吳小紅,趙丹華,所玥,彭沁華,王紅玉,劉欣玉,李玉華

(中國食品藥品檢定研究院蟲媒病毒疫苗室,國家藥品監(jiān)督管理局生物制品質(zhì)量研究與評價重點實驗室,北京 102629)

新型冠狀病毒感染(coronavirus disease 2019,COVID-19)的流行對人類健康造成了嚴(yán)重影響。疫苗接種已被證實對嚴(yán)重疾病、降低住院率和死亡率非常有效[1-2]。其中mRNA疫苗由于具有能夠同時誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫、研發(fā)和生產(chǎn)周期短、容易實現(xiàn)量產(chǎn)等優(yōu)勢,成為國際上主要采用的COVID-19疫苗研發(fā)技術(shù)。隨著新型冠狀病毒(2019-nCoV)變異株的不斷出現(xiàn),單價變異株疫苗及多價變異株疫苗可作為加強免疫以及異源序貫免疫來應(yīng)對病毒變異造成的感染威脅[3]。新冠mRNA疫苗的效力評價目前尚無國際標(biāo)準(zhǔn),歐洲及世界衛(wèi)生組織(WHO)專家多推薦體外活性研究作為該疫苗效力評價的主要方法[4-6]。鑒于mRNA疫苗為創(chuàng)新技術(shù)疫苗,缺乏系統(tǒng)的疫苗質(zhì)量研究經(jīng)驗,我國現(xiàn)階段采用體內(nèi)和體外雙效力指標(biāo)進行評價[7],體內(nèi)效力的評價可利用動物免疫后檢測中和抗體和/或總抗體的方法來進行[8]。本研究對新冠mRNA疫苗不同免疫劑量和不同免疫程序誘導(dǎo)的中和抗體反應(yīng)進行初步研究,并對新冠變異株mRNA疫苗及二價mRNA疫苗免疫小鼠后的抗體陽性率和抗體水平進行體內(nèi)效力分析,從而評價mRNA疫苗的質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級BALB/c小鼠,6～8周齡,體重 18～22 g,雌雄不限,由中國食品藥品檢定研究院動物所提供,實驗動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(京)2022-0002,使用許可證號:SYXK(京)2022-0014,動物實驗倫理批準(zhǔn)文號:中檢動(福)第2022(B)008號。

1.2 主要試劑及儀器10×PBS、TMB、終止液購自索萊寶公司;HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG購自美國Jackson公司;BSA購自美國Sigma公司;DMEM、胎牛血清、胰酶、HEPES、雙抗均購自美國Gibco公司;熒光素酶檢測試劑購自美國普洛麥格Promega公司;Promega GloMax 96 微孔板化學(xué)發(fā)光檢測儀(Glomax navigator)購自美國普洛麥格Promega公司;酶標(biāo)儀(Infinite M200)購自美國蒂肯公司。

1.3 實驗用疫苗、細(xì)胞、不同型別假病毒實驗用疫苗為國內(nèi)企業(yè)生產(chǎn)的mRNA疫苗,編號V1～V9。其中V1為原型株疫苗,V2～V7為二價2019-nCoV變異株mRNA疫苗(Omicron BA.4/5株和Delta株雙價、Omicron BA.4/5株和Beta株雙價、Omicron BA.2株和原型株雙價以及Omicron XBB.1.5株和BQ.1.7株雙價),V8～V9是2019-nCoV變異株mRNA疫苗(Omicron BA.1);Vero細(xì)胞購自ATCC,本室傳代保存;假病毒原型株、Delta株、Beta株、Omicron BA.1、Omicron BA.2、Omicron BA.4/5、Omicron XBB.1.5購自北京云菱生物技術(shù)公司;不同株2019-nCoV S蛋白抗原分別購自北京義翹神州生物技術(shù)有限公司和北京百普賽斯公司。

