侯園園,王 飛,江連強(qiáng),徐蓬軍,任廣偉 ,王李芳*,王秀芳

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所,山東 青島 266101; 2.四川省煙草公司瀘州市公司,四川 瀘州 646000;3.四川省煙草公司涼山州公司,四川 西昌 615000)

涼山州位于四川省西南部,屬于亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū),地貌復(fù)雜,土壤肥力中等,是我國重要的煙草種植區(qū),涼山煙區(qū)占全省煙草的60%以上,冕寧縣是涼山重要的煙葉產(chǎn)區(qū)之一[1-3]。有研究通過空間掃描算法檢測(cè)到四川涼山煙區(qū)為煙草病蟲害高發(fā)區(qū)[4],而通過節(jié)肢動(dòng)物調(diào)查,弄清農(nóng)田的生物群落結(jié)構(gòu),使害蟲的預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)更加準(zhǔn)確,有助于實(shí)施煙草病蟲害的綠色防控[5]。劉旭等[6]對(duì)四川省大田生長期煙草害蟲種類進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn),煙田有昆蟲綱7目、25科、70種及軟體動(dòng)物門腹足綱1目、3科、5種。目前對(duì)四川冕寧煙區(qū)節(jié)肢動(dòng)物的調(diào)查主要針對(duì)半翅目害蟲煙蚜(Myzuspersicae),對(duì)節(jié)肢動(dòng)物種群動(dòng)態(tài)的報(bào)道較少[7-8]。

隨著分子生物學(xué)研究的深入,應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)鑒定昆蟲物種,擺脫了蟲態(tài)的限制,能夠在分子生物學(xué)水平上獲得精確的物種信息,該技術(shù)對(duì)傳統(tǒng)昆蟲形態(tài)學(xué)的鑒定起到了合理的補(bǔ)充。其中,DNA條形碼技術(shù)(DNA barcoding)被認(rèn)為是最簡單、迅速、精確的方法,目前該技術(shù)在實(shí)蠅鑒定、姬小蜂科物種鑒定、蚜蟲快速鑒定、鱗翅目害蟲鑒定等方面也多有報(bào)道[9-13]。DNA條形碼在世界范圍內(nèi)已經(jīng)廣泛用于生物物種鑒定,并逐漸成為一種有效的通用分類手段[14-16]。

研究主要通過目測(cè)法和掃網(wǎng)法[17]對(duì)四川涼山冕寧煙區(qū)的節(jié)肢動(dòng)物種群進(jìn)行普查,并利用DNA條形碼技術(shù)對(duì)采集到的樣品進(jìn)行鑒定,為四川冕寧煙田害蟲的預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)、為煙田天敵的保護(hù)利用和煙田綜合管理系統(tǒng)的建立提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 調(diào)查地?zé)熖锘厩闆r

試驗(yàn)在四川省涼山市冕寧煙區(qū)進(jìn)行,試驗(yàn)田位于28°33′14″N,102°10′26″E,海拔1804m,屬于亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū),雨熱同期,土壤肥力中等,主栽品種為“云煙87”。

1.2 調(diào)查方法

調(diào)查時(shí)間于2020年7月,共設(shè)4個(gè)調(diào)查取樣點(diǎn),取樣點(diǎn)隨機(jī)區(qū)組排列,且每個(gè)小區(qū)面積不小于667m2,每個(gè)小區(qū)按5點(diǎn)法定點(diǎn)調(diào)查,每點(diǎn)10株。

1.2.1 目測(cè)法 每個(gè)小區(qū)共調(diào)查50株煙株,采取整體目測(cè)法,調(diào)查時(shí)先觀察煙株葉片上的節(jié)肢動(dòng)物,再全株調(diào)查,包括逐個(gè)剝開煙草的花、翻開葉片查看莖稈,同時(shí)對(duì)點(diǎn)內(nèi)雜草上的節(jié)肢動(dòng)物的種類和數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.2.2 掃網(wǎng)法 捕蟲網(wǎng)規(guī)格為網(wǎng)口直徑30cm,網(wǎng)深35cm,桿長60cm。對(duì)煙株和煙株周圍的雜草進(jìn)行掃網(wǎng),每次調(diào)查掃網(wǎng)50次(揮網(wǎng)一個(gè)來回為掃網(wǎng)1次),將采集到的節(jié)肢動(dòng)物放于密封袋中或分別放入裝有75%酒精的50mL離心管中,編號(hào)帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.3 節(jié)肢動(dòng)物的分類

將采集到的節(jié)肢動(dòng)物標(biāo)本,在顯微鏡下進(jìn)行分類鑒定,記錄下節(jié)肢動(dòng)物的種類和數(shù)量,對(duì)于無法鑒定的樣本,進(jìn)行編號(hào)記錄[5],輔以分子鑒定。

