李志情, 孫文昊, 韋玉連, 聶莎, 唐耀平,4*

(1.廣西中醫(yī)藥大學瑞康臨床醫(yī)學院, 南寧 530200; 2.廣西中醫(yī)藥大學附屬瑞康醫(yī)院, 心血管內科, 南寧 530011; 3.南方醫(yī)科大學中西醫(yī)結合醫(yī)院, 廣州 510315; 4.廣西高發(fā)傳染病中西醫(yī)結合轉化醫(yī)學重點實驗室, 南寧 530200)

隨著生活條件不斷改善,人類心血管危險事件發(fā)生率不斷升高,動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是心血管危險事件發(fā)生的病理基礎,多侵犯于冠狀動脈、腦動脈、腎動脈、腸系膜動脈、下肢動脈等部位,可引起心絞痛、心肌梗死、腦梗死、腦出血、頑固性高血壓病、麻痹性腸梗阻、間歇性跛行等疾病[1-2]。AS的病因多與吸煙、嗜酒、重鹽重油飲食、高血壓病、糖尿病、高血脂癥等生活習慣和疾病相關,其發(fā)病機制與炎性反應、內皮損傷、氧化應激、脂質浸潤、細胞凋亡、血小板聚集等密切關聯[3-4]。AS由血管內皮損傷來啟動,血小板進一步促進損傷,在AS的發(fā)病中發(fā)揮著重要作用[5-6]。目前臨床上治療多以西藥治療為主,常用他汀類、利尿劑、血管緊張素轉化酶抑制劑(ACEI)、血管緊張素受體拮抗劑(ARB)、雙胍類等藥物調節(jié)血脂水平、降低血壓、控制血糖,同時調整生活飲食習慣,加強運動鍛煉等。但西醫(yī)治療雖有一定療效,但不良反應多,難以長期堅持,出血風險性高,停藥后容易病情反復[7-8]。

中醫(yī)以整體觀為指導,多層次、多靶位的作用于AS,具有獨特優(yōu)勢[9]。由于AS斑塊涉及內皮細胞、血小板、巨噬細胞、平滑肌細胞等,客觀上需要中醫(yī)在微觀施治方面進行深入研究。文獻[10-12]表明,中醫(yī)復方可以通過抗血小板聚集發(fā)揮抗AS作用,但對其中發(fā)揮核心作用的藥對,尤其是角藥(三味藥的組合)未有深入探索。隨著信息科學技術的不斷發(fā)展,數據挖掘與網絡藥理學技術在中藥復方配伍分析的運用越來越多,相關技術逐漸成熟[13-14]。

現通過數據挖掘和網絡藥理學方式評價干預血小板聚集抗AS的中藥復方,找出并分析核心角藥組合,闡明其與疾病相關的潛在靶位以及信息通道,為優(yōu)化組方和深入研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究資料

所用文獻主要源于中國知網,以“動脈粥樣硬化、粥樣硬化、抗血小板聚集、血小板、凝血功能、凝血、中藥復方、方、湯”等為主題詞進行檢索,檢索時限均為建庫起至2022年7月8日,初檢出269篇相關文獻,從中整理出通過干預血小板聚集抗動脈粥樣硬化的方劑及其藥物組成,最后篩選出50個中藥復方,涉及109味中藥。

1.2 處方篩選

利用中醫(yī)傳承系統 (V2.5)統計納入藥物性味歸經分析。將其結果在 Excel 2010軟件中詳細列出。通過IBM SPSS Statistics 25及IBM SPSS Modeler18統計軟件對藥物數據進行內在聯系、規(guī)律以及群集分析。

1.2.1 納入標準

(1)中醫(yī)方劑或中西醫(yī)結合通過干預血小板聚集抗 AS 的相關文獻(文獻中有中藥方劑者)。

(2)完整說明方劑具體內容。

(3)具有明確療效標準的基礎研究。

(4)湯劑、丸劑、散劑、膠囊、注射液等劑型均可(文獻中有中藥具體組成)。

1.2.2 排除標準

(1)方中方藥組成不完整。

(2)重復的文獻及組方只納一次(兩方合用者除外)。

(3)臨床觀察研究。

(4)名家經典醫(yī)案、經驗探討等。

1.2.3 篩選結果

初檢得到269篇文獻,按照納入以及排除標準最終選得60篇文獻,刪除重復方劑,總結歸納出方劑50首。

1.3 中藥名稱規(guī)范

本次研究所運用的中藥名稱均參考《中國藥典》[15]、《中藥學》[16]進行規(guī)范處理,以避免系統對藥物分析產生誤差,其中將川牛膝、懷牛膝、姜半夏、法半夏、生甘草、炙甘草等藥物均分別統稱為牛膝、半夏、甘草。

