蘇曉艷，毛小文，顧志榮，鞏亦萍，馬 薇，謝宇平*

（1.甘肅省人民醫(yī)院 睡眠醫(yī)學(xué)中心，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；3.甘肅省人民醫(yī)院 藥劑科，甘肅 蘭州 730000）

失眠癥（Insomnia）是臨床最為常見的睡眠障礙，指個體在客觀條件允許的情況下對于睡眠的時間和質(zhì)量不滿足，并引起日間功能受損的一種主觀體驗。流行病學(xué)資料顯示，中國有45.4%的被調(diào)查者在過去1 個月曾經(jīng)歷過不同程度的失眠［1］。目前，國內(nèi)外指南均認(rèn)為對于失眠癥治療首選認(rèn)知行為治療或其他非藥物干預(yù)，如果治療無效或患者拒絕時，才推薦藥物治療。藥物治療首選短、中效的苯二氮卓受體激動劑（Benzodiazepine receptor agonists，BZRAs）或褪黑素受體激動劑。西藥治療雖然起效迅速，短期療效好，但存在成癮性、耐藥性、后遺效應(yīng)、肝腎損害及停藥后易反彈等問題［2］。中醫(yī)藥治療失眠癥的長期療效較好，不良反應(yīng)較少，大眾接受度高，具有明顯優(yōu)勢，目前常用的治療方式包括中藥、針灸、推拿按摩、針?biāo)幗Y(jié)合、中西醫(yī)結(jié)合等［3-4］等。

薰衣草精油（Lavender essential oil，LEO）是薰衣草（Lavandula angustifoliaMill.）的有效成分，已被《中華本草》［5］《維吾爾藥材標(biāo)準(zhǔn)》［6］等收載。LEO 對于睡眠障礙、焦慮、偏頭痛等具有較好的療效，目前在國內(nèi)主要用于芳香吸入療法［7］，但存在療效不確切、難以量化控制、使用不便、作用機(jī)制不明等問題，國外已有LEO 口服制劑用于臨床［8］。項目組前期已將LEO 制備為口服的具有緩釋功能的固體分散體，用于解決目前芳香吸入法治療存在的問題，并達(dá)到緩慢釋藥、長久起效的作用。本研究探討LEO緩釋固體分散體對失眠小鼠的治療作用及對單胺類神經(jīng)遞質(zhì)（Monoamine neurotransmitters）的影響，為后續(xù)研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF 級昆明種小鼠60 只，雌雄各半，體質(zhì)量18~ 22 g，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（甘）2020-0001，實驗動物使用許可證號：SYXK（甘）2020-0009。實驗前均適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由飲水、進(jìn)食。

1.2 藥品與試劑

LEO緩釋固體分散體（每g含薰衣草精油0.1 g），制法為：采用熔融法制備，將硬脂酸、聚乙二醇6000（PEG 6000）、單硬脂酸甘油酯以3∶5∶1 的配比置于70 ℃烘箱中，待完全熔融后滴加與單硬脂酸甘油酯同比例的LEO，充分?jǐn)嚢杌靹颍缓笱杆賰A倒于冰浴不銹鋼板上，涂成薄層，于-20 ℃冷卻6 h，用藥勺刮掉凝結(jié)的固體分散體，真空干燥，待脆化后研細(xì)，過80 目篩，即得。地西泮片（山東信誼制藥有限公司，規(guī)格2.5 mg/片，批號191004）；氯化鈉注射液（中國大冢制藥有限公司，批號21E0802）；戊巴比妥鈉（美國Sigma 公司，批號P3776）；對照品去甲腎上腺素（批號CHB201223）、多巴胺（批號CHB201225）、5-羥色胺（批號CHB201107）、高香草酸（批號CHB201206）、二羥基苯乙酸（批號CHB201113）、5-羥吲哚乙酸（批號CHB201117），均購于成都克洛瑪生物科技有限公司；氯苯丙氨酸（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號K2011039）；高氯酸、乙二胺四乙酸鈉（EDTA-Na2）、檸檬酸、無水乙酸鈉、二正丁胺、磷酸、B8離子對試劑均為分析純，甲醇為色譜純，均購于天津市大茂化學(xué)試劑廠；水為重蒸水。

