陳建閃,劉童通,孫子龍,牛瑞燕,劉 慈,王璟璐,馬海利,張 鼎

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院,山西 太谷 030801)

鎘(Cd)是一種有毒的重金屬元素,通常與氧、氯和硫等元素結(jié)合形成無機(jī)化合物存在于自然界。Cd的高生物毒性、強(qiáng)生物富集性、難降解性等特性使Cd污染對農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的危害日漸嚴(yán)重[1-2]。Cd隨飲食的攝入而進(jìn)入機(jī)體,在機(jī)體內(nèi)的生物半衰期可達(dá)10～30年,這進(jìn)一步造成肝臟、腎臟、肺臟、骨骼及腦等一系列重要器官的毒性損傷,同時引起消化、呼吸、神經(jīng)、免疫和生殖等系統(tǒng)的功能破壞[3-4]。鋅是動物體生命活動的必需元素,可以促進(jìn)動物體的生長發(fā)育、提高免疫功能和促進(jìn)胃腸消化等。近年來,人們發(fā)現(xiàn)鋅可以對抗包括重金屬在內(nèi)多種刺激引起的細(xì)胞毒性,發(fā)揮解毒作用[5]。N-乙酰半胱氨酸(NAC)為天然含硫氨基酸的衍生物,分子中具備含有活性的巰基基團(tuán),對各種內(nèi)源性或外源性氧化損傷起到保護(hù)作用。近年的研究表明,NAC不但能夠消除自由基,提高機(jī)體的抗氧化應(yīng)激能力,而且可以使趨化因子、炎性細(xì)胞因子以及黏附分子產(chǎn)生減少。此外,NAC還在機(jī)體的免疫狀態(tài)與細(xì)胞凋亡程序方面起到調(diào)節(jié)作用[6]。本研究以雞巨噬細(xì)胞為研究對象,采用體外試驗(yàn)觀察Cd對雞巨噬細(xì)胞的毒性損傷和免疫功能的影響,并通過單獨(dú)或聯(lián)合添加Zn2+、NAC的方式探討其對Cd染毒巨噬細(xì)胞的保護(hù)作用及機(jī)制,為Cd中毒的預(yù)防和治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞肉雞巨噬細(xì)胞系(HD-11),由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物生理實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 主要試劑及儀器流式細(xì)胞儀(BD,美國);熒光定量PCR儀(Bio-Rad,美國);共聚焦熒光顯微鏡(Olympus,德國)。FITC標(biāo)記鬼筆環(huán)肽(40735ES75)購自翊圣生物科技有限公司;DAPI溶液(即用型)(C0065)購自索萊寶科技有限公司;qPCR試劑盒購自寶生物工程;Annexin V-EGFP/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(KGA101)、活性氧檢測試劑盒(KGT010-1)和細(xì)胞凋亡線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)(KGA603)均購自凱基生物;葡萄糖酸鋅、氯化Cd、NAC購自國藥集團(tuán)。

1.3 方法

1.3.1細(xì)胞處理 用含10% FBS的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)HD-11細(xì)胞于T25培養(yǎng)瓶,置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱內(nèi)。待細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶底部單層時,消化、傳代到6孔板或共聚焦專用玻底培養(yǎng)板中。待6孔板中的細(xì)胞長至80%、共聚焦專用玻底培養(yǎng)板中細(xì)胞長至50%時,棄去舊培養(yǎng)基,加入一定量新細(xì)胞生長液,再分別加入一定量CdCl2、Zn(C6H11O7)2、NAC存儲液組成不同的Cd2+、Zn2+、NAC組合,使終濃度Cd2+為20,50 μmol/L,Zn2+為20 μmol/L,NAC為500 μmol/L,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育不同時間(6,12 h),收集細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)檢測。

