周少丞 毛琦淇 季曉春 滕偉峰 張佳男

根據(jù)WTO 國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)發(fā)布的2020 年全球癌癥數(shù)據(jù)報(bào)告，乳腺癌的新發(fā)病例數(shù)正迅速增加，已超越肺癌，成為全球首位。此外，乳腺癌的死亡病例數(shù)也位居世界之首，突顯了其對(duì)全球公共衛(wèi)生的重大挑戰(zhàn)[1]。近年來(lái)，在全球范圍內(nèi)已開(kāi)展了大量關(guān)于乳腺癌發(fā)病潛在機(jī)制的研究。針對(duì)乳腺癌包括手術(shù)、化療、內(nèi)分泌治療、靶向治療等在內(nèi)的綜合診療水平不斷提高。但是，仍有部分患者出現(xiàn)耐藥、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移，患者的生存率顯著降低、預(yù)后不良。因此，需要尋找一種新的抗乳腺癌治療策略。腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移本質(zhì)上依賴(lài)于細(xì)胞骨架蛋白的機(jī)械運(yùn)動(dòng)。通過(guò)前期研究發(fā)現(xiàn)，LAD1 作為一個(gè)細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白，在腫瘤的發(fā)生及發(fā)展中起到重要作用。有基因組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，LAD1 蛋白在基底細(xì)胞樣和三陰性乳腺癌中表達(dá)，提示LAD1 與乳腺癌的惡性程度相關(guān)，其高表達(dá)可提示患者預(yù)后不良[2-3]。且有研究報(bào)道提示，LAD1 在喉癌、口腔鱗癌中表達(dá)，并在腫瘤的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[4]。因此，本文將探究LAD1 作為一個(gè)骨架相關(guān)蛋白，在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中是否起重要作用。

1 材料和方法

1.1 LAD1在不同腫瘤中的表達(dá)差異分析 通過(guò)TIMER 2.0數(shù)據(jù)庫(kù)（http://timer.cistrome.org/）[5]，類(lèi)型選擇“LAD1”，分析LAD1 在不同癌癥組織中的差異表達(dá)。

1.2 乳腺組織樣本收集 登陸癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Altas，TCGA）在線(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)（https://portal.gdc.cancer.gov/），篩選條件：（1）Primary Site: Breast；（2）Program: 人類(lèi)腫瘤基因組（the cancer genome altas，TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)下載；（3）Project: TCGA-BRCA；（4）Disease Type: ductal and lobular neoplasms；（5）Data Category:transcriptome profiling；（6）Data Type: Gene Expression Quantification。

1.3 LAD1 mRNA 表達(dá)水平差異分析 利用TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)分析LAD1 mRNA 在乳腺癌腫瘤組織樣本和正常乳腺組織樣本中的表達(dá)差異。

1.4 LAD1 蛋白表達(dá)水平驗(yàn)證 利用人類(lèi)蛋白質(zhì)質(zhì)譜查詢(xún)網(wǎng)站（www.proteinatlas.org）檢索LAD1 蛋白在乳腺癌組織和正常乳腺組織中的表達(dá)差異。

1.5 樣本組織中浸潤(rùn)免疫細(xì)胞比例分析 采用CIBERSORT 算法推斷每個(gè)樣本組織的22 種免疫細(xì)胞的相對(duì)比例[6-7]。

1.6 京都基因和基因數(shù)據(jù)庫(kù)（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析 利用“clusterProfiler”和“ggplot2”軟件包對(duì)樣本進(jìn)行KEGG 富集分析。

2 結(jié)果

2.1 LAD1 蛋白在乳腺癌組織中高表達(dá) 通過(guò)TIMER 2.0 數(shù)據(jù)庫(kù)分析，LAD1 蛋白在乳腺癌組織中表達(dá)明顯高于乳腺正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 LAD1 蛋白在泛癌中的表達(dá)水平

2.2 LAD1 mRNA 在乳腺癌組織與正常乳腺組織中表達(dá)的比較 通過(guò)對(duì)TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)的數(shù)據(jù)挖掘，收集得到轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)樣本共1 182 例，其中乳腺癌樣本1 070例，正常乳腺組織樣本112 例。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)提示，與正常乳腺組織比較，LAD1 mRNA 在乳腺癌組織中高表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖2。