1.3 儀器

1260 型高效液相色譜儀（美國Aglient 公司）；電化學(xué)檢測器（荷蘭Antec 公司）；BSA124S 萬分之一電子天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；BSA2202S百分之一電子天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；HH-6 型數(shù)顯恒溫水浴鍋（西安超杰儀器有限公司）；SB25-12DTD 型超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；F6/10-8G 型超細(xì)勻漿機(jī)（上海佛魯克液體機(jī)械制造有限公司）；高速冷凍離心機(jī)（美國Thermo Fisher 科技公司）；臺式高速離心機(jī)（德國Eppendorf公司）。

1.4 動物分組及模型復(fù)制

將60只昆明種小鼠（雌雄各半）隨機(jī)分為正常對照組、PCPA模型組、地西泮陽性藥物組、LEO緩釋固體分散體高、中、低劑量給藥組，每組10只，各組動物分籠飼養(yǎng)。除正常對照組外，其余各組小鼠腹腔注射（Intraperitoneal injection， ip）PCPA 混懸液（450 mg/kg），連續(xù)2 d，復(fù)制失眠模型，正常對照組ip等體積NS。第2 d ip PCPA 后0.5 h，ip 戊巴比妥鈉（45 mg/kg），觀察小鼠的睡眠持續(xù)時間（即翻正反射消失至恢復(fù)），睡眠持續(xù)時間顯著降低表示建模成功。

1.5 給藥方法

第2 d ip PCPA 后，陽性藥物組灌胃（Intragastric administration， ig）地西泮片（0.92 mg/kg），低、中、高劑量給藥組ig LEO緩釋固體分散體（劑量分別為1.67、3.34、6.68 g/kg），正常對照組與PCPA模型組按比例ig同體積NS，1次/d，連續(xù)7 d。

1.6 體質(zhì)量變化考察

在實驗前及造模成功后每天固定時間分別稱定各組小鼠的體質(zhì)量，連續(xù)7 d。

1.7 睡眠時間測定

第6 d ig 60 min 后，各組小鼠ip 戊巴比妥鈉（45 mg/kg），測定小鼠的睡眠持續(xù)時間（翻正反射消失至恢復(fù)的時間）。

1.8 行為學(xué)測試

第7 d ig 后60 min，對全部小鼠采用曠場實驗進(jìn)行行為學(xué)測試。觀察并記錄小鼠在3 min 內(nèi)的水平活動得分、垂直活動得分及修飾活動得分。水平活動得分指小鼠穿越底面的方格數(shù)，3 爪以上跨入即可；垂直活動得分指小鼠前肢離地、后肢站立的次數(shù)；修飾活動得分指小鼠理毛、抓耳撓腮等行為次數(shù)與糞便數(shù)之和［9］。

1.9 高效液相色譜—電化學(xué)檢測系統(tǒng)測定腦組織內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及代謝產(chǎn)物

1.9.1 組織樣本采集與制備

末次給藥24 h 后，麻醉處死，快速斷頭摘取各組小鼠大腦海馬及腦干組織，加3 倍量0.1 mol/L 高氯酸（HClO4）溶液（內(nèi)含0.3 mmol EDTA，0.5 mmol Na2SO3）作為勻漿液于冰浴中勻漿，離心2 次（4 ℃，14 400 × g，10 min），取上清，以0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液即得。同法不加入組織樣本制備陰性對照液。