收集用于共聚焦顯微鏡拍照觀察的細(xì)胞,共聚焦專用玻底培養(yǎng)板中不同濃度Cd2+、Zn2+、NAC組合處理細(xì)胞6 h后,棄掉舊的培養(yǎng)液,PBS洗滌細(xì)胞2次,備用;對用于流式檢測的細(xì)胞,6孔板中不同濃度Cd2+、Zn2+、NAC組合處理細(xì)胞6,12 h后,收集舊細(xì)胞培養(yǎng)液于5 mL EP管中,用無EDTA的胰蛋白酶消化并收集貼壁細(xì)胞,與舊培養(yǎng)液混合,2 000 r/min離心5 min,棄上清,用PBS懸浮細(xì)胞并轉(zhuǎn)移到新的1.5 mL EP管中,2 000 r/min洗細(xì)胞2次后離心5 min備用。

1.3.2細(xì)胞骨架蛋白染色觀察 取收集到的共聚焦專用玻底培養(yǎng)板內(nèi)的細(xì)胞,用4%甲醛溶液固定細(xì)胞10 min,PBS清洗細(xì)胞3次,每次10 min,0.5% Triton X-100溶液透化處理5 min,PBS清洗細(xì)胞3次,每次10 min,取200 μL Phalloidin-FITC工作液覆蓋住培養(yǎng)板底部的細(xì)胞,室溫避光孵育30 min,PBS清洗細(xì)胞3次,每次5 min,加入200 μL濃度為100 nmol/L的DAPI溶液對細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染30 s,PBS洗細(xì)胞1次,于細(xì)胞表面加入1滴Fluoromount-GTM水溶性封片劑,覆蓋細(xì)胞,共聚焦顯微鏡下進(jìn)行熒光拍照,疊加處理細(xì)胞核以及骨架的照片,觀察熒光的分布狀態(tài),分析Cd2+、Zn2+、NAC及其組合對細(xì)胞骨架蛋白的影響。

1.3.3細(xì)胞活性氧(ROS)含量的檢測 取從6孔板內(nèi)收集到1.5 mL EP管中的細(xì)胞,按照活性氧檢測試劑盒(KGT010-1)的說明操作,處理細(xì)胞后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測平均熒光強(qiáng)度,分析不同濃度Cd2+、Zn2+、NAC及其組合對細(xì)胞內(nèi)ROS含量的影響。

1.3.4細(xì)胞線粒體膜電位(MMP)水平的檢測 取從6孔板內(nèi)收集到1.5 mL EP管中的細(xì)胞,按照細(xì)胞凋亡線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)(KGA603)的說明操作,處理細(xì)胞后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測MMP下降的細(xì)胞數(shù),分析不同濃度Cd2+、Zn2+、NAC及其組合對MMP的影響。

1.3.5細(xì)胞凋亡率檢測 取從6孔板內(nèi)收集到1.5 mL EP管中的細(xì)胞,按照Annexin V-EGFP/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(KGA101)的說明操作,處理細(xì)胞后在1 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測早、中、晚凋亡細(xì)胞的數(shù)量,分析不同濃度Cd2+、Zn2+、NAC及其組合對細(xì)胞凋亡率的影響。

1.3.6Real-time PCR檢測 利用TRIzol法提取用不同濃度Cd2+、Zn2+、NAC及其組合分別處理6,12 h后HD-11細(xì)胞的RNA,并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。依據(jù)NCBI基因庫查找所需目標(biāo)基因的mRNA序列,利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物(表1)。采用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa公司,RR820A)試劑盒進(jìn)行Real-time PCR,反應(yīng)體系:SYBR Premix Ex Taq (2×) 5.0 μL,ROX Reference Dye(50×)0.2 μL,cDNA 1.0 μL,Primer-S 0.2 μL,Primer-A 0.2 μL,RNase-Free Water 3.4 μL。反應(yīng)條件:預(yù)變性為95℃ 3 min;變性為95℃ 30 s;退火為56℃ 30 s;延伸為72℃ 20 s;總共擴(kuò)增40個循環(huán)。溶解曲線部分反應(yīng)條件為95℃ 15 s;60℃ 1 min;95℃ 15 s。將對照組模板的基因表達(dá)量(拷貝數(shù))設(shè)成“1”,分析其他試驗(yàn)組基因的相對表達(dá)量。

