中國(guó)初級(jí)衛(wèi)生保健基金會(huì)腫瘤精準(zhǔn)診療專業(yè)委員會(huì) 中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)腫瘤精準(zhǔn)治療專業(yè)委員會(huì)中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)腫瘤病理專委會(huì)肺癌學(xué)組

肺癌在我國(guó)發(fā)病率和死亡率均位居第一[1]。近十年，靶向治療極大改善了非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）患者的預(yù)后。除了表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）、V-raf鼠肉瘤病毒癌基因同源體B（vrafmurine sarcoma viral oncegene homolog B,BRAF）等基因突變類型，在NSCLC中針對(duì)間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase,ALK）、c-ros肉瘤致癌因子-受體酪氨酸激酶（ROSproto-oncogene 1,receptor tyrosine kinase,ROS1）、轉(zhuǎn)染時(shí)重排（rearranged during transfection,RET）等融合基因的靶向藥物也陸續(xù)在國(guó)內(nèi)外獲批上市并應(yīng)用于臨床，為患者帶來(lái)了更多的治療機(jī)會(huì)，顯著改善了攜帶融合基因變異患者的生存質(zhì)量和預(yù)后。因此，融合基因檢測(cè)越來(lái)越受到關(guān)注。脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid, DNA）、核糖核酸（ribonucleic acid, RNA）和蛋白表達(dá)檢測(cè)是判斷基因融合的主要檢測(cè)方法。目前，融合基因的金標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法為基于DNA水平的熒光原位雜交（fluorescencein situhybridization, FISH）檢測(cè)，然而由于NSCLC有眾多的驅(qū)動(dòng)基因和多樣的變異形式，因此具有高通量?jī)?yōu)勢(shì)的第二代測(cè)序技術(shù)（next-generation sequencing, NGS）也廣泛應(yīng)用于NSCLC融合基因檢測(cè)。相比于基于DNA水平的二代測(cè)序（DNA-based NGS）檢測(cè)，美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（National Comprehensive Cancer Network, NCCN）公布的NSCLC臨床實(shí)踐指南（2023年第5版）已提出基于RNA水平的NGS（RNA-based NGS）檢測(cè)可能會(huì)提高ROS1、RET、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體絡(luò)氨酸激酶（neurotrophin receptor kinase,NTRK）基因融合和間質(zhì)-上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化因子（mesenchymal-epithelial transition factor,MET）基因14號(hào)外顯子跳躍突變（MET14跳突）的檢出率。該指南同時(shí)指出，對(duì)于在廣泛組合的檢測(cè)中未發(fā)現(xiàn)驅(qū)動(dòng)基因的患者（尤其是非吸煙者）考慮采用RNA-based NGS檢測(cè)，以最大程度地發(fā)現(xiàn)融合基因突變。此外，多項(xiàng)前瞻性研究[2-4]均應(yīng)用了RNA-based NGS技術(shù)作為融合基因的檢測(cè)方法。例如，PROFILE 1001 I期研究和VISION II期研究均應(yīng)用了RNA-based NGS檢測(cè)NSCLC中ROS1基因融合和MET14跳突。關(guān)于ALK、RET、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1（neuregulin-1,NRG1）和NTRK融合基因的多項(xiàng)回顧性研究也應(yīng)用了RNA-based NGS檢測(cè)[5-11]。目前NSCLC可用藥的變異形式主要包括基因突變和基因融合，RNA-based NGS檢測(cè)基因融合應(yīng)整合到DNA-based NGS檢測(cè)基因突變中，以提高基因融合的檢出率。目前，一次性取樣并通過(guò)DNA-based NGS和RNA-based NGS同時(shí)檢測(cè)的技術(shù)已研發(fā)成功并開始應(yīng)用于臨床實(shí)踐。雖然在近幾年內(nèi)RNA-based NGS已被報(bào)道可用于NSCLC的融合基因檢測(cè)，但我國(guó)RNA-based NGS檢測(cè)融合基因的應(yīng)用時(shí)機(jī)、應(yīng)用場(chǎng)景和質(zhì)控尚無(wú)行業(yè)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)、相關(guān)規(guī)范和共識(shí)。因此，本共識(shí)對(duì)RNAbased NGS檢測(cè)融合基因的應(yīng)用時(shí)機(jī)、應(yīng)用場(chǎng)景和質(zhì)控進(jìn)行了詳盡闡述，同時(shí)提出RNA-based NGS質(zhì)控和應(yīng)用尚存問題和研究建議，幫助臨床明確應(yīng)用RNA-based NGS檢測(cè)融合基因的實(shí)踐意義，以期指導(dǎo)臨床進(jìn)行規(guī)范準(zhǔn)確的RNA-based NGS檢測(cè)，使攜帶融合基因變異的NSCLC患者最大化獲益。