1.4 免疫劑量及免疫程序

1.4.1 mRNA疫苗免疫劑量和免疫程序研究將V1mRNA疫苗(原型株)配制成不同濃度后,按照不同的免疫程序分成A、B、C 3組:A組程序為免疫1針,14 d采血;B組程序為間隔7 d加強免疫1針后7 d采血;C組程序為間隔14 d加強免疫1針后7 d采血。每種免疫程序按照不同的免疫劑量分成3個小組,分別是每只小鼠注射2、5和10 μg,共計9組,每組10只小鼠。同時10只小鼠注射生理鹽水作為陰性對照組。每只小鼠后肢肌肉注射100 μL疫苗,眼球取血分離血清,-20 ℃保存?zhèn)溆?。用假病毒中和試驗法檢測抗2019-nCoV中和抗體。

1.4.2 實驗疫苗免疫和檢測mRNA變異株疫苗及二價疫苗均按照企業(yè)的免疫劑量和免疫程序進行免疫和采血,分離血清后于-20 ℃保存。分別進行中和抗體和IgG結(jié)合抗體的檢測。

1.5 假病毒中和試驗(PBNA法)按照操作規(guī)程進行[9-10],在96孔板上3倍系列稀釋的血清100 μL,分別加入各型假病毒[用DMEM培養(yǎng)基稀釋至1.3×104半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)/mL],每孔加入50 μL,同時設(shè)立病毒對照和細(xì)胞對照。37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中和1 h,加入2×105個/mL的Vero細(xì)胞懸液,每孔100 μL,37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)20～28 h后,從細(xì)胞培養(yǎng)箱中取出96孔板,用多道移液器從每個上樣孔中吸棄150 μL上清,然后加入100 μL熒光素酶檢測試劑,室溫避光反應(yīng)2 min。反應(yīng)結(jié)束后,用多道移液器將反應(yīng)孔中的液體反復(fù)吹吸6～8次,使細(xì)胞充分裂解,從每孔中吸出100 μL液體,加于對應(yīng)96孔化學(xué)發(fā)光檢測板中,置于化學(xué)發(fā)光檢測儀中讀取發(fā)光值。計算抑制率={1-[樣品組的發(fā)光強度均值-空白對照CC(Cell Control,CC)均值]/[陰性組的發(fā)光強度VC(Virus Control,VC)均值-空白對照值CC均值]}×100%。根據(jù)中和抑制率結(jié)果,按照Reed Muench法計算中和抗體滴度半數(shù)效應(yīng)劑量(50% maximal effective concentration,EC50),EC50>30為抗體陽性。