表1 引物設(shè)計

2 結(jié)果

2.1 Zn2+、NAC對Cd染毒巨噬細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷的抑制作用Cd2+(20 μmol/L)、Zn2+(20 μmol/L)、NAC-(500 μmol/L)不同組合處理細(xì)胞6 h后,用FITC標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽染色細(xì)胞骨架。共聚焦顯微鏡拍照觀察可見,細(xì)胞培養(yǎng)基中不加入Cd2+,單獨(dú)或聯(lián)合加入 Zn2+、NAC,細(xì)胞骨架蛋白的結(jié)構(gòu)沒有被破壞,單獨(dú)加入20 μmol/L Cd2+引起細(xì)胞骨架蛋白降解,胞質(zhì)和胞核出現(xiàn)萎縮。細(xì)胞培養(yǎng)基中加入Cd2+的情況下,單獨(dú)加入Zn2+或NAC,骨架蛋白的破壞程度減弱,聯(lián)合添加Zn2+和NAC,骨架蛋白的破壞程度進(jìn)一步減弱(圖1)。

圖1 Zn2+、NAC對Cd染毒巨噬細(xì)胞骨架的影響

2.2 Zn2+、NAC對Cd染毒巨噬細(xì)胞ROS產(chǎn)生的抑制作用流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,20,50 μmol/L Cd2+作用6 h,細(xì)胞中ROS含量迅速上升(P<0.01),且50 μmol/L Cd2+時ROS含量上升的較多,說明ROS含量與攻毒濃度成正相關(guān)(圖2A)。單獨(dú)或聯(lián)合加入Zn2+、NAC均可以顯著降低Cd染毒ROS含量(P<0.01),但聯(lián)合加入的作用比單獨(dú)加入更明顯(圖2A)。當(dāng)作用細(xì)胞12 h時,20,50 μmol/L Cd2+染毒細(xì)胞中ROS含量均有所增加。細(xì)胞培養(yǎng)基中加入20 μmol/L Cd2+的情況下,單獨(dú)或聯(lián)合加入Zn2+、NAC均可以極顯著降低ROS含量(P<0.01),而且降低效果相近。細(xì)胞培養(yǎng)基中加入50 μmol/L Cd2+的情況下,單獨(dú)加入Zn2+顯著降低ROS含量(P<0.05),單獨(dú)加入NAC后ROS含量極顯著降低(P<0.01),聯(lián)合加入Zn2+和NAC后ROS進(jìn)一步減少,均低于單獨(dú)使用Zn2+或NAC(圖2B)。

A．作用6 h細(xì)胞ROS含量;B．作用12 h細(xì)胞ROS含量。與對照組相比,#.P<0.05,##.P<0.01;*.P<0.05,**.P<0.01。下同

2.3 Zn2+、NAC對Cd染毒巨噬細(xì)胞MMP水平的影響流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,20,50 μmol/L Cd2+作用6 h,細(xì)胞中MMP水平均降低,且50 μmol/L Cd2+時MMP降低的水平極顯著(P<0.01),說明Cd2+引起MMP降低的細(xì)胞數(shù)成濃度依賴性增加(圖3A)。單獨(dú)或聯(lián)合加入Zn2+、NAC,低濃度Cd染毒中MMP降低的細(xì)胞數(shù)顯著減少(P<0.05),而高濃度Cd染毒中MMP降低的細(xì)胞極顯著減少(P<0.01),且單獨(dú)加入NAC與聯(lián)合加入Zn2+和NAC的作用相近,均強(qiáng)于單獨(dú)加入Zn2+的作用(圖3A)。當(dāng)作用細(xì)胞12 h,20 μmol/L Cd2+對MMP降低的細(xì)胞數(shù)變化不明顯,50 μmol/L Cd2+對MMP降低的細(xì)胞數(shù)極顯著增加(P<0.01)(圖3B)。單獨(dú)或聯(lián)合加入Zn2+、NAC可以顯著增加高濃度Cd染毒細(xì)胞的MMP水平(P<0.05),聯(lián)合添加Zn2+和NAC的效果比單獨(dú)添加其中的一種所產(chǎn)生的效果更明顯(圖3B)。