1.4 核心角藥及疾病相關靶點的收集與篩選

將上述得出的核心藥對輸入 TCMSP 數據庫,找出其活性化合物以及藥物的作用靶位,導入 Excel 2010表進行備用。運用 UniProt數據庫,設置物種為人,同時根據標準名稱校正靶點蛋白。采用 Venny軟件得出角藥與疾病的關鍵靶位。利用 Cytoscape 3.7.1 軟件獲取核心角藥與疾病交集靶位并構建網絡圖。

1.5 PPI網絡分析與核心靶點篩選

運用STRING數據庫和Cytoscape 軟件構建蛋白互作的網絡圖(protein-protein interaction,PPI),設置蛋白類型為“人”,獲得蛋白之間的關系。按度(degree)值大小最終篩選出核心靶位。其中degree 值通過節(jié)點大小體現,綜合值(combined score)通過邊的粗細直觀表現。

1.6 GO KEGG功能富集分析

GO KEGG富集分析選擇在metascape數據庫中進行,為預測核心角藥干預血小板聚集抗動脈粥樣硬化的生物過程(biological process,BP)、分子功能(molecularfunction,MF)、細胞組分(cellular component,CC)、KEGG通路。

2 結果

2.1 數據挖掘結果

2.1.1 藥物性味歸經分析

運用中醫(yī)傳承輔助平臺(V2.5)得出藥物四氣為溫、熱性藥120次,寒、涼性96次,平性48次。五味以苦味藥150次,甘味120次,辛味90次。歸經以入肝經150次,入脾經140次,入心經136次(圖1～圖3)。

圖1 四氣統計雷達圖Fig.1 Statistical radar chart of four gases

圖3 歸經統計雷達圖Fig.3 Warp statistic radar chart

2.1.2 藥物關聯規(guī)則分析

利用IBM SPSS Modeler18.0軟件對藥物進行內在聯系、規(guī)律分析,將最低支持度和置信度設定為 20%和85%,最大前項數限定為 5,共得出32組核心角藥,去除藥對,最終得出核心角藥24組,依據置信度、支持度選出居前3位者為“川芎-桃仁-紅花、紅花-桃仁-川芎、紅花-桃仁-當歸”(表 1)。進一步用網絡圖進行展示,藥物之間連線的粗細和顏色的深淺說明兩者間密切程度。其結果顯示,當歸、桃仁、紅花、丹參、連翹關聯程度最高,關系最為密切(圖4)。

表1 藥物關聯規(guī)則分析Table 1 Analysis of drug association rules

圖4 藥物關聯度網絡圖Fig.4 Drug association degree network diagram

2.1.3 藥物聚類分析

采用IBM SPSS Statistics 25系統對前20個藥物進行聚類分析分成4類(表2),聚類分析樹狀圖如圖5所示。

表2 聚類分析Table 2 Cluster analysis

圖5 聚類分析樹狀圖Fig.5 Dendrogram of cluster analysis

2.2 網絡藥理學結果

2.2.1 核心角藥與疾病相關靶點的篩選

選擇中藥系統藥理學數據庫與分析平臺,對生物利用度(oral bioavailability,OB)限定為≥30%,對類藥性(drug like,DL)限定為≥0.18,獲取核心角藥“川芎、紅花、桃仁”的藥物成分及潛在靶點的信息,將核心藥物的有效成分及靶點導入Excel 2010,去重整合后結果如下:川芎、紅花、桃仁分別包含6、13、19種成分; 42、436、139個靶位。運用Genecards、OMIN、Drugbank、TTD等數據庫取得疾病靶位,分別輸入關鍵詞“atherosclerosis、platelet aggregation”,得到相應靶點分別為“1 177、898”“134、132”“47、16”“0、2”個,其中 Genecards數據庫篩選 Score≥1.135的基因,將各數據庫靶點錄入Excel 2010表中,對靶點進行整合,去除重復值后,最終得到疾病靶點390個。整合相關交集靶位后通過Venny軟件,生成“動脈粥樣硬化-血小板聚集、藥物-疾病”韋恩圖(圖 6、圖7),得出藥物與疾病共有80個交集靶位。

