黎春怡,黃卓烈,巫光宏,何 平,詹福建

(1.茂名職業(yè)技術(shù)學(xué)院 化學(xué)工程系,廣東 茂名 525000; 2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,廣東 廣州 510642;3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)與實(shí)踐訓(xùn)練中心,廣東 廣州 510642)

蛋白質(zhì)工程的研究任務(wù)之一就是將來(lái)自生物細(xì)胞的天然蛋白分子進(jìn)行改造,使其適應(yīng)于工業(yè)生產(chǎn)和醫(yī)藥研究等領(lǐng)域。天然的酶是在生物細(xì)胞內(nèi)合成的,在極大多數(shù)情況下這些酶都在細(xì)胞內(nèi)起作用。如果將酶從細(xì)胞內(nèi)提取出來(lái)應(yīng)用在工業(yè)或醫(yī)藥等領(lǐng)域時(shí),一般它們的催化活性都很低,且酶學(xué)性質(zhì)極不穩(wěn)定。但是,如果對(duì)來(lái)自生物細(xì)胞的酶進(jìn)行適當(dāng)改造,那就有可能在一定程度上提高這些酶的催化活性,其酶學(xué)性質(zhì)也可能會(huì)得到一定程度的改善。

對(duì)天然的蛋白質(zhì)(酶)分子進(jìn)行改造,一個(gè)重要的方法就是對(duì)這些蛋白質(zhì)分子的側(cè)鏈進(jìn)行化學(xué)修飾[1]。通過(guò)化學(xué)反應(yīng)將某些有機(jī)分子共價(jià)結(jié)合到酶分子肽鏈的某些基團(tuán)上。這樣不僅能改變酶分子的立體結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì),而且能提高酶的應(yīng)用價(jià)值。這是目前最有應(yīng)用前景的蛋白質(zhì)工程技術(shù)[1-4]。

用于修飾酶分子的修飾劑有兩類。一類是小分子修飾劑。用某些小分子物質(zhì)來(lái)修飾酶分子的側(cè)鏈,可以改變酶分子的溶解性和催化活性。Distel等[5]用小分子物質(zhì)辛酰氯對(duì)堿性蛋白酶進(jìn)行修飾,結(jié)果發(fā)現(xiàn):在氯仿中修飾酶的溶解度高達(dá)44 mg/mL,在不同有機(jī)溶劑中修飾酶的酶活提高了4～22倍;用鄰苯二甲酸酐修飾后的辣根過(guò)氧化物酶(HRP)的催化活性也大大提高。另一類是大分子修飾劑。用大分子化合物對(duì)酶分子的表面進(jìn)行修飾可以降低酶的免疫原性,提高酶的熱穩(wěn)定性。一般使用分子量為500～20 000的甲氧基聚乙二醇(mPEG)來(lái)修飾蛋白質(zhì)的表面,在降低酶的免疫原性方面,大分子mPEG的修飾效果優(yōu)于小分子mPEG的[6],其中mPEG-5000修飾后的效果最好[7];而在維持酶的酶活方面,小分子mPEG修飾后的酶活效果則優(yōu)于大分子mPEG的[6]。

多糖類物質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)是無(wú)毒、易溶于水和生物相容性好。因此,多糖也被用來(lái)修飾酶以提高酶的穩(wěn)定性和降低其免疫原性。Wu等[8]用葡聚糖修飾纖溶酶原后發(fā)現(xiàn),該酶原的半衰期增加了52%,但酶活卻降低了36%。楊漩等[9]用活性葡聚糖修飾彈性蛋白酶后發(fā)現(xiàn),在室溫下酶活維持18個(gè)月后基本不變。伍志權(quán)等[10]用右旋糖苷修飾酵母蔗糖酶后發(fā)現(xiàn),修飾酶的酶活提高了56.7%,而且當(dāng)pH為3.5時(shí),酶活的穩(wěn)定性增強(qiáng)。