1.9.2 混合對照品溶液配制

分別精密稱取去甲腎上腺素（Norepinephrine，NE）、二羥基苯乙酸（Dihydroxy-phenylaceticacid，DOPAC）、多巴胺（Dopamine，DA）、5-羥吲哚乙酸（5-Hydroxyindoleacetic acid，5-HIAA）、高香草酸（Homovanillic acid，HVA）、5-羥色胺（5-Hydroxytryptamine，5-HT）對照品7.11、18.56、6.62、9.70、5.34、7.86 mg，置于100 mL 量瓶中，以0.1 mol/L HClO4溶液溶解并定容，再取1 mL 上述溶液置于100 mL量瓶中，以0.1 mol/L HClO4溶液溶解并定容，配置成含NE、DOPAC、DA、5-HIAA、HVA、5-HT 分別為0.711、1.856、0.662、0.970、0.534、0.786 mg/L 的混合對照品溶液。

1.9.3 色譜條件

采用高效液相色譜—電化學(xué)檢測系統(tǒng)檢測。Quattro 4 C18色譜柱（150 mm × 2.1 mm，3 μm），電化學(xué)檢測器檢測電壓為+0.75 V，流動相為緩沖鹽溶液-甲醇（V/V =89∶11），等度洗脫，流速1 mL/min，進(jìn)樣量20 μL。其中，緩沖鹽溶液內(nèi)含50 mmol的檸檬酸-乙酸鈉，1 mmol B8 離子對試劑，1.8 mmol二正丁胺，0.3 mmol EDTA-Na2，用濃磷酸調(diào)pH 為3.3。結(jié)果見圖1。

圖1 單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物的HPLC圖譜Fig. 1 HPLC chromatograms of monoamine neurotransmitters and their metabolites

1.9.4 工作曲線制備

取“1.9.2”項下混合對照品溶液，分別進(jìn)樣1、5、10、20、30、40 μL，按“1.9.3”項下的色譜條件測定，記錄峰面積。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）繪制工作曲線，采用“外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法”計算含量。工作曲線見表1。

表1 單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物的工作曲線Tab. 1 Working curves of monoamine neurotransmitters and their metabolites

1.9.5 精密度考察

取同一供試品溶液，按“1.9.3”項下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6 次，計算得NE、DOPAC、DA、5-HIAA、HVA、5-HT 峰面積的RSD 分別為2.39%、2.25%、3.37%、4.08%、1.94%、4.34%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

1.9.6 重復(fù)性考察

取同一供試品溶液6 份，按“1.9.3”項下色譜條件重復(fù)測定，記錄NE、DOPAC、DA、5-HIAA、HVA、5-HT 的峰面積，計算得各成分含量的RSD 分別為1.51%、4.52%、2.53%、4.38%、1.33%、2.15%，結(jié)果表明該方法重復(fù)性較好。

1.9.7 穩(wěn)定性考察

取同一供試品溶液，按“1.9.3”項下色譜條件，分別于0、3、6、12、18、24 h 進(jìn)行測定，計算得NE、DOPAC、DA、5-HIAA、HVA、5-HT 峰面積的RSD 分別為1.38%、0.94%、2.61%、1.52%、3.82%、2.57%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

1.9.8 回收率考察

取已知含量的樣品，分別加入高、中、低濃度的對照品溶液，按“1.9.1”項下方法處理樣品，按“1.9.3”項下色譜條件測定，計算得NE、DOPAC、DA、5-HIAA、HVA、5-HT 的平均回收率分別為104.55%、98.12%、103.78%、97.43%、95.12%、102.27%，RSD 分別為2.58%、1.05%、3.52%、1.82%、2.39%、3.53%，結(jié)果表明方法回收率良好。