圖6 動脈粥樣硬化-血小板聚集韋恩圖Fig.6 Venn diagram of atherosclerosis and platelet aggregation

圖7 中藥-疾病韋恩圖Fig.7 Venn diagram of TCM-disease

2.2.2 PPI網絡構建分析

將藥物-疾病交集靶位數據錄入string數據庫中,同時設定物種為“人”,高置信值為 0.900,隱藏網絡中斷開的節(jié)點,結果得出78個核心靶位并導入Cytoscape3.7.2軟件中構建PPI網絡圖,如圖8所示,共有節(jié)點78個,272條邊。應用Network Analyzer 工具進行拓撲數據分析,度值大小通過節(jié)點大小、顏色深淺體現。獲取JUN靶點相關節(jié)點第一層,圖中共有節(jié)點27個,110條邊(圖9),Degree值前十的靶位是JUN、AKT1、TNF、IL6、TP53、MAPK1、CTNNB1、MAPK14、FOS、CAV1(表3)。

表3 Degree值前10關鍵靶點Table 3 Top 10 key targets in degree value

圖8 PPI網絡圖Fig.8 PPI network diagram

圖9 JUN靶點相關節(jié)點第一層網絡圖Fig.9 First-layer network diagram of relevant nodes of Jun target

2.2.3 藥物成分-靶點-疾病網絡構建分析

將藥物各活性成分及核心靶點數據導入Excel 2010表格中建立相互對應關系,運用 Cytoscape 3.7.2軟件制作“藥物成分-靶點-疾病”網絡圖(圖10)。共有593個節(jié)點,1 007條邊,同時進行拓撲分析。結果表明,各成分依據degree值高低排序,排名前 10 的成分為quercetin、kaempferol、luteolin、beta-sitosterol、baicalein、Stigmasterol、Myricanone、hederagenin、beta-carotene、6-Hydroxykaempferol,其中紅花中quercetin居首位,表明紅花中quercetin成分在干預血小板聚集抗動脈粥樣硬化中起主要作用。

2.2.4 GO、KEGG 富集分析

通過metascape數據庫對“川芎-桃仁-紅花”核心角藥干預血小板聚集抗AS的80個交集靶點進行GO 富集分析,結果顯示共5 501條,得出BP 4 599條, CC 376條, MF 526條。在生物過程中主要有運動的正向調節(jié)、細胞成分運動的正向調節(jié)、細胞運動的正向調節(jié)等;在細胞組分中主要參與了膜筏、膜微區(qū)、囊泡腔等細胞組分;在分子功能中主要信息受體調節(jié)劑活性、信息受體激活劑活性、轉錄因子結合等,制作氣泡圖進行可視化展示(圖11～圖13)。

利用metascape數據庫對作為核心角藥的“川芎-桃仁-紅花”干預血小板聚集抗 AS的共有靶位進行KEGG富集研究,將80個靶點導入到數據庫中,結果顯示共234條,核心靶點主要富集在AGE-RAGE在糖尿病并發(fā)癥的信息通道、癌癥相關通道、血脂與AS相關通道、松弛素信息通道和HIF-1信息通道等(圖14)。

3 討論

AS是一種由多種原因引起的血管慢性病變,可引起冠心病、腦卒中及外周血管病等[17]。血小板在AS的發(fā)生發(fā)展起著重要的作用,通過調節(jié)血小板活化、激活內皮細胞、觸發(fā)炎癥反應、刺激血管平滑肌細胞增殖等機制影響AS的進程[18-19]。故抗血小板聚集是防治AS的主要手段之一[20]。AS屬于中醫(yī)的“胸痹”“中風”“厥心痛”等疾病范疇,與痰、濁、瘀、毒、虛等病理相關。以臟腑陰陽氣血不足為本,以痰飲、濕濁、血瘀、毒邪為標,病機為本虛標實,治以補虛、化痰、解毒、活血為主。其中,“血瘀”是直接引起相關血流動力學障礙的關鍵因素,故活血化瘀法貫穿整個抗AS始終[21-23]。

本次研究通過數據挖掘發(fā)現干預血小板抗 AS 的中藥以活血化瘀、行氣止痛為主,輔以補氣化痰散結。根據關聯規(guī)則分析以及藥物系統聚類分析,結合角藥的支持度以及置信度綜合對比,選出核心角藥“川芎-紅花-桃仁”。其中,紅花可以起到活血通經、祛瘀止痛的作用,川芎可以起到活血祛風,行氣止痛的作用,桃仁可以起到活血祛瘀的作用,以上三藥性味多以甘、溫、苦為主,主要歸心肝經,與干預血小板聚集治療AS的機制相吻合?，F代藥理研究顯示[24-27],紅花可以起到抗氧化、參與免疫調節(jié)、抗炎等功效。川芎可以起到抗血小板聚集、擴張冠狀動脈、改善心肌缺血缺氧、保護血管內皮細胞功能等功效。桃仁可以起到改善血流速度、降低全血黏度、血漿黏度等功效,與干預血小板聚集治療AS的機制相吻合。