圖2 LAD1 mRNA 在乳腺癌組織及正常乳腺組織中的表達(dá)水平（A：乳腺癌組織及正常乳腺組織中LAD1 mRNA 表達(dá)水平比較，與正常乳腺組織比較，aP＜0.01；B：乳腺癌組織及正常乳腺組織中LAD1 mRNA 表達(dá)水平比較，與正常乳腺組織比較，aP＜0.05）

2.3 LAD1 mRNA 在不同年齡、性別患者中的比較通過(guò)TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)分析介于65 歲上下患者及女性和男性乳腺癌中LAD1 mRNA 的表達(dá)水平差異。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于年齡＞65 歲患者，LAD1 mRNA 在≤65歲患者中表達(dá)更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖3A。而在女性和男性乳腺癌患者中，LAD1 mRNA的表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖3B。

圖3 LAD1 mRNA 在乳腺癌中的表達(dá)水平（A：不同年齡患者LAD1 mRNA 表達(dá)水平比較，aP＜0.05；B：不同性別患者LAD1 mRNA表達(dá)水平比較）

2.4 免疫組化染色結(jié)果 通過(guò)人類(lèi)蛋白質(zhì)譜查詢(xún)網(wǎng)站（www.proteinatlas.org），檢索乳腺癌組織和正常乳腺組織LAD1 蛋白的免疫組化染色結(jié)果，可見(jiàn)乳腺癌病理組織中LAD1 蛋白的表達(dá)高于正常乳腺組織，見(jiàn)圖4。

圖4 LAD1 蛋白在乳腺癌組織和正常乳腺組織中的表達(dá)（A：乳腺癌組織中LAD1 蛋白的表達(dá)情況；B：正常乳腺組織中LAD1 蛋白的表達(dá)情況）

2.5 LAD1 的表達(dá)與乳腺癌中浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞之間的相關(guān)性 本研究使用CIBERSORT 算法計(jì)算低風(fēng)險(xiǎn)和高風(fēng)險(xiǎn)隊(duì)列之間免疫細(xì)胞分?jǐn)?shù)的比較。結(jié)果顯示，高表達(dá)LAD1 基因在乳腺癌免疫微環(huán)境中與M2 型巨噬細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞細(xì)胞靜息、嗜酸性粒細(xì)胞的表達(dá)呈正相關(guān)，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。高表達(dá)LAD1 基因與記憶性B 細(xì)胞、初始B 細(xì)胞和漿細(xì)胞的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)圖5（封三）。

圖5 腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞的變化（A：使用CIBERSORT 算法計(jì)算低風(fēng)險(xiǎn)和高風(fēng)險(xiǎn)組之間免疫細(xì)胞分?jǐn)?shù)；B：京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫(kù)富集分析低風(fēng)險(xiǎn)和高風(fēng)險(xiǎn)組之間免疫細(xì)胞分?jǐn)?shù)）

3 討論

惡性腫瘤容易出現(xiàn)細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，這是導(dǎo)致其難治性的最主要原因[8]。細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移本質(zhì)上依賴(lài)于細(xì)胞骨架蛋白的機(jī)械運(yùn)動(dòng)。LAD1作為一個(gè)細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白，其蛋白分子量約59 kD，在脊椎動(dòng)物物種中不保守，而且在無(wú)脊椎動(dòng)物中不存在，這表明它的起源較晚[9]。LAD1 蛋白首先是從小鼠皮膚cDNA 文庫(kù)中克隆得到，編碼的蛋白除了包含一個(gè)精氨酸和6 個(gè)絲氨酸-谷氨酸（SEK）三肽結(jié)構(gòu)域外，沒(méi)有其他結(jié)構(gòu)域可以識(shí)別。