1.6 特異性抗2019-nCoV Spike蛋白IgG抗體檢測將2019-nCoV各株抗原分別用1×PBS稀釋至2 μg·mL-1,取96孔板每孔加100 μL,(5±3)℃條件下包被過夜16 h,PBST洗板3次,拍干后加入封閉液(2%BSA溶液),100 μL/孔,37 ℃孵箱里封閉2 h,加入系列稀釋后的待檢測血清樣本,37 ℃孵箱里孵育后1 h,PBST洗板3次,加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗小鼠IgG抗體,每孔100 μL,37 ℃孵育后1 h,PBST洗板3次,加入底物TMB 50 μL,室溫避光顯色3～5 min,加入1 mol·L-1硫酸溶液終止液終止,150 μL/孔,在酶標(biāo)儀上檢測波長450 nm/630 nm 的OD值,以陰性小鼠吸光度均值的2.1倍為cut off值。血清A值大于cut off值為抗體陽性,取陽性A值最大的血清稀釋度為血清的IgG抗體滴度。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法使用GraphPad Prism 8.0進行數(shù)據(jù)分析,相同免疫劑量不同免疫程序以及相同免疫程序不同免疫劑量間中和抗體滴度以及不同企業(yè)mRNA疫苗免疫后中和抗體之間比較采用單因素方差分析評估組間差異,中和抗體和IgG抗體之間差異采用t檢驗分析,P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同免疫劑量和不同免疫程序的抗體反應(yīng)針對原型株mRNA疫苗不同免疫劑量和免疫程序的中和抗體檢測結(jié)果顯示,2、5、10 μg mRNA疫苗免疫小鼠后,1針免疫組和2針免疫組抗體陽性率均為100%。2、5、10 μg首針免疫后14 d或21 d中和抗體反應(yīng)具有明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。相同免疫劑量、不同免疫程序結(jié)果顯示,2針免疫組高于1針免疫組,其中2 μg劑量組不同針次之間抗體滴度結(jié)果差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=20.64,P<0.001);5 μg劑量組不同針次之間抗體滴度結(jié)果差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=18.27,P<0.001);10 μg劑量組不同針次之間抗體滴度結(jié)果差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (F=11.37,P<0.001)。2針免疫組中14 d加強免疫組高于7 d加強免疫組及1針組(F=57.13,P<0.001)。其中2 μg間隔7 d加強免疫和間隔14 d加強免疫組產(chǎn)生的中和抗體幾何平均滴度(geometric mean titer,GMT)分別為218和468,14 d為7 d的2.15倍,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.40,P=0.003);5 μg間隔7 d加強免疫和間隔14 d加強免疫產(chǎn)生的中和抗體GMT分別為499和1 436,14 d為7 d的2.88倍,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.62,P=0.002);10 μg間隔7 d加強免疫和間隔14 d加強免疫產(chǎn)生的中和抗體GMT分別為608和1 909,14 d為7 d的3.14倍,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.23,P=0.005)。相同免疫程序、不同免疫劑量誘導(dǎo)的抗體反應(yīng)結(jié)果顯示,1針免疫組不同劑量間相比(F=7.33,P=0.003);2針免疫組,間隔7 d不同劑量間相比(F=6.40,P=0.005);2針免疫組,間隔14 d不同劑量間相比(F=7.64,P=0.002),差異均有統(tǒng)計學(xué)意義,結(jié)果見表1。

表1 V1疫苗不同免疫劑量和免疫程序的中和抗體滴度及陽性率

2.2 8家企業(yè)生產(chǎn)的新冠變異株mRNA疫苗體內(nèi)效力檢測結(jié)果8家企業(yè)生產(chǎn)的疫苗V2～V9按照企業(yè)的免疫劑量和免疫程序免疫BALB/c小鼠后,中和抗體及特異性IgG抗體檢測結(jié)果見表2。

表2 不同企業(yè)生產(chǎn)的mRNA疫苗抗體檢測結(jié)果

2.3 特異性IgG結(jié)合抗體和中和抗體結(jié)果分析檢測結(jié)果以對數(shù)轉(zhuǎn)換后進行t檢驗 ,組份1 IgG和EC50比較t=11.47,P<0.001 ;組份2 IgG和EC50比較t=17.56,P<0.001,均顯示中和抗體檢測結(jié)果和IgG結(jié)合抗體檢測差異有統(tǒng)計學(xué)意義。Pearson相關(guān)系數(shù)r分別為0.42和0.22。雖然兩種方法抗體檢測結(jié)果相關(guān)性較差,但均可以檢測到高水平的抗體特異性反應(yīng)。兩種方法檢測各企業(yè)3～4批疫苗,IgG抗體結(jié)果批間變異系數(shù)在1.0%～7.6%,中和抗體結(jié)果批間變異系數(shù)在2.0%～7.9%,提示兩種抗體檢測方法均可以用于評價疫苗體內(nèi)效價的批間一致性。各企業(yè)mRNA疫苗的中和抗體結(jié)果對數(shù)轉(zhuǎn)換后進行組間方差分析,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=70.03,P<0.001)。

3 討論

新冠mRNA疫苗臨床前和臨床研究中均證實疫苗的有效性與動物或人群保護力之間有一定的量效關(guān)系[11-14]。中和抗體是最重要的保護性抗體,與2019-nCoV感染者癥狀嚴(yán)重程度之間也有一定的相關(guān)性[15-16]。因此建立標(biāo)準(zhǔn)的中和抗體檢測平臺技術(shù)對COVID-19疫苗進行評價尤為重要[17]。本研究采用的假病毒中和方法經(jīng)國內(nèi)多家實驗室聯(lián)合驗證[9,18],抗體檢測結(jié)果相對客觀,與IgG結(jié)合抗體檢測相比更能體現(xiàn)疫苗的免疫原性。尤其對于多價疫苗,假病毒中和抗體檢測方法可實現(xiàn)對不同變異株抗體分別進行檢測,能較好的反映出針對多價疫苗各毒株組份疫苗誘導(dǎo)的抗體中和活性。