1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

2 結(jié)果

2.1 LEO對失眠小鼠體質(zhì)量的影響

結(jié)果見表2。實驗前各組的體質(zhì)量無顯著性差異（P> 0.05）。正常對照組的體質(zhì)量隨實驗時間延長而逐漸增加，并從實驗第2 d 開始具有統(tǒng)計學(xué)意義（P< 0.01）。ip PCPA的其余各組的體質(zhì)量均呈先下降后上升的趨勢。與實驗前相比，陽性藥物組與LEO 中劑量組的體質(zhì)量恢復(fù)從ig 第4 d 開始顯著增加（P< 0.05 或P< 0.01），LEO 高劑量組從ig 第3 d開始顯著增加（P< 0.05），LEO 低劑量組從ig 第5 d開始顯著增加（P< 0.01）。與PCPA 模型組比較，高劑量給藥組ig 第4 d 開始體質(zhì)量增加顯著（P< 0.01），表明LEO 緩釋固體分散體能夠顯著改善ip PCPA所致的失眠小鼠的體質(zhì)量下降。

表2 LEO對失眠小鼠體質(zhì)量的影響Tab.2 Effect of LEO on body weight of insomnia modle mice

2.2 LEO對失眠小鼠睡眠時間的影響

結(jié)果見表3。與PCPA 模型組相比，ig 第6 d 時，陽性藥物組與LEO 高、中、低劑量組的睡眠持續(xù)時間均顯著延長（P< 0.05 或P< 0.01），且睡眠時間隨著LEO 的劑量增加有增加趨勢，表明LEO 緩釋固體分散體具有明確的鎮(zhèn)靜催眠作用，但增加睡眠時間的效果均不及陽性藥物組。與正常組相比，ig 第6 d時，陽性藥物組和LEO 高、中劑量組的睡眠持續(xù)時間均顯著延長（P< 0.01）。ig第6 d時，PCPA 模型組的睡眠持續(xù)時間低于正常對照組，出現(xiàn)失眠癥狀，但無顯著性差異，可能是PCPA 作用已下降或小鼠已對失眠產(chǎn)生了一定的適應(yīng)性。

表3 LEO對失眠小鼠睡眠時間及行為學(xué)的影響Tab. 3 Effect of LEO on sleep duration and behavioral activity of insomnia modle mice

2.3 LEO對失眠小鼠行為學(xué)的影響

結(jié)果見表3。與正常組比較，ig 第7 d 時，PCPA模型組水平活動得分和垂直活動得分均顯著減少（P< 0.01）。與PCPA模型組相比，陽性藥物組、LEO高、中劑量組的水平活動得分與垂直活動得分均顯著增加（P< 0.05 或P< 0.01），LEO 低劑量組的水平活動得分與垂直活動得分均無顯著性差異；各組的修飾活動得分均無顯著性差異。結(jié)果表明，LEO 緩釋固體分散體能夠改善PCPA 所致失眠模型小鼠的水平活動次數(shù)和垂直活動次數(shù)的下降。

2.4 LEO 對失眠小鼠腦組織內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的影響

結(jié)果見表4 ~ 5。與正常對照組相比，PCPA 致失眠模型小鼠的海馬、腦干組織中DA 含量均顯著升高（P< 0.01），而腦干組織中NE 含量也顯著升高（P< 0.01）；海馬組織中NE、5-HIAA、HVA、5-HT 含量均顯著降低（P< 0.01）。與PCPA 模型組相比，陽性藥物組、LEO高、中、低劑量組小鼠的海馬、腦干組織中5-HT 含量均顯著升高（P< 0.01），DOPAC、DA含量均顯著降低（P< 0.01）；陽性藥物組、LEO 高、中、低劑量組小鼠的海馬組織中HVA 含量顯著降低（P< 0.01），腦干組織中NE含量顯著降低（P< 0.01）。失眠小鼠海馬及腦干組織DA 含量增多，海馬組織中5-HT 含量減少，LEO 緩釋固體分散體高、中、低劑量對此均有顯著療效，說明各給藥組可能通過降低海馬及腦干組織中DA 含量來增加海馬組織中5-HT的含量而治療失眠。

表4 LEO對失眠小鼠海馬組織中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及代謝產(chǎn)物的影響Tab. 4 Effect of LEO on monoamine neurotransmitters and their metabolites in hippocampus of insomnia modle mice