本研究通過(guò)TIME 2.0 數(shù)據(jù)庫(kù)分析得到LAD1 蛋白在乳腺癌組織中高表達(dá)。已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，在對(duì)EGF 刺激的乳腺細(xì)胞系進(jìn)行研究分析后，發(fā)現(xiàn)LAD1蛋白在EGF 激活的ERK 信號(hào)通路中起到了關(guān)鍵的作用。不僅其蛋白表達(dá)量有所增加，LAD1 蛋白還經(jīng)歷了結(jié)構(gòu)性修飾。此外，LAD1 蛋白與其他關(guān)鍵的細(xì)胞骨架蛋白，如肌動(dòng)蛋白actin，協(xié)同工作，共同調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。這一發(fā)現(xiàn)揭示了LAD1 在乳腺癌進(jìn)展中扮演了至關(guān)重要的角色[10]。相關(guān)研究指出，在某些腫瘤中，Akt 和ERK 存在異常的磷酸化現(xiàn)象[11-12]。LAD1 不僅能與F-actin 形成復(fù)合體，還可以調(diào)節(jié)下游的Akt 和ERK 的磷酸化狀態(tài)。這種調(diào)節(jié)作用進(jìn)一步影響癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力[10]。根據(jù)以上已有的研究，LAD1 蛋白可通過(guò)影響重要信號(hào)通路等方式影響乳腺癌的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移。

腫瘤微環(huán)境作為腫瘤免疫研究當(dāng)中最為重要環(huán)節(jié)，腫瘤微環(huán)境中的腫瘤細(xì)胞與免疫細(xì)胞相互通，影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移。趨化因子是一組可溶性，大小約為8～14 kDa 的小分子蛋白，是天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分[13]。它可以通過(guò)與細(xì)胞表面G 蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合，發(fā)揮生物學(xué)相關(guān)作用，如刺激各類(lèi)白細(xì)胞的定向和（或）非定向遷移。在腫瘤微環(huán)境中，趨化因子可以由腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞分泌，分泌的趨化因子和細(xì)胞表面受體結(jié)合可激活多種信號(hào)途徑，并募集免疫細(xì)胞亞群進(jìn)入腫瘤微環(huán)境中[14]。有研究提示，乳腺癌細(xì)胞株MCF-7 和T47D 產(chǎn)生的CCL5 可以自分泌方式直接或間接通過(guò)刺激基質(zhì)金屬蛋白酶9 的表達(dá)等途徑促進(jìn)腫瘤的發(fā)展[15]。本團(tuán)隊(duì)對(duì)乳腺癌TCGA 數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)的分析發(fā)現(xiàn)，LAD1 與腫瘤微環(huán)境中的M2 型巨噬細(xì)胞的表達(dá)呈正相關(guān)。M2 型巨噬細(xì)胞在誘導(dǎo)血管生成、限制免疫反應(yīng)和組織修復(fù)方面起著關(guān)鍵作用。一旦外周血中的單核細(xì)胞被招募到腫瘤部位，腫瘤微環(huán)境下可以迅速將單核細(xì)胞分化成TAMs。因此推測(cè)，LAD1 是否可以通過(guò)調(diào)節(jié)乳腺癌某種趨化因子，募集得到M2 型巨噬細(xì)胞，間接影響乳腺癌的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移。

LAD1 蛋白在乳腺癌的發(fā)展中起到了重要的角色。它不僅參與了EGF 激活的ERK 信號(hào)通路，還影響了細(xì)胞骨架蛋白的動(dòng)態(tài)調(diào)控和與Akt 和ERK 的磷酸化狀態(tài)，從而調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。此外，腫瘤微環(huán)境中的交互作用對(duì)于腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移也具有關(guān)鍵意義。趨化因子在腫瘤微環(huán)境中扮演了重要的角色，能夠影響免疫細(xì)胞的活性和遷移。特別地，LAD1 與腫瘤微環(huán)境中的M2 型巨噬細(xì)胞呈正相關(guān)，這些細(xì)胞在腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和免疫逃逸中起到了關(guān)鍵作用?？傊?，LAD1 蛋白和腫瘤微環(huán)境的相互作用為乳腺癌的治療提供了新的機(jī)制和潛在的治療靶點(diǎn)。