殼聚糖(COS)是一種高分子多糖,也可用于酶分子的化學(xué)修飾,但以分子量較小的殼聚糖(稱為殼寡糖)修飾效果較好。在一定的化學(xué)反應(yīng)條件下,殼寡糖的游離半縮醛羥基可以與酶分子側(cè)鏈上的氨基或酰胺基脫水縮合而連接,來(lái)修飾酶分子。黎春怡等[11]利用殼寡糖對(duì)漆酶進(jìn)行修飾,修飾酶的活性比天然酶提高了45%,雖然熱穩(wěn)定性和最大反應(yīng)速率(Vmax)得到很大的提高,但Km值卻明顯降低。Li等[12]用殼寡糖修飾胃蛋白酶,修飾后酶的穩(wěn)定性得到較大提高。

酵母轉(zhuǎn)化酶(EC 3.2.1.26)具有廣泛的應(yīng)用前景。在食品工業(yè)方面,轉(zhuǎn)化酶能利用從蔗糖生產(chǎn)糖漿和人造蜂蜜,還可用作杏子糖、核桃糖的軟化劑[13]。轉(zhuǎn)化酶在生產(chǎn)液態(tài)心糖和軟性心糖中有特殊用途[14]。利用轉(zhuǎn)化酶將蜂蜜中的蔗糖分解成單糖,以此可生產(chǎn)工業(yè)酒精[15]。在臨床應(yīng)用方面,轉(zhuǎn)化酶-異麥糖酶復(fù)合物既可作為結(jié)腸癌的預(yù)測(cè)指標(biāo),也可用于檢測(cè)心臟巴雷特腺癌[16]。雖然目前酵母轉(zhuǎn)化酶在工業(yè)和醫(yī)藥方面應(yīng)用很多,但該酶在使用中存在催化活性不高、貯存活性下降快、酶學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定等缺點(diǎn),這就大大阻礙了它的廣泛應(yīng)用。如果將轉(zhuǎn)化酶的分子進(jìn)行修飾改造,以改善其酶學(xué)性質(zhì),最終提高其催化活性,這將會(huì)大大提高轉(zhuǎn)化酶的應(yīng)用價(jià)值。

蛋白質(zhì)分子功能的發(fā)揮受其分子結(jié)構(gòu)制約,而且蛋白質(zhì)分子構(gòu)象改變會(huì)導(dǎo)致其功能的改變。當(dāng)今,人們研究蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的變化主要利用三維熒光光譜來(lái)實(shí)現(xiàn)。Lin等[17]利用三維熒光光譜法研究土貝母皂苷與人血清白蛋白結(jié)合后的構(gòu)象變化后發(fā)現(xiàn),人血清白蛋白分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的改變。張孟麗等[18]和魏良淑等[19]用三維熒光光譜法研究后發(fā)現(xiàn),所研究的蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象都發(fā)生變化。楊勝園等[20]采用三維熒光光譜等技術(shù)研究苯甲酸與牛血清白蛋白(BSA)分子的相互作用機(jī)制后發(fā)現(xiàn),苯甲酸對(duì)BSA內(nèi)源性熒光的猝滅作用屬于靜態(tài)猝滅。

基于此,本研究試圖利用殼寡糖對(duì)酵母轉(zhuǎn)化酶進(jìn)行側(cè)鏈修飾,探討修飾前后酶的催化活性、動(dòng)力學(xué)、氨基修飾率和三維熒光光譜等的變化,以期為酵母轉(zhuǎn)化酶的進(jìn)一步應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

酵母轉(zhuǎn)化酶(YInv,CAS 9001-57-4)、2,4,6-三硝酸苯磺酸(TNBS)、考馬斯亮藍(lán)G-250、考馬斯亮藍(lán)R-250,Sigma公司;殼寡糖(COS,平均分子量5 000),上海陶和生物科技有限公司;牛血清白蛋白(BSA),Fluka公司;葡萄糖,Amersco公司;NaBH4(96%),上海潤(rùn)捷化學(xué)公司。其他化學(xué)品均為市售分析純產(chǎn)品。