1 NSCLC的主要融合基因類型

基因融合是通過(guò)染色體反轉(zhuǎn)（c h r o m o s o m a l inversion）、串聯(lián)復(fù)制（tandem duplication）、缺失（deletion）或易位（translocation），合并不同的、獨(dú)立的基因或基因片段的過(guò)程，即由于某種機(jī)制（如染色體結(jié)構(gòu)重排引起基因組變異）造成兩個(gè)或多個(gè)不同基因的部分序列或全部序列（編碼區(qū)）首尾相連，置于同一套調(diào)控序列（包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、核糖體結(jié)合序列、終止子等）控制之下，構(gòu)成一個(gè)新的嵌合基因[12,13]?；蛉诤吓c各種疾病，尤其與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[13]。融合基因常見于血液腫瘤和實(shí)體瘤中，實(shí)體瘤的呼吸系統(tǒng)腫瘤和乳腺腫瘤中融合基因出現(xiàn)數(shù)量相對(duì)更多[14]。在NSCLC中，常見的驅(qū)動(dòng)融合基因包括ALK、ROS1、RET、NTRK和NRG1等[15,16]。此外，有研究[17,18]證實(shí)EGFR、BRAF、MET等常見的點(diǎn)突變驅(qū)動(dòng)基因也會(huì)發(fā)生基因融合變異。值得注意的是，MET14跳突從RNA水平上表現(xiàn)為13號(hào)外顯子和15號(hào)外顯子發(fā)生融合，導(dǎo)致MET蛋白泛素化降解受抑制[19]。因此，在本共識(shí)中將MET14跳突也納入融合基因討論范圍?？傮w而言，10%-15%的NSCLC患者攜帶基因融合變異[20]。

2 融合基因常用檢測(cè)方法

目前臨床常用融合基因檢測(cè)方法包括免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry, IHC）、FISH、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction, RTPCR）和NGS[21]，近年來(lái)，單細(xì)胞基因融合檢測(cè)技術(shù)和nCounter技術(shù)也出現(xiàn)在融合基因檢測(cè)相關(guān)研究中[22,23]。

2.1 IHC、FISH和RT-PCR IHC通過(guò)特異性單克隆抗體檢測(cè)融合蛋白表達(dá)情況，具有耗時(shí)短、成本低、自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)，可作為一些融合基因的伴隨診斷（如：ALK融合，D5F3克隆，Ventana平臺(tái)檢測(cè)）或篩查手段（如：ROS1融合和NTRK融合）。但在缺乏特異性強(qiáng)的檢測(cè)抗體時(shí)，IHC的假陽(yáng)性率和假陰性率均較高（如RET融合）[24,25]。針對(duì)篩查目的進(jìn)行的IHC檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果，需進(jìn)一步使用其他分子檢測(cè)手段進(jìn)行驗(yàn)證。FISH通過(guò)熒光標(biāo)記的DNA探針來(lái)鑒別目標(biāo)核苷酸序列，可檢測(cè)拷貝數(shù)擴(kuò)增和染色體結(jié)構(gòu)改變（例如基因重排），其結(jié)果具有一定的可靠性及穩(wěn)定性，對(duì)于驅(qū)動(dòng)融合伴侶未明確的融合形式也可檢出，目前是檢測(cè)融合基因的重要手段，如ALK斷裂探針（break-apart）被認(rèn)為是ALK融合檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)。然而，F(xiàn)ISH技術(shù)也存在一定的局限性。例如，某些罕見或未知的斷裂與融合位點(diǎn)間距可能小于FISH可判讀的最小閾值，從而導(dǎo)致假陰性的產(chǎn)生。此外，檢測(cè)結(jié)果為復(fù)雜的信號(hào)模式的判讀對(duì)于診斷醫(yī)師的經(jīng)驗(yàn)依賴性很高[23]。RT-PCR檢測(cè)基因融合時(shí)可明確融合伴侶，具有較高的靈敏度和特異性，然而RT-PCR僅能檢出已知融合形式[14,26]。因此，以上融合基因檢測(cè)方法既有其各自優(yōu)勢(shì)，也存在一定的局限性。

2.2 NGS NSCLC融合基因數(shù)目較多，因此可以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)基因融合變異的NGS也是一種被普遍應(yīng)用的檢測(cè)手段。同時(shí)，當(dāng)FISH和IHC判讀融合基因結(jié)果不一致時(shí)，NGS是一種有效的替代方案。例如，F(xiàn)rampton等[27]及Smuk等[28]報(bào)道了NGS方法作為克服FISH檢測(cè)的挑戰(zhàn)性的有效手段。通過(guò)FISH檢測(cè)的59例ALK基因融合樣本中出現(xiàn)了5%的非典型減弱孤立3’信號(hào)。為了明確這類患者從靶向藥物潛在獲益的可能性，對(duì)這些樣本同時(shí)進(jìn)行了NGS檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NGS證實(shí)了ALK融合的存在。此外，NGS可檢出已知和未知的融合基因類型，彌補(bǔ)常規(guī)檢測(cè)方法通常無(wú)法檢測(cè)或無(wú)法明確融合伴侶基因的缺陷。NGS不僅可以識(shí)別特定的靶向變異，還可識(shí)別共存的其他基因變異，如TP53突變可能會(huì)減弱ALK融合的NSCLC的靶向治療療效[27,29]。