A．作用6 h細(xì)胞MMP水平;B．作用12 h細(xì)胞MMP水平

2.4 Zn2+、NAC對Cd染毒巨噬細(xì)胞凋亡率的影響流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,細(xì)胞培養(yǎng)基中加入20,50 μmol/L Cd2+,細(xì)胞凋亡率隨Cd2+濃度增加和作用時間的延伸而升高。作用細(xì)胞6 h,單獨(dú)或聯(lián)合加入Zn2+、NAC時,低濃度Cd染毒細(xì)胞總的凋亡率顯著降低(P<0.05),且單獨(dú)加入NAC或聯(lián)合加入Zn2+和NAC對細(xì)胞凋亡率的效果相近。而高濃度Cd染毒細(xì)胞的凋亡率極顯著降低(P<0.01),聯(lián)合添加比單獨(dú)添加對Cd2+的抑制作用更明顯(圖4A)。當(dāng)作用細(xì)胞12 h,單獨(dú)或聯(lián)合加入Zn2+、NAC時,低濃度Cd染毒細(xì)胞凋亡率均呈現(xiàn)極顯著的下降(P<0.01),且單獨(dú)加入NAC或聯(lián)合加入Zn2+和NAC時,細(xì)胞凋亡率相似,均高于單獨(dú)加入Zn2+的凋亡率。而高濃度Cd染毒細(xì)胞在單獨(dú)加入Zn2+或NAC時細(xì)胞凋亡率相似,聯(lián)合添加后細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步降低(圖4B)。

A．作用6 h細(xì)胞凋亡率;B．作用12 h細(xì)胞凋亡率

2.5 Zn2+、NAC對Cd染毒巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子基因表達(dá)的影響熒光定量PCR結(jié)果顯示,20,50 μmol/L Cd2+作用細(xì)胞6(圖5A)、12 h(圖5B)后,IL-1β基因的表達(dá)量均下降,其中作用相同時間,50 μmol/L Cd2+時IL-1β基因表達(dá)量進(jìn)一步下降,而相同濃度的Cd2+,12 h時IL-1β基因表達(dá)量進(jìn)一步下降,這說明Cd2+能夠引起IL-1β基因濃度—時間依賴性表達(dá)量下降。在培養(yǎng)基中加入Cd2+的情況下,單獨(dú)添加Zn2+或NAC,IL-1β基因表達(dá)量明顯增加。與Zn2+和NAC的單獨(dú)作用相比,兩者聯(lián)合添加后IL-1β基因表達(dá)量進(jìn)一步增加,說明聯(lián)合加入Zn2+和NAC可以極顯著地提升IL-1β基因的表達(dá)水平(P<0.01)。50 μmol/L Cd2+作用細(xì)胞6 h,IL-8基因表達(dá)量顯著減少(P<0.01),單獨(dú)加入Zn2+或NAC能夠顯著提高Cd染毒細(xì)胞IL-8表達(dá)(P<0.05),聯(lián)合加入Zn2+和NAC后,IL-8基因表達(dá)量進(jìn)一步上升(P<0.001)(圖5C)。50 μmol/L Cd2+作用細(xì)胞12 h后,單獨(dú)加入Zn2+,IL-8基因的表達(dá)量變化不明顯,單獨(dú)加入NAC,IL-8基因的表達(dá)量顯著上升(P<0.01),聯(lián)合加入Zn2+和NAC后,IL-8基因的表達(dá)量進(jìn)一步上升,說明聯(lián)合添加Zn2+和NAC比單獨(dú)添加其中的一種對Cd2+的抑制作用明顯(圖5D)。20,50 μmol/L Cd2+作用細(xì)胞6 h(圖5E)和12 h(圖5F)后,IL-10基因的表達(dá)量下降。Cd2+作用細(xì)胞6 h時,單獨(dú)加入Zn2+能夠顯著提高IL-10表達(dá)(P<0.01),單獨(dú)加入NAC對IL-10基因的表達(dá)效果不明顯,聯(lián)合加入NAC和Zn2+后IL-10基因表達(dá)量進(jìn)一步上升,且50 μmol/L Cd2+中基因表達(dá)量增加幅度比20 μmol/L的高,這說明NAC可以增強(qiáng)Zn2+對IL-10基因的調(diào)控作用(圖5E)。Cd2+作用細(xì)胞12 h時,單獨(dú)加入Zn2+后IL-10基因的表達(dá)量顯著上升(P<0.05),單獨(dú)加入NAC時50 μmol/L Cd2+中IL-10基因表達(dá)量極顯著上升(P<0.001),聯(lián)合加入Zn2+和NAC后IL-10基因表達(dá)量進(jìn)一步上升(圖5F)。

