張立華，黃海明，劉雷雷，程宏毅，章書聲,5

(1. 泰順縣自然資源和規(guī)劃局, 浙江 溫州 325500；2. 浙江省舟山林場，浙江 舟山 316021；3. 浙江烏巖嶺國家級自然保護(hù)管理中心，浙江 溫州 325500；4. 浙江師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華 321004；5. 浙江省野生動物生物技術(shù)與保護(hù)利用重點實驗室，浙江 金華 321004)

1997 年，McCafferty 和Wang 建立晚蜉科Teloganodidae 澳洲小蜉亞科Austremerellinae，包括越南蜉屬Vietnamella[1]，2000 年，又將該亞科提升為科，命名為越南蜉科Vietnamellidae[2]。目前，全世界報道的越南蜉科物種共有9 種，其中有效物種為6 種，中國分布4 種[3-10]。Hsu[11]將采自江西上饒的中華越南蜉命名為Ephemerellasinensis，而McCafferty 和Wang 將其移入越南蜉屬，命名為Vietnamellasinensis[6]。1972 年，Tshernova建立新屬越南蜉屬并報道采自越南的韓氏越南蜉V.thani[3]；同時報道的越南蜉Ephemerellaornata也被McCafferty 和Wang[6]移入越南蜉屬并命名為裝飾越南蜉V.ornata。1987 年，尤大壽和蘇翠榮[4]描述了采自安徽和浙江的新種大別山越南蜉V.dabieshanensis。1995 年，周長發(fā)和蘇翠榮[5]描述了采自浙江和福建的兩新種——慶元越南蜉V.qingyuanensi和掛墩越南蜉V.guadunensis。2017 年，Hu 等[10]將之前的越南蜉屬的大別山越南蜉、慶元越南蜉和掛墩越南蜉合并到中華越南蜉Vietnamellasinensis，認(rèn)為這三個物種均為中華越南蜉的同物異名。近年來，隨著形態(tài)和線粒體COI基因結(jié)合為蜉蝣目Ephemeroptera 新種發(fā)現(xiàn)提供佐證[8-9,12-14]。2020 年，Auychinda等發(fā)表采自泰國的新種V.nanensis[8]；Luo 等發(fā)表采自車八嶺國家級自然保護(hù)區(qū)的新種車八嶺越南蜉V.chebalingensis[9]；2021 年，Tong 等發(fā)現(xiàn)慶元采集的越南蜉為中華越南蜉的隱存種[15]。

蜉蝣作為原始的有翅昆蟲，其系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系一直是研究的熱點[16-18]。小蜉科Ephemerellidae、越南蜉科和晚蜉科Teloganodidae 的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系存在一定的爭議[19-23]。2005 年，Ogden 等[19]利用形態(tài)數(shù)據(jù)認(rèn)為小蜉科、越南蜉科和晚蜉科三者的親緣關(guān)系較近：越南蜉科與晚蜉科形成姐妹群，越南蜉科和晚蜉科支系再與小蜉科形成姐妹群。2009 年，Ogden 等[20]結(jié)合12SRNA、16SrRNA、18SrDNA、28SrDNA和H3基因的分子數(shù)據(jù)集與形態(tài)數(shù)據(jù)認(rèn)為小蜉科、越南蜉科和晚蜉科等為并系關(guān)系，未有效得出三者的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。之后，Cai 等[21]、Gao 等[22]和Ye 等[23]基于蜉蝣目線粒體13 個蛋白編碼基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹均支持小蜉科與越南蜉科形成姐妹群，而兩者與晚蜉科關(guān)系較遠(yuǎn)。

線粒體基因（mtDNA）因其組成穩(wěn)定、基因排列相對保守、普遍為母系遺傳、進(jìn)化速率比核基因快、極少發(fā)生重組等特點，故被廣泛應(yīng)用于進(jìn)化、系統(tǒng)發(fā)生、種群遺傳結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)地理學(xué)等方面的研究[15,24-30]。而線粒體COI基因作為DNA 條形碼，能有效地進(jìn)行物種鑒定，是研究物種遺傳結(jié)構(gòu)、種群多樣性和隱存種的有效分子標(biāo)記[30-31]。本研究擬對淳安、桐廬、慶元和泰順?biāo)目h的越南蜉屬物種通過線粒體COI基因確定是否存在隱存種，并通過光學(xué)顯微鏡和掃描電子顯微鏡對不同地區(qū)的越南蜉稚蟲口器、鰓、足等形態(tài)特征進(jìn)行比較，在顯微結(jié)構(gòu)和超顯微結(jié)構(gòu)上研究其形態(tài)的差異，并證明為新種。

