唐 艷,高 鵬,吳 濤,2

(1.通遼梅花生物科技有限公司,內(nèi)蒙古 通遼 028024;2.廊坊梅花生物技術(shù)開發(fā)有限公司,河北 廊坊 065001)

乙酰輔酶A(Acetyl coenzyme A,acetyl-CoA)作為人體內(nèi)重要的化學(xué)物質(zhì),是生物體能源物質(zhì)代謝過程中產(chǎn)生的一種重要的中間代謝產(chǎn)物[1-2]。乙酰輔酶A是脂肪酸的β-氧化及糖酵解產(chǎn)生的丙酮酸氧化脫羧的產(chǎn)物[3-4],在許多代謝過程中起著關(guān)鍵作用。糖、脂肪和蛋白質(zhì)3種主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)通過乙酰輔酶A匯聚成一條共同的代謝途徑[5],在線粒體內(nèi)進(jìn)行三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化,氧化生成CO2和H2O,釋放ATP[6-7],乙酰輔酶A是重要的中心碳代謝分子,主要在細(xì)胞核組蛋白乙?；⒓?xì)胞質(zhì)丙酮酸脫氫酶支路、線粒體三羧酸循環(huán)和過氧化物酶體乙醛酸循環(huán)中參與代謝過程[8-10]。乙酰輔酶A可作為釀酒酵母[11-13],也具有延緩衰老和抗癌的功效[14-16]。

目前,國內(nèi)外關(guān)于發(fā)酵液中乙酰輔酶A殘留檢測(cè)的報(bào)道非常少。早期的檢測(cè)方法也相當(dāng)復(fù)雜,通常都是采用輔酶A和?；o酶A的化學(xué)或酶法衍生法測(cè)定[17],有報(bào)道用氣質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)乙酰輔酶A的殘留[18],然而該方法略顯繁瑣,要求乙酰輔酶A水解、衍生,影響了測(cè)定的準(zhǔn)確性。目前,國內(nèi)有利用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)對(duì)植物組織中的乙酰輔酶A定量的報(bào)道[19],然而利用HPLC測(cè)定發(fā)酵液中乙酰輔酶A在國內(nèi)少有報(bào)道[20]。本研究的目的是建立一種快速、準(zhǔn)確定量檢測(cè)氨基酸中乙酰輔酶A的高效液相色譜法,為發(fā)酵液代謝副產(chǎn)物研究提供技術(shù)支持。在發(fā)酵代謝過程中,乙酰輔酶A起著重要作用,然而對(duì)其成分是否殘留于發(fā)酵液中并無明確的判斷,因此筆者建立了液相色譜方法,以定量檢測(cè)發(fā)酵液中是否存在乙酰輔酶A。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實(shí)驗(yàn)儀器:高效液相色譜儀1200,美國Agilent Technologies公司;電子天平(精度±0.000 01 g)、pH計(jì),梅特勒托利多公司;Mili-Q超純水機(jī),默克密理博公司;離心機(jī),默克Sigma-Aldrich公司;真空泵,上海津騰公司。

材料試劑:乙酰輔酶A的標(biāo)準(zhǔn)品,默克Sigma-Aldrich公司;乙腈,色譜純,德國Meker公司;磷酸鈉,分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;磷酸,分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 對(duì)照品溶液的制備

準(zhǔn)確配制濃度為10 μmol/L的乙酰輔酶A標(biāo)準(zhǔn)溶液作為儲(chǔ)備液,分別吸取0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 mL的儲(chǔ)備液,補(bǔ)加入0.9,0.8,0.6,0.4,0.2,0.0 mL的超純水,充分混勻,配制成濃度為1.0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0 μmol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液用作對(duì)照品溶液。