A、C、E.作用6 h 相關(guān)細(xì)胞因子基因表達(dá)水平;B、D、F.作用12 h 相關(guān)細(xì)胞因子基因表達(dá)水平。與對照組相比,###.P<0.001,***.P<0.001。下同

2.6 Zn2+、NAC對Cd染毒巨噬細(xì)胞MT-1、MTF-1基因表達(dá)的影響熒光定量PCR結(jié)果顯示,細(xì)胞培養(yǎng)基中單獨(dú)加入Cd2+或Zn2+,作用細(xì)胞6(圖6A、C)和12 h(圖6B、D)后均可以引起MT-1和MTF-1基因表達(dá)量增加,而單獨(dú)加入NAC對MT-1和MTF-1基因表達(dá)量沒有明顯的促進(jìn)作用。加入Cd2+的情況下,單獨(dú)加入Zn2+,2種基因的表達(dá)量進(jìn)一步提高(6 hP<0.01,12 hP<0.05),單獨(dú)加入NAC,2種基因的表達(dá)量變化不明顯。與單獨(dú)添加Zn2+或NAC的促進(jìn)作用相比,聯(lián)合添加Zn2+和NAC,MT-1、MTF-1基因的表達(dá)量極顯著增加,6 h時這種促進(jìn)作用最明顯。

A、C.作用6 h MT-1、MTF-1基因表達(dá)水平;B、D.作用12 h MT-1、MTF-1基因表達(dá)水平

3 討論

3.1 Cd對雞巨噬細(xì)胞的毒性損傷Cd對多種細(xì)胞的生長和存活具有抑制作用,損傷機(jī)理涉及較多方面[7]。張鼎[8]用含有終濃度為10 μmol/L CdCl2的培養(yǎng)基處理牛腎臟上皮細(xì)胞,作用6 h后,ROS含量上升、MMP下降的細(xì)胞數(shù)均增多,細(xì)胞的凋亡率顯著升高。本研究參考之前的報道,前期預(yù)試驗(yàn)分別用含有終濃度為10,20,50和100 μmol/L CdCl2的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HD-11細(xì)胞,在6,12 h時觀察細(xì)胞形態(tài),發(fā)現(xiàn)作用細(xì)胞6 h后20 μmol/L CdCl2引起細(xì)胞形態(tài)損傷比較明顯,而50 μmol/L CdCl2對細(xì)胞形態(tài)造成顯著的損傷,故本研究分別選擇含有20,50 μmol/L CdCl2的細(xì)胞培養(yǎng)基建立雞巨噬細(xì)胞輕度和重度Cd中毒模型,在不同時間段(6,12 h)分別從細(xì)胞骨架、ROS含量、MMP水平、細(xì)胞凋亡率以及細(xì)胞IL-1β、IL-8、IL-10基因的轉(zhuǎn)錄水平這5個方面的影響進(jìn)行檢測,探討Cd對雞巨噬細(xì)胞毒性損傷和免疫調(diào)控的機(jī)理。