1.4 節(jié)肢動(dòng)物的分子鑒定

1.4.1 基因組總DNA的提取 將采集的樣本用蒸餾水沖洗,放于濾紙上晾干后,使用天根細(xì)胞組織DNA提取試劑盒提取DNA,將提取的合格DNA樣品放于4°C備用。

1.4.2 PCR擴(kuò)增 使用Hebert等設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增線粒體基因組中COI基因的DNA條形碼序列,使用引物(MLepF1/R1)擴(kuò)增采集樣本的特異片段,引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

PCR反應(yīng)的總體積為20μL,2×Taq PCR MasterMix 10 μL,上下游引物各0.5 μL,DNA模板1μL,dd H2O 8 μL。PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性3min;94℃變性1min,50℃退火1min,72℃延伸1min,共35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10min。

將得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行基因片段片段純化和雙向測(cè)序。分別將使用引物(MLepF1/R1)得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 26對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。測(cè)序結(jié)果返回后,使用MEGA 10軟件對(duì)得到的正反向測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接,得到單條準(zhǔn)確序列,采用BOLD數(shù)據(jù)庫中的Identification-animal identification[COI]功能對(duì)每條DNA條形碼序列進(jìn)行比對(duì),檢查鑒定結(jié)果及相似度數(shù)據(jù)。從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載相應(yīng)物種的DNA條形碼序列,使用MEGA 10軟件構(gòu)建Neighbor-Joining樹,以進(jìn)一步確定分子鑒定的結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 涼山冕寧煙田節(jié)肢動(dòng)物普查

經(jīng)過采集和鑒定,涼山冕寧煙田共調(diào)查到節(jié)肢動(dòng)物有2綱8目10科16種,隸屬昆蟲綱(Insecta)和蛛形綱(Arachnida)。其中昆蟲綱6目8科14種(表2),其中鱗翅目(Lepidoptera)夜蛾科害蟲種類最多,包括煙青蟲(Helicoverpaassulta)、甘藍(lán)夜蛾(Mamestrabrassicae)、疆夜蛾(Peridromasaucia)、棉鈴蟲(Helicoverpaarmigera)、小地老虎(Agrotisipsilon)、粘蟲(Mythimnaseparata)和弧金翅夜蛾(Thysanoplusiaorichalcea),鱗翅目害蟲種類豐富,數(shù)量較少,僅占節(jié)肢動(dòng)物總量的0.52%。半翅目害蟲有煙蚜(Myzuspersicae)和煙粉虱(Bemisiatabaci),其中煙蚜種群數(shù)量最高,達(dá)到27.765頭/株。鞘翅目害蟲較少,包括泥紅槽縫叩甲(Agrypnusargillaceus)。天敵害蟲種類多,但數(shù)量低,包括隸屬雙翅目的食蚜蠅科(Syrphidae),隸屬脈翅目的中華通草蛉(ChrysoperlasinicaTjeder),隸屬膜翅目的煙蚜繭蜂(AphidiusgifuensisAshmead)和姬蜂科(Ichneumonidae),煙蚜繭蜂的數(shù)量較多為1.635頭/株(表2)。蛛形綱2目2科2種,隸屬寄螨目和蜘蛛目(表3)。

表2 煙田節(jié)肢動(dòng)物發(fā)生數(shù)量

表3 煙田節(jié)肢動(dòng)物物種組成

2.2 冕寧煙田節(jié)肢動(dòng)物種類鑒定

對(duì)獲得的20個(gè)COI基因序列進(jìn)行編輯、拼接,利用MEGA 10軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果共得到3科8種(表4)。測(cè)序得到長度為636 bp的COI基因序列,將20個(gè)樣本的COI基因序列與BOLD數(shù)據(jù)庫中DNA條形碼序列進(jìn)行比對(duì),結(jié)果顯示,4個(gè)樣本的DNA條形碼序列與甘藍(lán)夜蛾標(biāo)準(zhǔn)序列的相似性均為100%,2個(gè)樣本的DNA條形碼序列與甘藍(lán)夜蛾標(biāo)準(zhǔn)序列的相似性均為99.5%,1個(gè)樣本的DNA條形碼序列與甘藍(lán)夜蛾標(biāo)準(zhǔn)序列的相似性均為99.3%。1個(gè)樣本的DNA條形碼序列與棉鈴蟲標(biāo)準(zhǔn)序列的相似性為100%,1個(gè)樣本的DNA條形碼序列與粘蟲標(biāo)準(zhǔn)序列的相似性為100%,5個(gè)樣本的DNA條形碼序列與疆夜蛾標(biāo)準(zhǔn)序列的相似性均為100%,1個(gè)樣本的DNA條形碼序列與小地老虎標(biāo)準(zhǔn)序列的相似性為100%,1個(gè)樣本的DNA條形碼序列與弧金翅夜蛾標(biāo)準(zhǔn)序列的相似性為100%,3個(gè)樣本的DNA條形碼序列與棉鈴蟲齒唇姬蜂標(biāo)準(zhǔn)序列的相似性為99.53%,1個(gè)樣本的DNA條形碼序列與泥紅槽縫叩甲標(biāo)準(zhǔn)序列的相似性為87.76%。