NGS檢測(cè)對(duì)象為DNA和RNA。根據(jù)中心法則，以DNA為模板通過(guò)轉(zhuǎn)錄和剪接加工產(chǎn)生成熟的RNA[30]。在DNA水平上，融合斷點(diǎn)位置通常發(fā)生在較長(zhǎng)的內(nèi)含子區(qū)域，且融合斷點(diǎn)在不同患者中具有多樣性，采用NGS的方法設(shè)計(jì)探針去抓取斷裂點(diǎn)是一種可行的檢測(cè)方法。然而，從DNA水平檢測(cè)融合基因不可避免存在如下局限性和挑戰(zhàn)：（1）融合基因檢測(cè)要全面覆蓋非常冗長(zhǎng)且含有大量重復(fù)序列的內(nèi)含子區(qū)域，才能準(zhǔn)確地找到融合斷裂點(diǎn)；（2）內(nèi)含子區(qū)域GC含量變化不利于探針均勻有效地捕獲目標(biāo)區(qū)域片段；（3）不同基因的內(nèi)含子含有非常相似的重復(fù)序列，這一特征不利于序列準(zhǔn)確對(duì)比，影響檢測(cè)準(zhǔn)確性；（4）復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后的剪接加工過(guò)程，可能會(huì)影響融合基因檢出[31]。RNA-based NGS則有望彌補(bǔ)這一不足，用于RNA-based NGS檢測(cè)的探針僅覆蓋外顯子，探針設(shè)計(jì)難度較DNA更低，可檢出轉(zhuǎn)錄水平剪切形成的基因融合變異。對(duì)于DNA-based NGS未檢出融合基因的情況下，RNA-based NGS能夠提高融合基因的檢出率[32,33]。RNA-based NGS檢測(cè)的樣本多是基于福爾馬林固定的石蠟包埋（formalin-fixed paraffinembedded, FFPE）組織樣本，長(zhǎng)時(shí)間保存樣本帶來(lái)的RNA降解成為臨床目前關(guān)心的問題之一[34]。NGS文庫(kù)構(gòu)建流程包括擴(kuò)增子法和雜交捕獲法等。與雜交捕獲法相比，擴(kuò)增子法對(duì)核酸模板的投入量要求更低，建庫(kù)時(shí)間更短，從一定程度上可減少因RNA降解導(dǎo)致的對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響[35-37]。

3 融合基因檢測(cè)適用的樣本類型

NSCLC腫瘤組織檢測(cè)（包括細(xì)胞蠟塊）和液體活檢是融合基因檢測(cè)的兩種樣本類型。腫瘤組織檢測(cè)樣本包括穿刺組織、手術(shù)組織、氣管鏡活檢組織、超聲支氣管鏡（endobronchial ultrasound, EBUS）活檢組織、支氣管刷檢組織、胸腔積液沉渣、腹腔積液沉渣、腦脊液沉渣和肺泡灌洗液沉渣等。液體活檢樣本包括外周血上清、胸腔積液上清、腹腔積液上清、腦脊液上清和肺泡灌洗液上清等。FISH、IHC這類傳統(tǒng)檢測(cè)方法采用腫瘤組織檢測(cè)，NGS采用腫瘤組織檢測(cè)和液體活檢檢測(cè)。目前，大多數(shù)RNA-based NGS檢測(cè)融合基因的研究采用組織檢測(cè)，僅有少數(shù)RNA-based NGS檢測(cè)融合基因的研究采用液體活檢進(jìn)行檢測(cè)[32]。有學(xué)者[38]認(rèn)為基于循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA, ctDNA）的NGS融合基因檢測(cè)敏感性低于腫瘤組織檢測(cè)。因此，NSCLC融合基因檢測(cè)，首選肺癌腫瘤組織，ctDNA檢測(cè)可作為組織樣本不可及情況下的替代選擇，但目前還缺乏相應(yīng)的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范[39]。

4 基于RNA-based NGS檢測(cè)融合基因的專家共識(shí)

本共識(shí)基于文獻(xiàn)數(shù)據(jù)并結(jié)合我國(guó)國(guó)情與分子檢測(cè)需求，共總結(jié)6條檢測(cè)相關(guān)意見要點(diǎn)，參與共識(shí)的臨床病理專家通過(guò)共識(shí)線上會(huì)議或郵件形式對(duì)每條共識(shí)進(jìn)行“非常同意”“基本同意”或“不同意”的投票。超過(guò)2/3以上專家組投票，計(jì)為有效投票，最終形成推薦意見和推薦等級(jí)。本共識(shí)分為“強(qiáng)烈推薦”“推薦”和“未達(dá)成共識(shí)”。共識(shí)專家組投“非常同意”的票數(shù)超過(guò)2/3的意見為“強(qiáng)烈推薦”，專家組投“非常同意”+“基本同意”的票數(shù)超過(guò)2/3的意見為“推薦”，否則不達(dá)成共識(shí)。投票參考推薦分級(jí)的評(píng)估、制定和評(píng)價(jià)（Grade of Recommendations Assessment,Development and Evaluation, GRADE）方法。

共識(shí)一：相比DNA-based NGS，RNA-based NGS不受內(nèi)含子影響，可提升融合基因的檢出率。建議有條件的醫(yī)療機(jī)構(gòu)對(duì)NSCLC樣本進(jìn)行一次性同步RNA-based NGS與DNA-based NGS的驅(qū)動(dòng)基因變異（融合/突變）檢測(cè)?！緩?qiáng)烈推薦】

在DNA-based NGS未檢出融合基因變異的NSCLC患者中，RNA-based NGS可能檢出更多融合基因變異。一項(xiàng)真實(shí)世界肺腺癌大隊(duì)列研究[40]發(fā)現(xiàn)，在DNA-based NGS檢測(cè)為驅(qū)動(dòng)基因變異陰性的232例患者中，經(jīng)RNA-based NGS可檢測(cè)到更多融合基因變異（14.2%, 33/232），其中10例患者接受對(duì)應(yīng)靶向治療，8例患者實(shí)現(xiàn)臨床獲益。這一現(xiàn)象在Beaubier等[41]及Zacharias等[42]公布的研究中同樣存在。在中國(guó)研究者公布的數(shù)據(jù)[43]中，140例基于DNAbased NGS檢測(cè)的驅(qū)動(dòng)基因陰性患者通過(guò)RNA-based NGS多檢出了14例（10%）攜帶可用藥融合變異。