1.2.2 供試品溶液的制備

將不同品種氨基酸發(fā)酵液離心,得到上清液。分別取脯氨酸、谷氨酰胺、異亮氨酸、亮氨酸、谷氨酸、色氨酸和纈氨酸發(fā)酵液,以12 000 r/min離心3 min,得到上清液,精密量取1 mL上清液于10 mL容量瓶中,定容,搖勻,得到供試品溶液,用0.22 μm濾膜過濾,備用。

1.2.3 色譜條件

色譜柱采用安捷倫Polaris 5 C18-A(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相A為40 mmol/L的磷酸鈉水溶液,用磷酸調(diào)pH=5,流動(dòng)相B為V(40 mmol/L的磷酸鈉溶液)∶V(乙腈)=800∶200的混合溶液,流速為1 mL/min,紫外波長(zhǎng)為254 nm,進(jìn)樣量為10 μL,溫度25 ℃,梯度洗脫。按照該條件操作,對(duì)照品及供試品的分離效果較好,峰型良好。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法學(xué)討論

2.1.1 流動(dòng)相濃度的選擇

分別選擇濃度為20,40,100,200,400 mmol/L的磷酸鈉緩沖鹽作為流動(dòng)相A開展實(shí)驗(yàn)。當(dāng)流動(dòng)相濃度為40,100,200,400 mmol/L時(shí),峰型較好,濃度大時(shí)會(huì)降低色譜柱壽命,浪費(fèi)成本;當(dāng)流動(dòng)相濃度為20 mmol/L時(shí),峰型略差:流動(dòng)相濃度為40 mmol/L時(shí),既不影響檢測(cè)結(jié)果,又能節(jié)省成本,故選擇40 mmol/L的流動(dòng)相進(jìn)行色譜分離,色譜峰圖如圖1所示。

圖1 對(duì)照品峰圖Fig.1 Peak diagram of reference substance

2.1.2 流動(dòng)相混合比例的選擇

流動(dòng)相B為磷酸鈉緩沖鹽與乙腈的混合液,分別選取V(磷酸鈉溶液)∶V(乙腈)為900∶100,800∶200,700∶300,600∶400,500∶500的混合溶液進(jìn)行色譜分離。由于流動(dòng)相極性不同,出峰時(shí)間與峰型均不同,只有體積比為800∶200時(shí),分離度較好,峰型也較好,因此選用V(磷酸鈉溶液)∶V(乙腈)=800∶200作為流動(dòng)相B。以色氨酸發(fā)酵液為例,色譜峰圖如圖2所示。

1—未知雜峰;2—色氨酸;3—乙酰輔酶A。

2.1.3 梯度洗脫的確定

筆者采用梯度洗脫的方法,在實(shí)驗(yàn)過程中考察了流動(dòng)相A與流動(dòng)相B的比例對(duì)乙酰輔酶A的分離度、靈敏度和色譜峰型的影響。經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,得出結(jié)論:經(jīng)流動(dòng)相A與流動(dòng)相B不同比例梯度洗脫30 min,均能將所有物質(zhì)分離出來,且峰型較好,梯度洗脫程序如表1所示。

表1 梯度洗脫條件

2.1.4 檢出限和定量限

根據(jù)流動(dòng)相中樣品組分在檢測(cè)器上峰高與噪聲峰高的比值S/N來確定檢出限和定量限。先在空白樣品中加入較低濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品,然后將樣品稀釋成不同的濃度進(jìn)行測(cè)定,以S/N為3,10時(shí)對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度來分別確定檢出限和定量限。通過對(duì)一系列濃度試樣的測(cè)試,最終獲得符合要求的濃度,檢出限和定量限分別為0.50,0.53 mg/L。

2.1.5 精密度、重復(fù)性和回收率

取色氨酸發(fā)酵液,用筆者方法對(duì)其進(jìn)行6次重復(fù)測(cè)定,檢測(cè)結(jié)果見表2。由表2可知:變異系數(shù)較小(<1%),表明筆者方法不僅精密度高,而且具有良好的重現(xiàn)性。