1.2 主要儀器

TFD5503型冷凍干燥機(jī),韓國(guó)Shin Lab公司;凝膠成像系統(tǒng),廣東珠海黑馬有限公司;UV3010型分光光度計(jì)、F4500型熒光光譜儀,日本日立公司;DYY-5型恒壓恒流電泳儀,北京六一儀器廠;PHS-25型 pH計(jì),上海雷磁儀器廠。

1.3 YInv的純度鑒定

采用聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)技術(shù)對(duì)YInv純度進(jìn)行鑒定。濃縮膠和分離膠的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為4.5%和7.5%;加樣量為10 μL/孔;樣品在濃縮膠中時(shí)電壓為150 V,樣品進(jìn)入分離膠時(shí)電壓為200 V;電泳后用考馬斯亮藍(lán)R-250溶液對(duì)凝膠進(jìn)行染色30 min,再用0.25 mol/L 的NaCl溶液對(duì)染色的凝膠進(jìn)行脫色;最后用凝膠成像儀對(duì)凝膠進(jìn)行拍照。

1.4 用COS對(duì)YInv進(jìn)行修飾

1.4.1 基本修飾方法

用平均分子量為5 000的殼寡糖(COS)修飾YInv。具體過(guò)程為將25 mg的YInv純酶溶解于5 mL 0.1 mol/L醋酸鈉緩沖液(pH 4.0),然后在酶液中加入0.1 mol/L的NaIO4溶液5 mL和0.5 g的蔗糖(保護(hù)YInv)后攪拌30 min,加入400 μL乙二醇終止反應(yīng)。將反應(yīng)液在2 L 0.1 mol/L醋酸鈉緩沖液(pH 4.0)中透析4 h,透析管截留分子量為1.0×104,重復(fù)透析3次;再向經(jīng)透析后的溶液中加入0.5 g蔗糖和40 mg COS,攪拌4 h后,加入1 mol/L 的NaBH4溶液1 mL,再連續(xù)攪拌4 h;然后將溶液用 0.1 mol/L的醋酸鈉溶液2 L透析4 h,并重復(fù)透析3次。由此得到修飾酶的粗酶,命名為粗COS-Inv。以上實(shí)驗(yàn)均在4 ℃暗室中進(jìn)行。

1.4.2 單因素實(shí)驗(yàn)確定最佳修飾條件

為了獲得修飾過(guò)程中使用的pH、反應(yīng)溫度、COS劑量、蔗糖劑量及反應(yīng)時(shí)間等參數(shù)的最佳值,分別進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),以得到修飾酶的酶活性最高為標(biāo)準(zhǔn),再確定最佳的修飾條件。

1.4.2.1 pH對(duì)化學(xué)修飾效果的影響

按基本修飾方法進(jìn)行修飾,將pH分別設(shè)置為4.0、5.0、6.0和7.0,反應(yīng)溫度為5 ℃,蔗糖用量為1.71 g,反應(yīng)時(shí)間為4 h,COS劑量為20 mg,以此考察pH對(duì)修飾效果的影響。

1.4.2.2 反應(yīng)溫度對(duì)修飾效果的影響

按基本修飾方法進(jìn)行修飾,將反應(yīng)溫度分別設(shè)為5、20、35和50 ℃,pH為4.0,蔗糖用量為1.71 g,反應(yīng)時(shí)間為4 h,COS劑量為20 mg,以此考察反應(yīng)溫度對(duì)修飾效果的影響。

1.4.2.3 COS劑量對(duì)化學(xué)修飾效果的影響

按基本修飾方法進(jìn)行修飾,而COS的添加量分別設(shè)為10、20、40和80 mg,反應(yīng)溫度為5 ℃,pH為4.0,反應(yīng)時(shí)間為4 h,蔗糖用量為1.71 g,以此考察COS劑量對(duì)修飾效果的影響。