1 材料與方法

1.1 樣本的采集與初步鑒定

越南蜉物種樣本的采集地參考周長發(fā)等的方法[32]，分別在2019 年7 月和2022 年7 月通過踢網(wǎng)法采集越南蜉稚蟲，在浙江省淳安縣（CA）、桐廬縣（TL）、慶元縣（QY）和泰順縣（TS）分別采集到8 只、5 只、15只和10 只稚蟲。在尼康SMZ-1500 體視解剖鏡下對采集到的越南蜉稚蟲樣本進(jìn)行形態(tài)上的初步鑒定，參照《中國蜉蝣概述》[33]中的蜉蝣物種名錄對樣本進(jìn)行分類，并做拍照記錄。

1.2 形態(tài)特征觀察

采用尼康SMZ-1500 體式解剖鏡對越南蜉稚蟲樣本包括足、頭、觸角、下顎、下唇、舌、上唇、上顎、鰓及尾絲等形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行解剖觀察并拍照記錄。用無齒小鑷子將經(jīng)過100%乙醇脫水3 次制備好的樣品粘在導(dǎo)電膠上，用Phenom Pro 掃描電子顯微鏡進(jìn)行掃描觀察，選取結(jié)構(gòu)完整、成像效果較好的部位進(jìn)行拍照保存。使用Photoshop 軟件對光鏡、電鏡下的越南蜉樣本各形態(tài)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)進(jìn)行測量統(tǒng)計并界定各采集地越南蜉的形態(tài)差別。

1.3 分子數(shù)據(jù)研究

1.3.1COI基因序列的獲得 對4 個采集地各取2 個樣本的胸部肌肉，使用Ezup 柱式動物基因組DNA 抽提試劑盒（生工生物工程（上海）股份有限公司生產(chǎn)）抽提總DNA。使用相應(yīng)的COI基因引物[34]在PCR 儀（Bio-Rad，美國）中對提取的DNA 進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增，送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行雙向測序。將測序成功的COI基因序列在NCBI 上進(jìn)行BLAST 比對，確定是否為目的基因。對所獲得的8 條COI基因序列比對，序列完全一致合并為相同單倍型，最終獲得4 個采集地越南蜉的4 個單倍型COI基因序列。

1.3.2 遺傳距離的計算和系統(tǒng)發(fā)生樹的構(gòu)建 在MEGA 7.0 中使用Clustal W 程序?qū)CBI 數(shù)據(jù)庫中的越南蜉屬物種（6 種14 條序列）與本研究越南蜉樣本的COI基因序列（4 條單倍型序列）進(jìn)行比對，而后在MEGA 7.0中選擇K2P 模型分別計算越南蜉屬各物種COI基因的遺傳距離[35-36]，并構(gòu)建NJ 系統(tǒng)發(fā)生樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)特征

從慶元縣和泰順縣采集的越南蜉物種稚蟲（雌，圖1A）（酒精中）主要特征：體長11.2 ～ 11.5 mm，尾絲11.0 ～ 12.0 mm，體色棕色至棕褐色，頭部具突起和瘤突，邊緣有密集的細(xì)毛。

圖1 采自慶元縣和泰順縣的越南蜉稚蟲的形態(tài)結(jié)構(gòu)Fig. 1 Morphological structure of naiad of Vietnamella from Qingyuan and Taishun

頭部（圖1B）：頭部具額頰背突起，前部具2 對角狀突起，內(nèi)側(cè)1 對較小，外側(cè)1 對發(fā)達(dá)，略向下彎；觸角著生于內(nèi)外側(cè)角之間，略長于外側(cè)大角，13 ～ 17 節(jié)不等，節(jié)間具稀疏環(huán)細(xì)毛；復(fù)眼突出、圓形。