通過對1批mRNA原型株疫苗不同免疫劑量和不同免疫程序的分析,提示mRNA疫苗免疫小鼠后的中和抗體水平與免疫劑量和免疫程序有密切關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn),同等劑量下(2、5、10 μg)間隔7 d與間隔14 d 2針免疫的抗體結(jié)果差異有統(tǒng)計學(xué)意義,對于mRNA疫苗來說,間隔7 d的第2針加強免疫不是產(chǎn)生高滴度中和抗體的最適宜的程序,疫苗實際使用過程中第2針加強免疫的時間選擇在21 d或28 d[11-12]。因此mRNA疫苗體內(nèi)效力的評價應(yīng)適當(dāng)關(guān)注免疫程序的設(shè)計。研究結(jié)果顯示mRNA變異株單價疫苗或二價疫苗中針對不同組分的IgG抗體滴度均在104.5～107.5間,符合各企業(yè)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(不低于103或104),且各企業(yè)生產(chǎn)的疫苗IgG抗體結(jié)果批間一致性良好,變異系數(shù)在1.0%～7.6%之間。假病毒法檢測中和抗體滴度在102.6～104.8之間,不同企業(yè)生產(chǎn)的疫苗免疫后中和抗體水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=70.03,P<0.001),與國產(chǎn)mRNA疫苗已公布的Ⅰ～Ⅱ期臨床研究數(shù)據(jù)一致,不同企業(yè)新冠mRNA疫苗在人體內(nèi)產(chǎn)生的中和抗體滴度有差異[12-15 ]。各企業(yè)不同批次中和抗體檢測結(jié)果變異系數(shù)為2.0%～7.9%。因此中和抗體檢測可用于不同企業(yè)mRNA疫苗效力的比較研究以及疫苗批間一致性的評價。

輝瑞公司生產(chǎn)的BNT162b為30 μg/劑,莫德納公司mRNA-1273為100 μg/劑。兩款疫苗對2019-nCoV感染的保護效力分別達到了94.6%和94.1%,不同的人用劑量和免疫程序可產(chǎn)生相同的臨床保護力[19-21]。mRNA-1273 Ⅲ期臨床研究結(jié)果顯示接種該疫苗后假病毒法檢測中和抗體滴度半數(shù)抑制稀釋(50% inhibitory dilution,ID50)為10、100和1 000,測算疫苗保護效力分別為78%、91%和96%[22];新冠滅活疫苗NVX-CoV2373中和抗體滴度ID50為50、100和7 230 (IU50·mL-1),疫苗保護效力分別為75.7%、81.7%和96.8%[23]。本研究結(jié)果顯示國產(chǎn)新冠mRNA疫苗小鼠免疫后中和抗體均達到較高水平,無論是1針免疫還是2針免疫EC50除個別企業(yè)因單價組分配比含量低,造成滴度偏低(V4)外,其余企業(yè)中和抗體滴度均在在1 000以上甚至更高,提示國產(chǎn)新冠mRNA疫苗的體內(nèi)效力結(jié)果已達到較高的標(biāo)準(zhǔn)要求。雖然本研究未利用上述新冠mRNA疫苗進一步開展攻毒保護力研究,但隨著mRNA疫苗大量的臨床研究數(shù)據(jù)以及真實世界的保護力數(shù)據(jù)公布,會對疫苗的效力評價標(biāo)準(zhǔn)提供更有效的數(shù)據(jù)支持。盡快建立效力評價用疫苗參考品和血清檢測用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),提高國產(chǎn)mRNA疫苗的質(zhì)量評價水平是下一步研究方向。