相比DNA水平，RNA水平上融合基因表現(xiàn)為前后兩個(gè)基因外顯子之間的銜接，不受內(nèi)含子的影響，融合點(diǎn)相對(duì)固定，這一特征為精準(zhǔn)設(shè)計(jì)探針或引物提供了先天優(yōu)勢(shì)，也是RNA-based NGS比DNA-based NGS檢測(cè)融合基因更具優(yōu)勢(shì)的原因之一。Benayed等[40]認(rèn)為即使在大型雜交捕獲面板中，由于內(nèi)含子的長(zhǎng)度和目標(biāo)區(qū)域內(nèi)的盲點(diǎn)，并非所有的融合均能被識(shí)別。Seo等[44]發(fā)現(xiàn)融合基因的RNA表達(dá)量都顯著上調(diào)，其原因在于融合伴侶在自身發(fā)生轉(zhuǎn)錄的同時(shí)，其下游激酶區(qū)域同時(shí)發(fā)生了轉(zhuǎn)錄，使得激酶區(qū)域轉(zhuǎn)錄被激活產(chǎn)生了大量的mRNA，因此通過(guò)RNA檢測(cè)可更容易識(shí)別到基因融合。由此可見，通過(guò)RNA-based NGS檢測(cè)融合基因無(wú)需考慮內(nèi)含子影響，且有概率更準(zhǔn)確地檢出融合基因。

隨著NGS技術(shù)的不斷進(jìn)步，越來(lái)越多的罕見融合變異形式被發(fā)現(xiàn)[45-47]。然而，罕見融合變異的功能及臨床意義仍然存在一定爭(zhēng)議。RNA-based NGS可驗(yàn)證DNAbased NGS檢測(cè)的罕見融合變異形式。例如，Ding等[48]的研究中發(fā)現(xiàn)了1例經(jīng)DNA-based NGS檢測(cè)的患者攜帶ALK基因罕見融合變異形式（LANCL1-ALK, L7:A20），經(jīng)RNA-based NGS驗(yàn)證后確定為類棘皮細(xì)胞微管相關(guān)蛋白4-ALK（echinoderm microtubule-associated protein-like 4-ALK,

EML4-ALK）（E13:A20）轉(zhuǎn)錄本。另一項(xiàng)研究[49]同樣發(fā)現(xiàn)了相似現(xiàn)象，研究者采用DNA-based NGS鑒定了14例ALK基因復(fù)雜融合形式的NSCLC患者，對(duì)保留足夠標(biāo)本的13例患者加測(cè)了RNA-based NGS檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)融合基因和斷點(diǎn)位置在DNA和RNA測(cè)序之間存在明顯差異，所有受檢者實(shí)際上都表達(dá)了經(jīng)典的EML4-ALK融合轉(zhuǎn)錄本。此外，也有案例報(bào)道[50]提示對(duì)于DNA水平發(fā)現(xiàn)罕見或復(fù)雜融合形式的ALK融合患者，需盡早加測(cè)RNA-based NGS以驗(yàn)證其功能。該現(xiàn)象在RET基因融合變異中也有相關(guān)報(bào)道。例如：一項(xiàng)回顧性研究[8]對(duì)44例攜帶非經(jīng)典RET融合（除KIF5B-RET和CCDC6-RET之外的RET融合都被歸類為非經(jīng)典RET融合）的配對(duì)DNA-based NGS和RNA-based NGS測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)44例樣本中有41例在RNA水平上檢出了RET融合（93.2%）。其中，68%（28/41）為經(jīng)典的KIF5B-RET融合，12%（5/41）為經(jīng)典的CCDC6-RET融合，20%（8/41）為其他非經(jīng)典融合，這表明在DNA層面檢出的大部分非經(jīng)典RET重排在RNA層面實(shí)質(zhì)為經(jīng)典RET融合（80.5%, 33/41）。在另一項(xiàng)研究[7]中，12例經(jīng)DNA-based NGS檢測(cè)出RET非經(jīng)典融合的患者中均檢測(cè)到了RET融合轉(zhuǎn)錄，但僅有5例患者的融合伴侶和外顯子斷裂點(diǎn)結(jié)果與RNA-based NGS結(jié)果一致；在另外20例DNA-based NGS檢測(cè)出RET非經(jīng)典融合的患者中，通過(guò)RNA-based NGS均沒有檢測(cè)到RET融合轉(zhuǎn)錄。因此，對(duì)于ALK和RET融合基因的罕見融合變異形式，可通過(guò)RNAbased NGS驗(yàn)證其融合功能。