圖12 GO細胞組分通路富集氣泡圖Fig.12 GO cell component pathway enrichment bubble diagram

圖13 GO分子功能通路富集氣泡圖Fig.13 Bubble diagram of GO molecular functional pathway enrichment

圖14 KEGG通路富集圖譜Fig.14 Enrichment map of KEGG pathway

運用網絡藥理學對“川芎-紅花-桃仁”核心角藥進行分析,得出核心角藥與疾病前十位靶點分別是JUN、AKT1、TNF、IL6、TP53、MAPK1、CTNNB1、MAPK14、FOS、CAV1;干預血小板聚集抗AS中主要靶點是JUN,文獻[28]表明Jun原癌基因與血管內皮生長因子、基質金屬蛋白酶、細胞炎癥因子等促凋亡因子的表達有密切關聯,可影響血管形成。AKT1屬于AMP/GMP 激酶的總類之一,AKT1參與細胞生長和增值、細胞存活和凋亡、血管生成和舒張、營養(yǎng)物質的吸收或細胞葡萄糖和脂質代謝等過程[29]。TNF屬于促炎細胞因子,可以改善血管內皮功能、凝血功能、胰島素功能以及脂質代謝過程,從而達到抗AS的作用[30-31]。說明通過調節(jié)JUN、AKT1、TNF靶點蛋白,可以有效的抗AS。

核心角藥干預血小板聚集抗AS起主要作用前三位活性成分quercetin、kaempferol、luteolin。文獻[32-33]表明,槲皮素可以明顯改善血流減慢,通過影響血小板顆粒的胞外分泌、血小板的膠原和纖維素靜態(tài)黏附功能,從而有效改善動脈粥樣硬化病變。山奈酚屬于天然類黃酮,具有抗炎、抗凋亡和抗癌作用。有研究表明山奈酚通過干預 GPER調節(jié) PI3K/AKT/Nrf2 信號通道抑制氧化應激、炎癥和細胞凋亡,進而防止AS[34]。木犀草素具有抗炎、抗癌、抗氧化等功效[35]。文獻[36]表明木犀草素可影響血管平滑肌細胞的增殖和遷移,主要通過調節(jié)AKT和Src,并通過與 mRNA 穩(wěn)定性和 NOX4/ROS-NF-κB 通路相關的 TTP 激活來減少炎癥和氧化損傷,以預防AS形成。 所以“川芎-紅花-桃仁”核心角藥干預血小板聚集抗AS的主要活性成分可能是槲皮素、山柰酚、木犀草素等活性成分,其具有重要研究價值。

本研究發(fā)現核心角藥的靶位主要集中在AGE-RAGE信息通道在糖尿病并發(fā)癥中的作用、癌癥相關信息通道、脂質和AS信息通道、松弛素信息通道、HIF-1等信息通道。文獻[37-38]表明,松弛素信息通道可促進血小板衍生生長因子大量表達,使其促進血小板的極性移動凝聚到血管壁損傷部位促進 AS發(fā)展。

綜上所述,本研究運用數據挖掘,基于關聯規(guī)則及聚類分析,找出了核心角藥“川芎-紅花-桃仁”,并利用網絡藥理學方法對核心角藥進行相關靶點、信號通路研究,初步揭示其具有調節(jié)JUN、AKT1、TNF靶點蛋白以及脂質和AS相關信息通道、癌癥相關信息通道、松弛素信息通道以及HIF-1信息通道作用。為中醫(yī)防治AS找到有效的藥物組合,初步揭示了中醫(yī)靶向防治 AS 血小板聚集的可能機制,為深入進行中醫(yī)的微觀靶向研究提供了參考。

4 結論

通過數據挖掘與網絡藥理學方法,從整體上分析中藥復方通過干預血小板聚集抗AS的用藥規(guī)律,結果得出其干預血小板聚集抗AS的方劑多以活血化瘀、行氣止痛為主,輔以補氣化痰散結,槲皮素、山柰酚、木犀草素為干預血小板聚集抗AS的重要有效成分,最后得出關鍵靶點和信號通路,闡明核心角藥的作用機制,同時,后期還可運用多組學技術、分子對接技術等進一步佐證,為今后優(yōu)化組方提供一個新的處方思路以及為中醫(yī)藥治療AS的臨床研究提供重要基礎價值。