］。

3.3 NPR4-SBC結構

NPR4 同樣為SA 受體，在植物細胞中與NPR1發(fā)揮拮抗作用。NPR4-C 末端第373 位氨基酸到第516 位氨基酸被鑒定為SBC 區(qū)域，NPR4 通過該區(qū)域與SA 結合［54］。Wang 等人通過晶體學方法，以2.3 ?的分辨率解析了結合SA后的NPR4-SBC結構［54］。

結合SA 后的NPR4-SBC 在外形上呈“錐”形，由5 個緊密排列的α 螺旋（αN、αSC1、αSC2、αSC3、αSC4）組成（見圖3 F）。αSC1、αSC2、αSC3、αSC4 形成疏水SA 結合口袋，側面αN 螺旋起到穩(wěn)定該結構的作用。SA 結合口袋的底層由αSC2 的E430 以及αSC4的C499組成，E430、C499被來自αSC1和αSC3的F427 以及F496 所支撐［54］。由于底層的E430 側鏈羧基指向溶劑，所以E430、C499、F427、F496 會形成疏水環(huán)境，固定SA 的苯環(huán)部分［54］。在SA 結合口袋中間層，αSC1 的A423 以及αSC3 的G492 將SA 的苯環(huán)夾在中間，αSC2 的A431 和A434、αSC4 的Y500和L503 包圍苯環(huán)邊緣［54］。在SA 結合口袋頂層，αSC1 的V420 和αSC3 的V489 以相互交叉的形式將SA 密封在結合口袋中（見圖3 F）［54］。作為SA 結合口袋標志性殘基，R419 通過氫鍵和離子鍵與SA 的羧基形成相互作用，穩(wěn)定SA與結合口袋的結合［54］。

4 展望

本文對NPR 家族蛋白在植物SAR、形態(tài)發(fā)育、冷脅迫、晝夜節(jié)律調控過程中所發(fā)揮的生物學功能以及NPR1、NPR1-TGA3 復合物、NPR4 空間結構的最新研究進展進行綜述。雖然植物NPR 家族蛋白的功能與結構已得到廣泛探究，但是仍存在一些問題急需解決。

（1）NPR 家族蛋白調控植物多種生理過程，除NPR1 在SAR 反應中的作用機制已通過NPR1-TGA3 結構得到闡明，NPR 其余作用機制未通過蛋白結構被闡明。

（2）NPR1 作為SA 受體，功能的發(fā)揮依賴于SA所誘導的構象變化。由于NPR1-SBD 區(qū)域柔性較大，所以NPR1-SBD空間結構至今并未得到解析。

（3）NPR3/NPR4 功能的發(fā)揮是否獨立于NPR1及NPR1 在細胞核內的降解過程還需要進一步探究。

外界生物及非生物脅迫對農作物生長發(fā)育造成不利影響，嚴重則導致作物產量下降，影響人類身體健康，對我國經濟造成巨大損失。作為農業(yè)大國，我們一直致力于增強農作物對外界脅迫的抗性，增加作物產量。如今，NPR 家族蛋白在多種農作物中已被鑒定，并且在廣譜抗性中發(fā)揮重要作用。因此，NPR 家族蛋白結構與功能的研究將為解決植物培育問題提供全新思路。