1.4.2.4 蔗糖劑量對(duì)化學(xué)修飾效果的影響

按基本修飾方法進(jìn)行修飾,將蔗糖用量分別設(shè)為0、0.85、1.71和3.42 g,反應(yīng)溫度為5 ℃,pH為4.0,反應(yīng)時(shí)間為4 h,COS劑量為20 mg,以此考察蔗糖劑量對(duì)修飾效果的影響。

1.4.2.5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)化學(xué)修飾效果的影響

按基本修飾方法進(jìn)行修飾,將反應(yīng)時(shí)間分別設(shè)為4、6、8和12 h,反應(yīng)溫度為5 ℃,pH為4.0,蔗糖用量為1.71 g,COS劑量為20 mg,以此考察反應(yīng)時(shí)間對(duì)修飾效果的影響。

1.5 COS-Inv的純化與鑒定

用聚乙二醇(PEG)將修飾得到的粗COS-Inv溶液在4 ℃下濃縮后,再用DEAE-52纖維素陰離子交換層析柱(尺寸為φ2.5 cm×40 cm)來(lái)純化15 mL經(jīng)濃縮的粗COS-Inv。首先,用0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS,pH 6.0)洗脫,洗脫速度為1 mL/min,每管4 mL,共收集17支管;其次,用0.05 mol/L PBS(pH 6.0)和0.1 mol/L 的NaCl洗脫,收集10支試管;再次,從第28支試管開始進(jìn)行梯度洗脫,洗脫液為100 mL PBS (0.05 mol/L,pH 6.0,含0.5 mol/L NaCl) + 150 mL檸檬酸緩沖液(CBS,0.2 mol/L,pH 6.0,含3 mol/L 的NaCl),洗脫速度為1 mL/min,檢測(cè)每管洗脫液的A280和酶活;最后,選擇酶活最高的試管中的分餾液用PEG濃縮,將此濃縮酶液用PAGE電泳分析COS-Inv的純度,并進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn)。

1.6 氨基修飾率的測(cè)定

將1 mL酶液(含0.1～1.0 mg蛋白質(zhì))與1 mL 40 g/L的NaHCO3(pH 8.5)和1 mL 100 g/L的十二烷基硫酸鈉(SDS)混合,20 min后,加入1 mL 1 g/L的TNBS溶液。將混合物在40 ℃下保存2 h后,再加入0.5 mL 1 mol/L的 HCl終止反應(yīng)。檢測(cè)335 nm處的吸光度A335。用文獻(xiàn)[21]的方法計(jì)算酶蛋白游離氨基含量,再根據(jù)修飾前后相同蛋白質(zhì)的酶液中游離氨基的含量計(jì)算氨基殘基比率。

氨基修飾率=1-氨基殘基比率。

1.7 蛋白質(zhì)和糖含量的測(cè)定

以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白,采用Braford法[22]測(cè)定蛋白質(zhì)含量。以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn),按照Mohammadi等[23]的方法測(cè)定糖含量。

1.8 YInv 和COS-Inv活性的測(cè)定

轉(zhuǎn)化酶的最適溫度為50～54 ℃[24-28]。在試管中加入1 mol/L的蔗糖1 mL和0.1 mol/L的醋酸鈉緩沖液(pH 5.0) 1 mL,在50 ℃水浴保溫10 min后,加入0.1 mL酶液(YInv或COS-Inv)反應(yīng)10 min后,加入2 mol/L的NaOH溶液0.1 mL終止反應(yīng)。采用3,5-二硝基水楊酸法[29]測(cè)定還原糖含量。酶活性定義:每分鐘產(chǎn)生1 μmol還原糖所需酶的量。比酶活定義:1 mg蛋白質(zhì)對(duì)應(yīng)的酶活(U/mg)。