表5 LEO對失眠小鼠腦干組織中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及代謝產(chǎn)物的影響Tab. 5 Effect of LEO on monoamine neurotransmitters and their metabolites in brainstem of insomnia modle mice

3 討論

根據(jù)《中華本草》記載，成人口服薰衣草的每日用量為3 ~ 9 g，本實驗所用LEO 在原藥材中的含量為0.62 mL/100g。以70 kg 成人口服薰衣草的日用量為9 g，根據(jù)等效劑量系數(shù)9.1［10］，換算可得小鼠的LEO 給藥劑量為508 mg/kg，因此設(shè)定小鼠的LEO低、中、高給藥劑量分別為250 mg/kg、500 mg/kg、1000 mg/kg，對應(yīng)LEO 緩釋固體分散體分別為1.67、3.34、6.68 g/kg。

單胺類神經(jīng)遞質(zhì)在睡眠調(diào)節(jié)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，是目前睡眠障礙相關(guān)疾病研究及藥物研發(fā)的重要方向之一。大腦皮層、腦干和海馬組織中都含有單胺類神經(jīng)遞質(zhì)?，F(xiàn)有研究表明，單胺類神經(jīng)遞質(zhì)NE、DA、5-HT 主要通過作用于腦干區(qū)域的突觸活動來調(diào)節(jié)睡眠-覺醒周期［11］，因此本研究選取小鼠的海馬和腦干作為失眠研究部位。

本研究選擇單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及代謝產(chǎn)物NE、DOPAC、DA、5-HIAA、HVA、5-HT 作為研究指標(biāo)。其中，5-HT 與DA 是目前研究的熱點。5-HT 能夠促進(jìn)睡眠，其主要代謝途徑是5-HIAA。DA 是興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，濃度升高可導(dǎo)致覺醒增加、睡眠減少，而HVA 與DOPAC 是其主要代謝產(chǎn)物，HVA 同時也是兒茶酚胺類NE的代謝產(chǎn)物［12-13］。

本研究表明，LEO 緩釋固體分散體具有明確的鎮(zhèn)靜催眠作用，其機(jī)制可能與升高腦組織中5-HT含量、降低DA 含量有關(guān)，與目前報道的結(jié)果相一致。與PCPA 模型組相比，陽性藥物組對小鼠的體質(zhì)量改善無統(tǒng)計學(xué)意義（P> 0.05）；而高劑量給藥組ig 第4 d 開始體質(zhì)量顯著增加（P< 0.01），表明LEO緩釋固體分散體能夠顯著改善ip PCPA 所致的失眠小鼠的體質(zhì)量下降，其原因可能與LEO 具有增加食欲的作用有關(guān)［14］。

相比西藥氯硝西泮、艾司唑侖、佐匹克隆等鎮(zhèn)靜催眠類藥物，LEO 具有作用穩(wěn)定、持續(xù)時間長、對認(rèn)知功能起到保護(hù)作用、不具有宿醉樣感覺和成癮性等明顯優(yōu)點，主要通過抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)起到鎮(zhèn)定安神作用［7］。不同國家、不同類型失眠患者的相關(guān)研究均證實了這一點，LEO 常用的方式包括芳香吸入、精油按摩及口服［15］。目前研究認(rèn)為，口服LEO的鎮(zhèn)靜催眠作用由其抗焦慮作用所介導(dǎo)，代表制劑為Silexan 膠囊［8］。在臨床上，LEO 芳香療法常結(jié)合其他治療使用，如結(jié)合分階段行為轉(zhuǎn)變治療可改善睡眠質(zhì)量，促進(jìn)腰椎功能恢復(fù)［16］；結(jié)合齊拉西酮治療能夠有效提高精神分裂癥緩解期患者的認(rèn)知功能，改善其睡眠質(zhì)量［17］。