Cd處理細(xì)胞6 h后,細(xì)胞骨架中纖維狀肌動蛋白(F-actin)結(jié)構(gòu)破壞,蛋白斷裂、降解、模糊不清,使細(xì)胞核暴露,且損傷程度呈現(xiàn)濃度依賴性。說明F-actin結(jié)構(gòu)的破壞是Cd引起細(xì)胞損傷的機(jī)制之一。本試驗(yàn)從定量角度分析Cd對ROS含量的影響,結(jié)果顯示ROS含量隨著Cd濃度的增加而持續(xù)升高,引起細(xì)胞氧化損傷。原因是Cd離子不僅能直接促進(jìn)ROS產(chǎn)生,還能通過降低還原性蛋白與抗氧化酶的活性間接調(diào)控ROS含量。首先,Cd破壞了線粒體呼吸鏈的正常運(yùn)作,抑制線粒體的呼吸,導(dǎo)致ROS大量產(chǎn)生[9];其次,侵入機(jī)體的Cd與金屬硫蛋白(MT)、谷胱甘肽(GSH)等結(jié)合使蛋白失去還原性,間接促進(jìn)ROS含量,使其在細(xì)胞內(nèi)過量聚集[10-11]。同時抑制超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)等的活性,提升丙二醛(MDA)的活性,細(xì)胞自由基代謝失衡,導(dǎo)致ROS在細(xì)胞內(nèi)聚積[12]。如此,Cd通過這些方面增加了活性氧的含量,刺激細(xì)胞的氧化損傷,介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

線粒體是ROS產(chǎn)生的主要場所,據(jù)報道,微摩爾水平的Cd就能夠影響ROS含量,促進(jìn)ROS產(chǎn)生,進(jìn)而破壞線粒體,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13-14]。當(dāng)Cd損傷了線粒體之后,ROS大量產(chǎn)生,反過來攻擊線粒體,兩者之間相互影響。而本研究選取MMP的變化來分析Cd的毒性作用。20,50 μmol/L的Cd處理雞巨噬細(xì)胞后用流式細(xì)胞儀檢測Cd引起MMP降低的細(xì)胞數(shù)量,發(fā)現(xiàn)隨著Cd濃度的增加,MMP降低的細(xì)胞數(shù)量也增多。結(jié)合該試驗(yàn)結(jié)果可以說明Cd能夠通過損傷線粒體的途徑來加重對細(xì)胞的損傷程度。

據(jù)大量研究表明,Cd能夠誘導(dǎo)犬腎臟近端小管、小鼠胸腺細(xì)胞等眾多細(xì)胞發(fā)生凋亡[15]。LI等[16]報道,用5 μmol/L的Cd處理大鼠原代肝臟細(xì)胞,培養(yǎng)12 h后便可造成細(xì)胞核皺縮和破碎,嚴(yán)重時出現(xiàn)調(diào)亡小體。本研究檢測細(xì)胞的早凋和中、晚凋過程,以及總的凋亡率,顯示Cd主要影響細(xì)胞的中凋和晚凋過程,隨著Cd濃度與攻毒時間的延伸,細(xì)胞凋亡中期和晚期的凋亡率持續(xù)上升,且總的凋亡率也增加。Cd對細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制涉及較多方面,比如本試驗(yàn)中Cd對細(xì)胞骨架、ROS含量、線粒體的損傷以及巨噬細(xì)胞分泌白介素IL-1β、IL-8和IL-10能力的損傷均能夠促進(jìn)細(xì)胞的凋亡,各個方面相互作用,開啟細(xì)胞的凋亡程序。