1.9 YInv和COS-Inv的貯存穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別將YInv和COS-Inv置于冰箱冷藏室(4 ℃)和室溫(25 ℃)中,每天定時(shí)測(cè)定酶活,連續(xù)測(cè)定7 d,觀察酶活變化趨勢(shì)。以新鮮配制的YInv和COS-Inv酶液(0 d)為對(duì)照,YInv和COS-Inv的質(zhì)量濃度均為2.0 mg/mL。

1.10 三維熒光光譜分析

用熒光光譜儀分析緩沖液中YInv和COS-Inv的三維熒光光譜,比較YInv和COS-Inv三維熒光光譜的差異。

1.11 YInv 和COS-Inv的動(dòng)力學(xué)測(cè)定

測(cè)定系列相應(yīng)底物濃度的0.05 mol/L 乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH 5.0)中YInv或COS-Inv的催化速度,以此繪制速度的倒數(shù)(1/v)對(duì)相應(yīng)的底物濃度的倒數(shù)(1/cS)的Lineweaver-Burk曲線,再根據(jù)YInv和COS-Inv的Lineweaver-Burk曲線分別計(jì)算其Vmax和Km。

2 結(jié)果與討論

2.1 試驗(yàn)樣品酶的純度鑒定

一般來(lái)說(shuō),化學(xué)修飾所用的酶應(yīng)是純酶,而鑒定酶純度的最重要方法就是PAGE法[30]。YInv及純化的COS-Inv純度鑒定的電泳結(jié)果見圖1,蛋白質(zhì)分子的泳動(dòng)方向是從負(fù)極向正極。由圖1可知:在1和2號(hào)泳道上只出現(xiàn)了一條蛋白條帶。由此表明,本研究用的YInv是純酶,可進(jìn)一步用于化學(xué)修飾、光譜分析、動(dòng)力學(xué)測(cè)試及氨基修飾率等實(shí)驗(yàn)。

1—YInv;2—純化的COS-Inv

2.2 化學(xué)修飾的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 反應(yīng)pH對(duì)修飾效果的影響結(jié)果

考察反應(yīng)pH對(duì)化學(xué)修飾后酶活的影響,結(jié)果如圖2所示。由圖2可知:當(dāng)修飾體系pH為4.0時(shí),修飾酶的比酶活最高;當(dāng)pH大于4.0時(shí),修飾酶的比酶活開始下降?？梢?適宜的化學(xué)修飾pH為4.0。方差分析結(jié)果(F=3 796.628)表明,各pH試驗(yàn)間的差異非常顯著。

圖2 反應(yīng)pH對(duì)化學(xué)修飾酶活的影響

2.2.2 反應(yīng)溫度對(duì)修飾效果的影響結(jié)果

考察反應(yīng)溫度對(duì)修飾酶活的影響,結(jié)果如圖3所示。由圖3可知:當(dāng)反應(yīng)溫度為20 ℃,此時(shí)修飾酶的比酶活最高,為332.76 U/mg,比對(duì)照YInv的高29.03%;隨著反應(yīng)溫度的升高或降低,修飾酶的比酶活都降低?？梢?適宜的反應(yīng)溫度為20 ℃。方差分析(F=775.21)結(jié)果表明,各溫度試驗(yàn)間的差異極顯著。

圖3 反應(yīng)溫度對(duì)化學(xué)修飾酶活的影響

2.2.3 COS劑量對(duì)化學(xué)修飾效果的影響結(jié)果

考察COS劑量對(duì)化學(xué)修飾酶活的影響,結(jié)果如圖4所示。由圖4可知:當(dāng)用20 mg COS修飾25 mg酶時(shí),修飾酶的比酶活最高;當(dāng)COS的劑量大于或小于20 mg時(shí),修飾酶的比酶活均有所降低?？梢?最適的COS劑量為20 mg。方差分析(F=516.8)結(jié)果表明,各劑量實(shí)驗(yàn)之間的差異極顯著。