NSCLC的靶向用藥檢測(cè)主要包括基因點(diǎn)突變、插入缺失突變和基因融合。臨床實(shí)踐中，利用基于DNA的檢測(cè)技術(shù)（NGS或PCR）完成一次性檢測(cè)較為普遍，而實(shí)際基于RNA的檢測(cè)技術(shù)對(duì)融合基因檢出更具優(yōu)勢(shì)。目前在技術(shù)層面上，使用RNA-based NGS和DNA-based NGS在一個(gè)面板中進(jìn)行檢測(cè)已可實(shí)現(xiàn)。具體而言，先對(duì)一份腫瘤組織樣本同時(shí)進(jìn)行RNA和DNA提取，隨后將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以一定比例與DNA樣本混合，加入定制引物后形成混合體系。通過(guò)擴(kuò)增子建庫(kù)法將混合模板進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，文庫(kù)產(chǎn)物上機(jī)測(cè)序后即可同時(shí)進(jìn)行點(diǎn)突變、插入缺失和融合突變的分析。 使用上述方法，DNA和RNA一次性同時(shí)檢測(cè)并不對(duì)樣本數(shù)量和檢測(cè)成本有更高要求，目前該技術(shù)已應(yīng)用于臨床[51,52]?？紤]到晚期肺癌患者腫瘤組織獲取有限、治療的及時(shí)性以及檢測(cè)的經(jīng)濟(jì)性，建議有條件的醫(yī)療機(jī)構(gòu)對(duì)NSCLC組織的一份樣本一次性利用DNA-based NGS檢測(cè)點(diǎn)突變或插入缺失突變，同步利用RNA-based NGS檢測(cè)基因融合變異。

共識(shí)二： 目前RNA-based NGS可用于檢測(cè)ALK、RET、ROS1、NTRK、NRG1和MET等驅(qū)動(dòng)基因融合?！緩?qiáng)烈推薦】

NSCLC國(guó)內(nèi)外診療指南一致推薦檢測(cè)的融合基因包括ALK、ROS1、RET和NTRK。因此，NSCLC中RNAbased NGS檢測(cè)基因融合應(yīng)至少涵蓋上述基因。一些針對(duì)新興靶點(diǎn)NRG1融合的抗體藥物Zenocutuzumab也在開展臨床試驗(yàn)，目前已在攜帶該靶點(diǎn)的胰腺癌和NSCLC患者中展現(xiàn)出來(lái)良好的療效[53-55]。對(duì)于罕見融合靶點(diǎn)（如EGFR、MET、FGFR和BARF），有病例報(bào)道發(fā)現(xiàn)NSCLC患者可從相應(yīng)靶向藥物中獲益，一些相關(guān)臨床研究[56-65]也正在開展。此外，MET14跳突是由于RNA剪接異常而造成MET基因14號(hào)外顯子丟失，在DNA層面的突變具有區(qū)域復(fù)雜多樣性，存在功能解讀困難。內(nèi)含子區(qū)域突變和在轉(zhuǎn)錄剪接水平發(fā)生的外顯子融合可能導(dǎo)致DNA-based NGS出現(xiàn)MET14跳突的漏檢現(xiàn)象[66-68]。NCCN指南中也明確提出RNA-based NGS可提高M(jìn)ET14跳突的檢出率。因此在條件允許時(shí)，可考慮采用同時(shí)涵蓋ALK、RET、ROS1、NTRK、NRG1融合和MET14跳突的RNA-based NGS產(chǎn)品進(jìn)行多靶點(diǎn)聯(lián)合共檢。

共識(shí)三：由RNA-based NGS檢測(cè)的融合基因可指導(dǎo)NSCLC融合變異相關(guān)的靶向治療。【強(qiáng)烈推薦】

由RNA-based NGS檢測(cè)的融合基因可以指導(dǎo)融合基因變異相關(guān)的靶向治療。一項(xiàng)發(fā)表在Lung Cancer上的研究[69]結(jié)果顯示，由RNA-based NGS檢測(cè)ALK融合基因的患者接受克唑替尼治療的中位無(wú)進(jìn)展生存期（progressionfree survival, PFS）顯著優(yōu)于ALK融合基因未檢出患者（182天vs20天，P＜0.0001），中位持續(xù)治療時(shí)間也顯著長(zhǎng)于ALK融合基因未檢出患者（230天vs20天，P＜0.0001）。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)克唑替尼治療的EML4-ALKV1/V2患者（n=6）比V3a/b變體（n=8）有更優(yōu)的中位PFS（314天vs192天，P=0.1743）和中位持續(xù)治療時(shí)間（510天vs215天，P=0.1080），另一項(xiàng)研究[70]也得到相似結(jié)果。除ALK融合基因外，RNA-based NGS也可指導(dǎo)MET14跳突和其他融合基因相關(guān)藥物的靶向治療。一項(xiàng)利用DNA-based NGS和RNA-based NGS檢測(cè)MET14跳突的I期臨床研究[71]中接受克唑替尼治療患者的整體客觀緩解率為32%，其中基于RNA檢測(cè)患者的客觀緩解率達(dá)到36.4%。此外，針對(duì)ROS1、RET、NRG1和NTRK基因融合的前瞻性臨床研究也將RNA-based NGS作為指導(dǎo)患者入組用藥的診斷標(biāo)準(zhǔn)之一[3,53,72,73]。