表4 物種鑒定比對(duì)

使用MAGA-10軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖1),結(jié)果發(fā)現(xiàn),20個(gè)樣本分屬于鱗翅目,膜翅目,鞘翅目3個(gè)目,同一物種以較高的置信度聚為一小支,如疆夜蛾的5條序列以100%的置信度聚在一起。

圖1 物種Neighbor-Joining聚類分析

3 討論

煙田節(jié)肢動(dòng)物群落在煙草旺長期至成熟初期,群落多樣性最高,群落結(jié)構(gòu)最穩(wěn)定[18]。節(jié)肢動(dòng)物群落的研究是煙草生長期有害生物綜合防控的基礎(chǔ),目前,我國在煙田節(jié)肢動(dòng)物方面開展了大量研究工作[19-22]。煙田節(jié)肢動(dòng)物群落以刺吸類害蟲、食葉類害蟲及天敵為主,其中煙田節(jié)肢動(dòng)物包括煙粉虱,煙蚜等優(yōu)勢(shì)種害蟲以及煙蚜繭蜂、蜘蛛類等優(yōu)勢(shì)天敵[23-24]。研究主要對(duì)7月份四川冕寧煙區(qū)的節(jié)肢動(dòng)物種類和數(shù)量進(jìn)行調(diào)查,對(duì)冕寧煙區(qū)節(jié)肢動(dòng)物調(diào)查的不足部分進(jìn)行補(bǔ)充。通過對(duì)四川冕寧地區(qū)節(jié)肢動(dòng)物進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn),冕寧煙田共有2綱8目10科16種(昆蟲綱6目8科14種,蛛形綱2目2科2種)。煙田害蟲8種,其中半翅目發(fā)生情況最重,包括煙蚜和煙粉虱,煙蚜的發(fā)生量遠(yuǎn)高于煙粉虱,可能是由于在煙田煙蚜的種間競(jìng)爭優(yōu)勢(shì)更大。其他害蟲零星發(fā)生但也不能忽視,以避免次要害蟲上升為主要害蟲。煙田害蟲天敵6種,寄生性天敵以煙蚜繭蜂為主,煙蚜繭蜂在田間對(duì)煙蚜的寄生率一般在20%～60%,寄生率最高達(dá)90%左右,是煙蚜的一種優(yōu)勢(shì)寄生性天敵[25],該天敵目前已在我國煙區(qū)大面積推廣應(yīng)用。明確冕寧煙區(qū)節(jié)肢動(dòng)物種類,尤其是害蟲和天敵的種類和數(shù)量,不僅能對(duì)煙田害蟲的綠色防控提供指導(dǎo),同時(shí)為煙蚜繭蜂在冕寧煙田的推廣提供理論基礎(chǔ)。

掌握煙田節(jié)肢動(dòng)物組成是開展煙田綠色防控的重要前提[26-27]。本試驗(yàn)使用DNA條形碼技術(shù)初步鑒定出煙田節(jié)肢動(dòng)物16種,該技術(shù)應(yīng)用范圍廣泛,使用一對(duì)通用引物便可以滿足物種鑒定的需要,操作流程簡單,可有效識(shí)別大量物種。然而,DNA條形碼技術(shù)不能完全取代形態(tài)學(xué)分類,因此,在試驗(yàn)過程中將二者進(jìn)行結(jié)合,以提高調(diào)查結(jié)果的科學(xué)性和準(zhǔn)確性。通過普查和DNA條形碼技術(shù)明確冕寧煙區(qū)的主要害蟲及天敵,對(duì)今后煙田綠色防控及天敵昆蟲在煙田的推廣具有重要的指導(dǎo)意義。但試驗(yàn)仍存在不足之處,本試驗(yàn)采取定點(diǎn)定株的方法對(duì)四川冕寧地區(qū)的節(jié)肢動(dòng)物群落進(jìn)行調(diào)查,主要針對(duì)移動(dòng)性弱、對(duì)寄主依附性強(qiáng)的類群,存在采集到的類群少于其他方法的弊端[5]。且調(diào)查時(shí)間短,不能全面反應(yīng)冕寧煙田節(jié)肢動(dòng)物發(fā)生情況,今后可進(jìn)行多年、多點(diǎn)和更加全面的調(diào)查。