2.2.4 蔗糖劑量對(duì)化學(xué)修飾效果的影響結(jié)果

考察蔗糖劑量對(duì)化學(xué)修飾酶活性的影響,結(jié)果如圖5所示。由圖5可知:當(dāng)蔗糖用量為0.85 g時(shí),修飾酶的比酶活(349.64 U/mg),比天然YInv的提高35.58%;當(dāng)蔗糖用量大于或小于0.85 g時(shí),修飾酶的比酶活降低?？梢?蔗糖的適宜劑量為0.85 g。方差分析(F=2 344.5)結(jié)果表明,各蔗糖用量實(shí)驗(yàn)間差異極顯著。

圖5 蔗糖劑量對(duì)化學(xué)修飾酶活的影響

2.2.5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)化學(xué)修飾效果的影響結(jié)果

考察反應(yīng)時(shí)間對(duì)化學(xué)修飾酶活性的影響,結(jié)果如圖6所示。由圖6可知:當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為6 h時(shí),修飾酶的比酶活為306.28 U/mg,比天然YInv的高18.76%;當(dāng)反應(yīng)時(shí)間大于或小于6 h時(shí),修飾酶的活性都有所降低?？梢?適宜的反應(yīng)時(shí)間為6 h。方差分析結(jié)果(F=767.28)表明,各反應(yīng)時(shí)間實(shí)驗(yàn)之間的差異極顯著。

圖6 反應(yīng)時(shí)間對(duì)化學(xué)修飾酶活性的影響

2.2.6 化學(xué)修飾最佳條件的確定

綜合以上結(jié)果可知最佳的修飾條件如下:pH為4,反應(yīng)溫度為20 ℃,COS劑量為20 mg,蔗糖劑量為850 mg,反應(yīng)時(shí)間為6 h。因此,在此最佳條件下進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

2.3 粗COS-Inv的提純與鑒定結(jié)果

DEAE-52纖維素離子交換層析法是分離蛋白質(zhì)的重要方法之一[31-32]。本研究用COS對(duì)YInv進(jìn)行化學(xué)修飾后,用DEAE-52纖維素陰離子柱層析純化所得到的粗修飾酶(粗COS-Inv),洗脫曲線如圖7所示。由圖7可知:COS-Inv洗脫曲線上有4個(gè)蛋白峰,最大比酶活峰與第3個(gè)蛋白峰重合;在第52管的比酶活最高,為759.38 U/mg;純化倍數(shù)為1.12(表1)。

表1 COS-Inv的純化參數(shù)

圖7 用DEAE-52纖維素柱層析純化COS-Inv的洗脫曲線

將第52管的分餾液用聚乙二醇濃縮后,再進(jìn)行PAGE分析,以鑒定COS-Inv的純度(見圖1中的泳道2)。由圖1可知:蛋白樣品在電泳過(guò)程中從負(fù)極遷移到正極,而且COS-Inv的遷移速度比YInv慢很多。這說(shuō)明COS-Inv的分子量大于YInv,即在修飾試驗(yàn)中,COS的糖鏈確實(shí)與酶分子的側(cè)鏈相連接,導(dǎo)致COS-Inv的分子量大于YInv?？梢?用COS對(duì)YInv的化學(xué)修飾是成功的。

2.4 化學(xué)修飾前后的酶活性變化

考察化學(xué)修飾前后的酶活性變化,結(jié)果見表2,方差分析結(jié)果見表3。由表2可知:修飾后COS-Inv的平均比酶活是YInv的3.003倍。由表3可知:YInv和COS-Inv比酶活之間的差異非常顯著。當(dāng)然,這些結(jié)果還可能受到一些因素的影響,但可以肯定的是,用COS進(jìn)行化學(xué)修飾確實(shí)可以提高酵母轉(zhuǎn)化酶的催化酶活。