口器（圖1E-L）：上顎（圖1F & H-I），細(xì)長，切齒發(fā)達(dá)，外切齒完全融合，呈匙狀，尖細(xì)，暗紅色，內(nèi)切齒轉(zhuǎn)化為兩簇具有共同基部的剛毛，磨齒塊狀，表面粗糙；左右上顎不對稱，右上顎（圖1H）磨齒內(nèi)側(cè)有一較長的指狀突起，內(nèi)緣附加小簇刺狀剛毛；下顎（圖1G & J）端部尖細(xì)，端部內(nèi)側(cè)具2 ～ 3 個較大的刺狀突起，外側(cè)有一小簇剛毛；下顎須三節(jié)，有微小的剛毛，從基部到頂端的長度比為1.0∶（1.5 ～ 1.6）∶1.0；舌分三葉，兩側(cè)葉發(fā)達(dá)，端部和邊緣具細(xì)毛；上唇（圖1E & K）棕褐色，中部有一排橫向排列的微刺，下緣及側(cè)下緣密生細(xì)毛，側(cè)緣細(xì)毛更長更密；下唇（圖1L）上緣密生細(xì)毛，側(cè)唇發(fā)達(dá)，中唇舌較小，下唇須3 節(jié)，每節(jié)均有稀疏微小的剛毛，基部比第二節(jié)寬和長，頂端非常小。

胸部（圖1A）：前胸背板的前側(cè)有圓形小突起、前角向前呈刺狀突起。每節(jié)胸部各具一對足，前中后足的腿節(jié)：脛節(jié)：跗節(jié)分別為3.5∶3.0∶1.0、（3.5 ～ 3.7）∶3.0∶1.0、4.5∶3.0∶1.0；前足腿節(jié)寬扁，其內(nèi)緣有一排5 ～ 10 枚利齒，由近基部到遠(yuǎn)基部逐漸變小（圖1C），脛節(jié)和跗節(jié)正常、無突起利齒，中后足正常；前足腿節(jié)最寬處形成明顯的橫向脊背，內(nèi)、外、基部邊緣和脊具一排剛毛，中后足腿節(jié)內(nèi)、外、基部邊緣有剛毛，各足脛節(jié)表面具細(xì)毛，內(nèi)緣有一排密集的剛毛；各足的跗節(jié)呈深褐色，具非常稀疏的剛毛；各爪子均相似，有一個爪底小齒和一些細(xì)小的頂端剛毛，尖端（圖1D）棕紅色。

腹部（圖1A）：腹部背板灰褐色；腹面顏色稍淺，兩側(cè)具褐色縱紋；腹節(jié)背板的中部具矮的成對縱脊；1 ～9 腹節(jié)的側(cè)后角先后延伸呈尖銳的刺狀。腹部側(cè)位具鰓7 對，位于第1 ～ 7 腹節(jié)；鰓方形，第1 對鰓較小，手指狀，不分節(jié)，明顯不同于其他6 對鰓；第2 ～ 6 對鰓結(jié)構(gòu)相似，分背側(cè)和腹側(cè)片層；背葉膜質(zhì)，腹葉分成兩叉狀，每叉又分成多個小葉；第7 對鰓較小，通常被第6 對鰓覆蓋，也有2 葉，但腹葉不分叉，僅分成2 ～ 3 個裂葉。尾絲3 根，中尾絲長于另兩根尾絲；尾絲棕褐色，其上具密集細(xì)毛。

經(jīng)形態(tài)鑒定發(fā)現(xiàn)從淳安縣采集的中華越南蜉與桐廬縣采集的中華越南蜉一致，而從慶元縣和泰順縣采集的越南蜉樣本在稚蟲期可通過以下特征與從淳安縣和桐廬縣采集的中華越南蜉區(qū)分：①口器的上、下顎切齒尖端更為細(xì)長；②頭部兩個大而直的角狀突起夾角較中華越南蜉的?。虎弁裙?jié)相對較寬，尤其是中后足的腿節(jié)。其中細(xì)長尖銳的上顎外切齒和下顎頂端為鑒別慶元縣和泰順縣采集的越南蜉樣本重要形態(tài)特征。從慶元縣和泰順縣采集的越南蜉樣本跟其他越南蜉物種可以用下顎須從基部到頂端的長度比明顯區(qū)分開，如車八嶺越南蜉V.chebalingensis和V.nanensis下顎須從基部到頂端的長度比為1.0∶1.3∶1.0；V.maculosa下顎須從基部到頂端的長度比為1.3∶1.2∶1；韓氏越南蜉V.thani下顎須基部節(jié)與第二節(jié)幾乎等長。而裝飾越南蜉V.ornata因至今未有稚蟲報道，無法從形態(tài)特征進(jìn)行區(qū)別，但可以從遺傳距離進(jìn)行區(qū)別。