基于DNA-based NGS檢測(cè)的驅(qū)動(dòng)基因陰性患者中，RNA-based NGS可以多檢出10%-14.2%可用藥融合變異[40,74]。對(duì)于驅(qū)動(dòng)基因陰性患者的一線治療，目前的中國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)（Chinese Society of Clinical Oncology, CSCO）指南和NCCN指南通常建議選擇免疫單藥或者免疫聯(lián)合治療[75,76]。而現(xiàn)有研究數(shù)據(jù)顯示，NSCLC患者接受一線免疫治療的PFS和總生存期（overall survival, OS）仍劣于一線融合基因相關(guān)的靶向治療。例如，ALEX研究[77]中ALK融合陽(yáng)性的患者一線接受阿來(lái)替尼治療的中位PFS達(dá)34.8個(gè)月，中位OS尚未達(dá)到。另一項(xiàng)針對(duì)ROS1基因融合的研究[3]中，患者接受一線克唑替尼治療的中位PFS為19.3個(gè)月，中位OS達(dá)51.5個(gè)月。而接受一線西米普利單抗聯(lián)合化療的患者中位PFS僅8.3個(gè)月，中位OS為21.9個(gè)月[78]。信迪利單抗聯(lián)合化療作為一線治療的研究數(shù)據(jù)（中位PFS：8.9個(gè)月，中位OS：24.2個(gè)月）同樣不及融合靶向治療[79]。因此，為了降低NSCLC患者錯(cuò)失融合靶向治療機(jī)會(huì)的概率，有必要對(duì)可用藥融合基因進(jìn)行RNA-based NGS檢測(cè)。

融合基因參與轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程并最終表達(dá)出有功能的融合蛋白是導(dǎo)致NSCLC發(fā)生發(fā)展的原因之一，準(zhǔn)確識(shí)別出有功能的融合蛋白是患者治療獲益的關(guān)鍵。對(duì)于DNA水平檢測(cè)融合陽(yáng)性而RNA或蛋白水平檢測(cè)為陰性的患者，靶向藥物治療可能療效不佳，應(yīng)謹(jǐn)慎考慮使用。一項(xiàng)回顧性研究[49]通過(guò)DNA-based NGS鑒定了14例NSCLC患者的ALK基因復(fù)雜融合形式，克唑替尼對(duì)ALK基因復(fù)雜融合形式的療效與ALK基因經(jīng)典融合形式無(wú)明顯差異，經(jīng)RNA-based NGS驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)由DNA-based NGS鑒定的ALK基因復(fù)雜融合形式的樣本均為EML4-ALK經(jīng)典融合轉(zhuǎn)錄本。有研究[43]發(fā)現(xiàn)，由DNA-based NGS檢測(cè)出ALK基因融合而RNA-based NGS和IHC均未檢出的NSCLC患者接受ALK抑制劑治療后影像學(xué)評(píng)估為疾病進(jìn)展，PFS均不超過(guò)2個(gè)月，提示由DNA-based NGS檢測(cè)的部分基因融合形式并未發(fā)生轉(zhuǎn)錄和翻譯，即存在非功能性融合，未能給患者帶來(lái)明顯臨床獲益，而融合基因經(jīng)RNA-based NGS未檢出或許可解釋為何ALK抑制劑療效不佳。也有研究[6]發(fā)現(xiàn)，由DNA-based NGS檢測(cè)的部分ALK融合患者經(jīng)RNA-based NGS或IHC再次驗(yàn)證基因融合變異的患者對(duì)克唑替尼的獲益持續(xù)時(shí)間明顯長(zhǎng)于經(jīng)RNAbased NGS或IHC未能確認(rèn)基因融合變異的患者［PFS：11.0個(gè)月（95%CI: 8.9-13.1）vs2.0個(gè)月（95%CI: 1.2-2.8）P=0.001］，表明由DNA-based NGS檢測(cè)且經(jīng)RNA或蛋白水平確認(rèn)的融合基因變異部分患者具有更好的靶向治療獲益[79]。因此，RNA-based NGS可進(jìn)一步驗(yàn)證DNA層面檢測(cè)到的融合是否轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而降低DNA-based NGS未檢出基因融合變異時(shí)可能無(wú)法從靶向治療中獲益的風(fēng)險(xiǎn)。當(dāng)RNA-based NGS與IHC、FISH或DNA-based NGS檢測(cè)出現(xiàn)兩種結(jié)果不一致時(shí)，建議通過(guò)第三種檢測(cè)方法進(jìn)行驗(yàn)證，以指導(dǎo)臨床靶向用藥。

共識(shí)四：RNA-based NGS可應(yīng)用于所有NSCLC人群，同時(shí)建議更多關(guān)注與融合基因發(fā)生頻率相關(guān)性較高的肺癌患者（如腺癌、女性、不吸煙、腫瘤進(jìn)展快速等）。【強(qiáng)烈推薦】