3.2 鋅對Cd毒性的拮抗作用添加適當(dāng)濃度的鋅可以對細(xì)胞產(chǎn)生重要的保護(hù)作用,與鋅顯著的抗氧化作用有關(guān)[17],其中鋅可以抑制ROS過量產(chǎn)生以及MMP下降,這也是鋅抑制Cd毒性的機(jī)制之一[18-19]。本研究在HD-11細(xì)胞的培養(yǎng)基中單獨(dú)添加Cd或鋅孕育6,12 h,結(jié)果Cd、鋅均可以促進(jìn)MT-1基因表達(dá),與之前的報道相符。研究顯示,重金屬誘導(dǎo)MT-1產(chǎn)生其實(shí)是機(jī)體對外界應(yīng)激源的刺激作出的回應(yīng),是自身的防御機(jī)制,通過增加MT-1的含量來抑制氧化損傷,同時拮抗應(yīng)激源所產(chǎn)生的毒性[20]。而在Cd組中加入鋅之后,MT-1基因的表達(dá)量會明顯提升,這說明鋅可以提升細(xì)胞清除ROS的能力,避免線粒體損傷,抵抗Cd的毒性。同時,本研究結(jié)果還顯示細(xì)胞中單獨(dú)或聯(lián)合加入Cd和鋅,MTF-1基因表達(dá)水平的變化趨勢與MT-1基因相似,這說明巨噬細(xì)胞中MTF-1基因的表達(dá)可能會促進(jìn)MT-1基因的表達(dá)。張鼎[8]研究證明Cd和鋅單獨(dú)或聯(lián)合處理牛腎臟上皮細(xì)胞能夠引起細(xì)胞MTF-1、MT-1基因不同程度的上調(diào)表達(dá)[8]。本研究結(jié)論中鋅對Cd毒性的拮抗機(jī)理與之前的報道相符。

研究表明,Cd染毒可降低巨噬細(xì)胞的吞噬能力、抗原提呈能力和細(xì)胞因子分泌能力,最終抑制機(jī)體對病原體的免疫應(yīng)答[21-22],而適量濃度的鋅補(bǔ)充可以有效改善Cd對巨噬細(xì)胞的免疫損傷[23]。本研究也證實(shí),Zn2+添加可以緩解細(xì)胞IL-1β、IL-8和IL-10基因表達(dá)量下降的趨勢,促進(jìn)免疫調(diào)控。

3.3 NAC對Cd毒性的拮抗作用在相關(guān)的研究中,NAC作為一種抗氧化劑可以顯著降低 ROS水平,并保護(hù)細(xì)胞免受死亡[24-25]。本研究也證實(shí)在Cd攻毒巨噬細(xì)胞中添加500 μmol/L NAC可以抑制Cd對線粒體的損傷、減少ROS含量,進(jìn)而阻止細(xì)胞發(fā)生過氧化反應(yīng),降低細(xì)胞的凋亡率。這可能與NAC的抗氧化性、增加抗氧化酶活性、以及直接結(jié)合Cd離子等有關(guān)。首先,直接抗氧化是NAC憑借自身的巰基氧化還原生物大分子中的二硫鍵,消除體內(nèi)氧自由基,如羥自由基、次氯酸(HOCl)和H2O2等物質(zhì)來保護(hù)生物大分子活性[26]。間接抗氧化是小分子的NAC進(jìn)入細(xì)胞后脫去乙?；蔀楹铣蒅SH的前體,促使細(xì)胞合成GSH,清除能透過細(xì)胞膜并與DNA、氨基酸、蛋白質(zhì)等多種細(xì)胞成分發(fā)生反應(yīng)、損傷機(jī)體的過量氧自由基,調(diào)整氧化應(yīng)激水平,降低ROS含量,抑制線粒體損傷。其次,NAC能增加CAT、GSH-Px、SOD等抗氧化酶的活性[27-28],阻止MDA的生成量增加,抑制ROS生成。同時,GSH能結(jié)合Cd離子,使有毒的Cd離子轉(zhuǎn)化為無毒的化合態(tài)Cd,抑制Cd的毒性,保護(hù)細(xì)胞自身完整性[29]。本研究結(jié)果顯示,NAC在一定條件下還能夠提高細(xì)胞中IL-1β、IL-8和IL-10基因的表達(dá)量,恢復(fù)巨噬細(xì)胞的免疫功能。此外,NAC與Zn2+聯(lián)合使用能夠促進(jìn)Zn2+對MT-1和MTF-1基因的調(diào)控,具體機(jī)理需要進(jìn)一步研究。