表2 用COS修飾前后比酶活的變化

表3 YInv和COS-Inv比酶活的方差分析

2.5 化學(xué)修飾前后酶分子中糖的含量和氨基修飾率的變化

天然的轉(zhuǎn)化酶分子是一種糖蛋白[33-34]。因此,考察化學(xué)修飾前后酶分子糖含量和氨基修飾率的變化,結(jié)果見表4。由表4可知:YInv的糖含量為2.75 mg/mg,即2.75 mg糖與1 mg酶蛋白側(cè)鏈結(jié)合;經(jīng)修飾后COS-Inv的糖含量為6.34 mg/mg,即6.34 mg糖與1 mg酶蛋白結(jié)合,COS-Inv的糖含量是YInv的2.31倍,COS-Inv的氨基修飾率為49.4%。這表明在化學(xué)修飾中,COS的大量糖鏈連接到酶分子側(cè)鏈的氨基上。這就使COS-Inv的分子量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于YInv。由此可見,本研究中用COS對(duì)酵母轉(zhuǎn)化酶的化學(xué)修飾是非常成功的。

表4 YInv和COS-Inv的糖含量和氨基修飾率的對(duì)比

2.6 YInv 和COS-Inv的動(dòng)力學(xué)參數(shù)

Km值的大小反映酶對(duì)底物的親和力,Km值大,表示酶對(duì)底物的親和力小,對(duì)酶促反應(yīng)不利;而Km值小,就表示酶對(duì)底物的親和力大,對(duì)酶促反應(yīng)有利[35-36]。因此,以蔗糖為底物,在50 ℃、pH為5.0條件下,測(cè)定YInv和COS-Inv的催化動(dòng)力學(xué),結(jié)果見圖8。根據(jù)圖8的結(jié)果計(jì)算得到,YInv的Km和Vmax分別為125.45 mmol/L和1 512.4 μmol/mg;而COS-Inv的Km和Vmax分別為58.92 mmol/L和1 352.4 μmol/mg。

圖8 YInv和COS-Inv的Lineweaver-Burk曲線

綜上可見,經(jīng)化學(xué)修飾后酶的Km值大大下降,這說(shuō)明修飾后COS-Inv對(duì)底物的親和力比YInv大大增強(qiáng)。這也可以解釋為什么COS-Inv的比酶活遠(yuǎn)高于YInv。

2.7 YInv 和COS-Inv的貯存穩(wěn)定性分析結(jié)果

將YInv和COS-Inv溶液(2.0 mg/mL)分別放置于室溫(25 ℃)和冰箱(4 ℃)保存,每天檢測(cè)酶的酶活,考察酶活的變化,結(jié)果見圖9。由圖9可知:在室溫和冰箱的條件下,YInv的酶活都迅速下降,1 d后,YInv的殘留比酶活分別為39.77%(室溫)和72.74%(冰箱);第3 天時(shí),YInv的活性基本消失;而COS-Inv在第3天的殘留比酶活分別為83.95%(室溫)和94.74%(冰箱),保存4 d后,COS-Inv的殘留比酶活分別為30.75%(室溫)和42.60%(冰箱)。由此可見,用COS進(jìn)行化學(xué)修飾后,COS-Inv的貯存穩(wěn)定性有了很大的提高。

圖9 YInv和COS-Inv在貯存期間的比酶活性

2.8 YInv 和COS-Inv的三維熒光光譜

三維熒光光譜法是研究蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的非常重要的方法[37]。這種方法能夠較直觀地表明Trp、Tyr和Phe這3種氨基酸殘基在蛋白質(zhì)分子中的微環(huán)境及其在不同條件下的構(gòu)象變化[38-40],這3種氨基酸導(dǎo)致蛋白質(zhì)在270～300 nm處有吸收。但是不同的蛋白質(zhì)分子其熒光峰位置和熒光強(qiáng)度不同,這主要是決定于其分子中Trp、Tyr和Phe這3種氨基酸殘基的數(shù)量及其在分子的立體結(jié)構(gòu)中的裸露程度。正常情況下,蛋白質(zhì)分子都有其特定的熒光特性,但當(dāng)這種蛋白質(zhì)分子受某種因素影響且構(gòu)象發(fā)生較大變化時(shí),其熒光特性就會(huì)相應(yīng)改變。由此可知,若2個(gè)蛋白質(zhì)分子的熒光特性差異較大,就說(shuō)明這2種蛋白質(zhì)分子的立體結(jié)構(gòu)(構(gòu)象)差異較大。