表2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對(duì)已知濃度的乙酰輔酶A,同一樣品平行取樣5次,分別以50%,100%,200%,300%,400%進(jìn)行5個(gè)水平的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn),結(jié)果如表3所示,此方法測(cè)定乙酰輔酶A濃度的加標(biāo)回收率為98.5%～102%。

表3 樣品加標(biāo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.6 線性關(guān)系考察

配制10 μmol/L乙酰輔酶A的標(biāo)準(zhǔn)溶液,再分別吸取0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 mL溶液,加入0.9,0.8,0.6,0.4,0.2,0.0 mL的蒸餾水,配制成濃度分別為1,2,4,6,8,10 μmol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。按照上述方法進(jìn)行測(cè)定,以乙酰輔酶A濃度x為橫坐標(biāo),峰面積y為縱坐標(biāo),繪制線性回歸方程,結(jié)果表明其線性回歸較好,其中R2=1.000 0,y=11.416 5x-26.284 2,標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所示。

圖3 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.3 Standard curve

2.2 發(fā)酵液中乙酰輔酶A的測(cè)定

取不同品種的氨基酸發(fā)酵液Pro,Gln,Ile,Leu和Trp,以12 000 r/min離心3 min,得到上清液,量取1 mL上清液于10 mL容量瓶中,定容,搖勻,采用該方法測(cè)定發(fā)酵液中乙酰輔酶A濃度,結(jié)果如表4所示。乙酰輔酶A是代謝中間產(chǎn)物,一般情況下不會(huì)分泌到胞外,并且該產(chǎn)物不穩(wěn)定,一般以鈉鹽的形式存在,發(fā)酵液中的乙酰輔酶A的濃度很低,為0.000 7～0.001 2 μmol/mL。

表4 發(fā)酵液中乙酰輔酶A檢測(cè)結(jié)果

2.3 不同方法的對(duì)比

將筆者方法與常規(guī)檢測(cè)方法乙酰輔酶A檢測(cè)試劑盒分析方法進(jìn)行對(duì)比,筆者方法的精密度比試劑盒法高,兩種方法檢測(cè)不同氨基酸發(fā)酵液結(jié)果偏差約為0.000 2 μmol/mL,具體結(jié)果如表5所示。

表5 不同方法檢測(cè)乙酰輔酶A濃度結(jié)果對(duì)比

2.4 細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞外乙酰輔酶A濃度的對(duì)比

取不同氨基酸發(fā)酵液進(jìn)行細(xì)胞破碎,使胞內(nèi)的乙酰輔酶A釋放,以12 000 r/min離心3 min,去除雜質(zhì),得到清液。取不同氨基酸發(fā)酵液,直接以12 000 r/min離心3 min,得到上清液。將兩種清液分別采用筆者方法檢測(cè)乙酰輔酶A的濃度,結(jié)果如表6所示。由表6可知:乙酰輔酶A在細(xì)胞內(nèi)存在,在胞外存在量較少。筆者方法能有效地檢測(cè)出細(xì)胞內(nèi)外乙酰輔酶A濃度。

表6 不同發(fā)酵液細(xì)胞內(nèi)外乙酰輔酶A檢測(cè)結(jié)果對(duì)比

3 結(jié) 論

筆者建立的乙酰輔酶A的檢測(cè)方法能有效地檢測(cè)發(fā)酵液中乙酰輔酶A的濃度。液相色譜法以Polaris 5 C18-A為色譜柱,流動(dòng)相A為40 mmol/L的磷酸鈉水溶液,流動(dòng)相B為V(40 mmol/L磷酸鈉溶液)∶V(乙腈)=800∶200,梯度洗脫,流速為1.0 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:筆者方法的出峰時(shí)間為18 min,線性回歸系數(shù)R2=1,加標(biāo)回收率為99.5%,與常規(guī)檢測(cè)方法乙酰輔酶A檢測(cè)試劑盒分析方法相比,該方法偏差較小,約為0.000 2 μmol/mL。