RNA-based NGS可應(yīng)用于所有NSCLC人群，通過(guò)臨床病理生理特征有助于識(shí)別發(fā)生融合基因變異較高的肺癌人群。在一項(xiàng)納入ALK、ROS1、RET、NTRK基因融合及MET14跳突檢測(cè)的研究[5]中，在從不吸煙的患者中通過(guò)RNA-based NGS檢出基因融合的比例顯著高于有吸煙史的患者（10/31, 32%vs7/189, 4%,P＜0.01）。多項(xiàng)中國(guó)人群的研究[80-82]顯示，約80%的ALK基因融合發(fā)生在腺癌中，且女性的ALK基因融合發(fā)生率約為男性的2-3倍。一項(xiàng)大型薈萃分析[83]顯示，ROS1基因融合更易發(fā)生在腺癌（OR=1.55, 95%CI: 1.14-2.11,P＜0.05）、女性（OR=1.94,95%CI: 1.62-2.32,P＜0.05）和無(wú)吸煙史患者（OR=2.82,95%CI: 2.24-3.55,P＜0.05）中。另一項(xiàng)研究[84]顯示，277例ROS1基因融合的腫瘤患者中女性占69%，不吸煙患者占75%。多項(xiàng)關(guān)于RET基因融合的研究[72,85-89]發(fā)現(xiàn)，80%以上的RET基因融合發(fā)生在腺癌患者中，RET基因融合的女性患者約為男性患者的3倍，從不吸煙患者約為吸煙患者的2倍。一項(xiàng)分析FoundationCORE數(shù)據(jù)庫(kù)的研究[90]顯示，889例NTRK基因融合的腫瘤患者（肺腺癌占比約70%）中女性占比57.5%。另一項(xiàng)研究[44]發(fā)現(xiàn)NRTK基因融合的不吸煙患者比例占61%。MET14跳突在肺腺癌中發(fā)生率為3%-4%，在肺肉瘤樣癌中發(fā)生率更高，達(dá)到8%-32%[91,92]，針對(duì)MET14跳突的臨床研究中，女性占比約為60%、不吸煙或從不吸煙的患者占比約為70%[93]。針對(duì)NRG1融合的研究[9]顯示，94%為肺腺癌，近60%患者為女性，超過(guò)80%患者為不吸煙患者。綜上，基于已有的研究數(shù)據(jù)，ALK/ROS1/RET/NTRK/NRG1等基因融合主要出現(xiàn)在肺腺癌中，MET14跳突在肺腺癌和肺肉瘤樣癌中的發(fā)生率均較高，以上靶點(diǎn)均主要集中在女性、不吸煙人群中。因此，對(duì)于具有以上臨床病理生理學(xué)特征的患者，應(yīng)當(dāng)更加注重運(yùn)用RNA-based NGS的檢測(cè)，盡可能提高靶點(diǎn)檢出率。

共識(shí)五：FFPE樣本經(jīng)質(zhì)控評(píng)估合格后可用于RNA-based NGS檢測(cè)融合基因?！緩?qiáng)烈推薦】

RNA-based NGS檢測(cè)融合基因優(yōu)先推薦使用組織學(xué)樣本，包括經(jīng)福爾馬林固定后制備的FFPE組織樣本或新鮮（冰凍）組織標(biāo)本。FFPE樣本是臨床實(shí)踐中最常見的一種樣本類型，多年來(lái)被廣泛用于IHC及分子檢測(cè)。盡管福爾馬林固定和石蠟包埋處理會(huì)導(dǎo)致RNA的質(zhì)量和完整性受損，使FFPE樣本提取RNA進(jìn)行融合基因檢測(cè)具有一定的技術(shù)難度，但隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，越來(lái)越多的研究[94-97]表明FFPE樣本提取RNA進(jìn)行融合基因檢測(cè)是可行的，并且與新鮮冰凍樣本中檢測(cè)到的融合具有較高的一致性。對(duì)于無(wú)法獲得組織學(xué)標(biāo)本的情況，細(xì)胞學(xué)樣本如胸腹腔積液等需進(jìn)行腫瘤細(xì)胞量評(píng)估或制作成FFPE樣本，滿足檢測(cè)需求后可嘗試提取RNA進(jìn)行融合基因檢測(cè)。新鮮組織樣本因未經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的室溫暴露或固定包埋處理而RNA降解少、質(zhì)量高，常作為RNAbased NGS檢測(cè)首選的標(biāo)本類型。然而，在臨床實(shí)踐中僅部分醫(yī)院或科室具有收集、處理和儲(chǔ)存這類標(biāo)本的條件，在常規(guī)情況下可及性不高，因此可將新鮮組織標(biāo)本包埋為FFPE樣本后再行檢測(cè)。FFPE樣本中RNA提取和建庫(kù)步驟需用已經(jīng)獲許上市的商業(yè)試劑盒進(jìn)行。其他樣本類型，如血液、腦脊液等在一些情況下被應(yīng)用于ctDNA液體活檢，但目前尚不推薦從液體活檢樣本中提取RNA進(jìn)行腫瘤融合基因檢測(cè)。

FFPE樣本的保存時(shí)間對(duì)RNA提取的完整性、總產(chǎn)量和純度的影響尚無(wú)明確結(jié)論。有研究[98]表明，收集后5年內(nèi)的FFPE樣本依然可以用于RNA提取和測(cè)序分析，但也有研究者[99]發(fā)現(xiàn)，在收集后的4年內(nèi)，大約20%的來(lái)自FFPE樣本經(jīng)RNA-based NGS檢測(cè)時(shí)可能不適合基于RIN值（RNA integrity number）和DV200的RNA完整性分析。盡管一些研究[95,99]報(bào)道了從保存3年以上甚至超過(guò)10年的FFPE樣本中成功提取RNA進(jìn)行基因檢測(cè)，但隨著FFPE樣本保存時(shí)間的增加RNA降解的風(fēng)險(xiǎn)增大，使用年限較久的FFPE樣本進(jìn)行RNA分析會(huì)面臨較大的技術(shù)挑戰(zhàn)和不確定性，檢測(cè)的假陰性風(fēng)險(xiǎn)增加，建議盡量使用保存年限較短（3年以內(nèi)）的標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。另外，F(xiàn)FPE樣本中RNA的質(zhì)量和完整性還會(huì)受到其他多種因素影響，包括離體樣本固定是否及時(shí)、固定液類型、保存條件和樣本厚度等因素[100]。因此，臨床需要綜合評(píng)定并且有必要對(duì)RNA的總量、降解情況等采取嚴(yán)謹(jǐn)?shù)馁|(zhì)量控制措施。組織學(xué)標(biāo)本需經(jīng)質(zhì)控合格后用于融合基因檢測(cè)，以獲得更可靠和準(zhǔn)確的結(jié)果。