圖10為YInv和COS-Inv熒光光譜的平面三維等高線圖。橫坐標(biāo)為發(fā)射波長(zhǎng)(Em,200～400 nm),縱坐標(biāo)為激發(fā)波長(zhǎng)(Ex,200～400 nm)。平面上的點(diǎn)代表由2個(gè)波長(zhǎng)共同決定的樣品的熒光強(qiáng)度。將相等熒光強(qiáng)度的點(diǎn)連接起來(lái),在Em-Ex所構(gòu)成的平面上繪制出由一系列等熒光強(qiáng)度線組成的等高線,等高線越密,熒光強(qiáng)度越強(qiáng)。由圖10可知:YInv有2個(gè)激發(fā)波長(zhǎng),這2個(gè)波長(zhǎng)分別為234和280 nm,形成2個(gè)熒光峰;COS-Inv也有2個(gè)激發(fā)波長(zhǎng),這兩個(gè)波長(zhǎng)分別是232和280 nm,也形成2個(gè)熒光峰。雖然YInv的激發(fā)波長(zhǎng)形成的熒光峰與COS-Inv的差異不是很大,但YInv的熒光強(qiáng)度比COS-Inv的強(qiáng)得多,因?yàn)閅Inv的等高線比COS-Inv的密得多。由此可以確定,COS-Inv與YInv是2種具有差異相當(dāng)大的三維分子結(jié)構(gòu),即用COS修飾YInv后,由于COS的糖鏈連接到酶分子側(cè)鏈的氨基上,所得到的COS-Inv的三維結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯改變,Trp、Tyr和Phe氨基酸殘基部分被糖鏈覆蓋,導(dǎo)致COS-Inv分子的熒光強(qiáng)度明顯下降。三維結(jié)構(gòu)改變可能使底物更容易接近酶的活性中心,這樣就導(dǎo)致COS-Inv對(duì)底物的親和力升高,最終的催化活性明顯提升。這可能是化學(xué)修飾后COS-Inv催化活性大大提高的主要原因。這是根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果和相關(guān)現(xiàn)象作出的判斷,但是更清晰的作用機(jī)制則有待進(jìn)一步研究來(lái)證實(shí)。

3 結(jié)論

用COS修飾酵母轉(zhuǎn)化酶,電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果和氨基修飾率的試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明,本研究的修飾試驗(yàn)是成功的,且修飾酶(COS-Inv)的比酶活比原酶(YInv)的提高了200.3%。動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果表明,YInv和COS-Inv的Km分別為125.45和58.92 mmol/L。這意味著修飾后的COS-Inv與底物的親和力大大增強(qiáng),這正是修飾酶活性大大提高的原因。

三維熒光光譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,YInv的熒光強(qiáng)度比COS-Inv的強(qiáng)得多。這說(shuō)明經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾后,COS-Inv的三維分子結(jié)構(gòu)發(fā)生了較大的變化。酶分子三維結(jié)構(gòu)改變就會(huì)引起催化活性的改變,這也許可以解釋COS-Inv的催化活性遠(yuǎn)高于YInv的原因。

綜上可知:用COS修飾酵母轉(zhuǎn)化酶后,COS的糖鏈連接到酶分子側(cè)鏈的氨基上,不僅使修飾酶(COS-Inv)的分子量明顯增加,而且導(dǎo)致其立體結(jié)構(gòu)大大改變,進(jìn)而提高了酶分子對(duì)底物的親和力,最終使修飾酶的催化活性得到大大提高。