2.2 遺傳距離

從淳安縣采集的中華越南蜉與從桐廬縣采集的中華越南蜉的遺傳距離為0.002，兩者與NCBI 數(shù)據(jù)庫的中華越南蜉（HM067837）的COI基因遺傳距離分別為0.042 和0.044，小于昆蟲物種種間差異范圍[37]；而從慶元縣和泰順縣采集的越南蜉樣本的COI基因與NCBI 數(shù)據(jù)庫的中華越南蜉（HM067837）的COI基因遺傳距離分別為0.097 和0.099，達(dá)到種上水平。Williams 等利用COI基因發(fā)現(xiàn)不同地理種群的Baetisrhodani遺傳距離達(dá)0.08～ 0.19，推測部分遺傳距離大于0.08 的種群存在隱存種[38]。本研究中從慶元縣（QY）和泰順縣（TS）采集的越南蜉樣本的COI基因與越南蜉屬已知物種的遺傳距離達(dá)0.097 ～ 0.220，大于昆蟲物種種間遺傳距離，支持其為新種，命名為百山祖越南蜉Vietnamellabaishanzuensissp. nov. Zhang, Huang, and Zhang, 2023。

表1 基于K2P 模型的越南蜉屬物種間的遺傳距離Tab. 1 Genetic distance between Vietnamella species based on K2P model

2.3 系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系

基于越南蜉屬8 種18 條線粒體COI基因所構(gòu)建的NJ 系統(tǒng)樹（圖2），結(jié)果支持新種百山祖越南蜉與中華越南蜉互為姐妹群關(guān)系，該（百山祖越南蜉+中華越南蜉）支系再與（韓氏越南蜉蝣V.thani+V.nanensis）支系形成姐妹支系；而裝飾越南蜉V.ornata與藍(lán)紋越南蜉V.maculosa形成姐妹群關(guān)系。Vietnamellasp. B 為所有已知越南蜉屬物種的基部，該結(jié)果與Luo 等的結(jié)果一致[8-9]。但其他蜉蝣屬物種的相互關(guān)系存在差異，有待進(jìn)一步研究。本研究中雖然百山祖越南蜉與中華越南蜉形成姐妹群關(guān)系，但根據(jù)其遺傳距離差異，以及形態(tài)特征差異，均支持百山祖越南蜉為新種。

圖2 基于線粒體COI 基因構(gòu)建的NJ 系統(tǒng)發(fā)生樹（粗體為新種百山祖越南蜉）Fig. 2 NJ phylogenetic tree constructed based on mitochondrial COI gene (bold words mean new species, V. baishanzuensis sp. nov.)

2.4 詞源學(xué)

結(jié)合形態(tài)特征和分子數(shù)據(jù)，我們認(rèn)為從慶元百山祖和泰順大溪源采集的越南蜉樣本為新種，以正模模式標(biāo)本采集地百山祖國家級自然保護(hù)區(qū)為種名詞源，定名為百山祖越南蜉Vietnamellabaishanzuensissp. nov. Zhang, Huang and Zhang, 2023。

2.5 模式標(biāo)本

正模1♀：浙江省慶元縣百山祖國家級自然保護(hù)區(qū)，2019—07—02，章書聲。副模：3♂♂，11♀♀，浙江省慶元縣百山祖自然保護(hù)區(qū)，2019—07—02，章書聲；2♂♂，5♀♀，浙江省泰順縣大溪源省級保護(hù)區(qū)，2022—07—22，張立華，章書聲；3♀♀，浙江省泰順縣烏巖嶺國家級自然保護(hù)區(qū)，2022—07—25，章書聲。所有模式標(biāo)本保存在浙江師范大學(xué)昆蟲標(biāo)本館。

3 結(jié)論

綜上所述，在越南蜉隱存種探討中，通過形態(tài)和分子數(shù)據(jù)研究發(fā)現(xiàn)從淳安縣和桐廬縣采集的越南蜉與模式產(chǎn)地中華越南蜉為同一個種，而從慶元縣百山祖和泰順縣大溪源采集的越南蜉為新種，詞源學(xué)以正模模式標(biāo)本采集地慶元百山祖為詞源命名，定名為百山祖越南蜉。