共識(shí)六：RNA-based NGS檢測(cè)融合基因應(yīng)充分評(píng)估腫瘤細(xì)胞含量、RNA的完整性、文庫(kù)產(chǎn)量和純度等質(zhì)控信息，需在有資質(zhì)的醫(yī)療機(jī)構(gòu)出具RNA-based NGS檢測(cè)報(bào)告?！緩?qiáng)烈推薦】

已有的研究[101]表明：腫瘤細(xì)胞含量會(huì)影響NGS檢測(cè)的靈敏度，用于NGS檢測(cè)的樣本腫瘤細(xì)胞含量應(yīng)不低于20%，腫瘤細(xì)胞含量過(guò)低時(shí)可嘗試進(jìn)一步富集后再用于檢測(cè)[27,102,103]。RNA的完整性、文庫(kù)產(chǎn)量和純度直接關(guān)系到檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，測(cè)序前需對(duì)RNA完整性、文庫(kù)產(chǎn)量和純度進(jìn)行評(píng)估。評(píng)估RNA完整性一般有兩個(gè)常用的指標(biāo)：RIN值和DV200值。RIN值是通過(guò)電泳分析RNA樣本中18S和28S rRNA的降解程度而計(jì)算得出。RIN值的范圍從0到10，RIN值越高代表RNA完整性越高；DV200表示RNA樣本中長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的RNA分子占總RNA量的百分比，DV200值越高表明RNA樣本中高質(zhì)量RNA越多，故更適合進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。RIN值評(píng)估更適合樣本質(zhì)量較高的新鮮冰凍樣本，一般在基因表達(dá)定量的研究中更常使用。對(duì)于存在降解的RNA樣本RIN值敏感性相對(duì)較低，有研究[104,105]表明DV200比RIN值更適合FFPE樣本的RNA質(zhì)量評(píng)估，DV200與文庫(kù)產(chǎn)量之間具有更好的相關(guān)性。盡管不同的研究中DV200的閾值設(shè)置不完全相同，較多研究[99,106,107]中使用DV200≥30%作為閾值，樣本DV200≥30%方可用于后續(xù)進(jìn)一步的檢測(cè)。RNA純度是通過(guò)分光光度計(jì)測(cè)定260/280 nm和260/230 nm吸光度（absorbance, A），核酸的吸光度峰值在260 nm處，蛋白質(zhì)的吸光度峰值在280 nm處，鹽、有機(jī)溶劑等物質(zhì)通常在230 nm處存在吸光度峰值。A260/A280值在2.0附近時(shí)，RNA純度符合標(biāo)準(zhǔn)。A260/A230值通常在2.0到2.2的范圍內(nèi)[108]。

需要指出的是，RNA-based NGS檢測(cè)過(guò)程中應(yīng)有嚴(yán)格的全流程質(zhì)控，對(duì)送檢標(biāo)本病理質(zhì)量、RNA質(zhì)量、文庫(kù)質(zhì)量、測(cè)序深度、下機(jī)數(shù)據(jù)質(zhì)量和數(shù)據(jù)分析等各環(huán)節(jié)設(shè)置質(zhì)控點(diǎn)，并且在報(bào)告中體現(xiàn)上述質(zhì)控信息。建議在醫(yī)院病理科或擁有美國(guó)病理學(xué)家學(xué)會(huì)（College of American Pathologists, CAP）、美國(guó)聯(lián)邦醫(yī)療保險(xiǎn)和醫(yī)療救助服務(wù)中心頒發(fā)的CLIA（Clinical Laboratory Improvement Amendments）和中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì)（China National Accreditation Service for Conformity Assessment, CNAS）等資質(zhì)認(rèn)證的獨(dú)立實(shí)驗(yàn)室開展RNAbased NGS的融合基因檢測(cè)，以確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

本文結(jié)合專家觀點(diǎn)及相關(guān)研究結(jié)果，主要對(duì)RNAbased NGS檢測(cè)NSCLC融合基因的應(yīng)用時(shí)機(jī)、應(yīng)用場(chǎng)景、實(shí)踐可及性和質(zhì)控等進(jìn)行了共識(shí)推薦。盡管如此，目前RNA-based NGS檢測(cè)融合基因仍然存在未解決的問題。例如：缺乏在同一研究中經(jīng)DNA-based NGS與RNA-based NGS同時(shí)檢測(cè)各個(gè)融合基因的頭對(duì)頭研究設(shè)計(jì)，缺乏FFPE樣本儲(chǔ)存年限對(duì)經(jīng)RNA-based NGS檢測(cè)的RNA完整性、純度、產(chǎn)量和檢出率影響的可靠研究證據(jù)，缺乏DNA-based NGS與RNA-based NGS檢出不一致時(shí)融合變異相關(guān)靶向治療的隊(duì)列研究結(jié)果。因此，建議在有條件的情況下開展前瞻性的大樣本臨床研究。

參與本共識(shí)的專家組成員

Competing interests

The authors declare that they have no competing interests.