谷振芳, 徐保彬, 李 偉, 張春梅, 周亞青

(濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院, 山東 濟(jì)寧 272000)

非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是肺癌最常見的類型,由于缺乏典型表現(xiàn),大部分患者就診時(shí)已處于晚期,預(yù)后較差,Ⅳ期患者5年生存率可低至4%[1]?；熓球?qū)動(dòng)基因陰性,即表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)/間變性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase,ALK)野生型晚期NSCLC的主要治療方式,但化療效果有限,晚期NSCLC患者生存時(shí)間仍然較短,尋找新的分子靶點(diǎn),以期為診療及預(yù)后預(yù)測(cè)提供新方向,是近年研究的熱點(diǎn)[2]。微小RNA(microRNA,miR)作為內(nèi)源性、高度保守的單鏈非編碼RNA,被發(fā)現(xiàn)在腫瘤患者中的表達(dá)與健康人群存在顯著差異[3]。miR-499被發(fā)現(xiàn)具有抑癌作用,在肺癌組織中呈低表達(dá),且能介導(dǎo)放療敏感性,影響患者預(yù)后生存率[4]。miR-144-3p也被發(fā)現(xiàn)在NSCLC組織中呈低表達(dá),可靶向調(diào)控胰島素受體底物1等基因表達(dá),發(fā)揮抑癌效應(yīng)[5]?；诖?本研究分析血清miR-499、miR-144-3p與EGFR/ALK野生型晚期NSCLC患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系展開分析,以期為NSCLC診療提供新方向。

1 資料與方法

1.1一般資料:收集2018年1月至2020年我院收治的107例EGFR/ALK野生型晚期NSCLC患者臨床資料(NSCLC組)。納入標(biāo)準(zhǔn):經(jīng)病理學(xué)檢查確診為NSCLC(即組織學(xué)類型為鱗癌、腺癌、大細(xì)胞癌),結(jié)合影像學(xué)等明確為ⅢB～Ⅳ期(病灶直徑>5cm,且可見淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移);年齡18～80歲;EGFR及ALK均為野生型;影像學(xué)檢查、實(shí)驗(yàn)室檢查等資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn):不配合治療或中途停止治療;合并其他腫瘤;入院前接受放化療、靶向治療等抗腫瘤治療;既往肺纖維化、塵肺史;既往臟器移植史;合并免疫缺陷疾病、凝血功能障礙;合并帕金森、癲癇等神經(jīng)-精神疾病;妊娠期婦女。另取同期健康體檢者107例作為對(duì)照組,與NSCLC組性別、年齡1∶1成組匹配,且排除存在腫瘤、放化療史、肺部疾病史、免疫功能缺陷、凝血功能障礙、急慢性感染、神經(jīng)-精神疾病的健康體檢者。NSCLC組男性88例,女性19例;年齡51～73歲,平均(63.15±5.73)歲。對(duì)照組男性85例,女性22例;年齡50～72歲,平均(62.87±5.04)歲。兩組上述基線資料比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2方法:NSCLC組收集入院次日清晨空腹外周肘靜脈血3～4mL,對(duì)照組收集體檢當(dāng)日上午空腹外周肘靜脈血3～4mL,3000r/min離心5min獲得血清標(biāo)本,保存于-80℃冰箱內(nèi),取解凍后的血清標(biāo)本200μL,加入200mL QIAzol裂解液(德國(guó)QIAGENE公司),接著使用miRNeasy Serum/Plasma Kit試劑盒提純得到總RNA,經(jīng)miScript Reverse Transcription Kit 試劑盒逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA,再采用實(shí)時(shí)熒光RCR技術(shù)(miScriptSYBR Green PCR Kit試劑盒)檢測(cè)miR-499、miR-144-3p,以95℃預(yù)變性15min,94℃變性15s,55℃退火30s,70℃延伸30s,為PCR擴(kuò)增程序,共40個(gè)循環(huán),55～95℃繪制溶解曲線,計(jì)算各反應(yīng)管循環(huán)閾值Ct;以U6為內(nèi)參,采用2-△△Ct法,計(jì)算miR-499、miR-144-3p的相對(duì)表達(dá)量;上述試劑盒均購(gòu)自德國(guó)QIAGENE公司。

1.3隨訪觀察:所有EGFR/ALK野生型晚期NSCLC患者入院后采用含鉑類的雙藥聯(lián)合化療方案,其中吉西他濱+鉑類治療49例(45.79%),培美曲塞+鉑類治療32例(29.91%),紫杉醇+鉑類26例(24.30%)。以NSCLC組出院時(shí)為隨訪起點(diǎn),2023年1月為截止時(shí)間,死亡為終點(diǎn)事件。

2 結(jié) 果

2.1NSCLC組及對(duì)照組血清miR-499、miR-144-3p表達(dá)比較:NSCLC組血清miR-499、miR-144-3p相對(duì)表達(dá)量均低于對(duì)照組(P<0.05),見表1。

表1 兩組血清miR-499 miR-144-3p相對(duì)表達(dá)量

2.2不同臨床病理特征晚期NSCLC患者血清miR-499、miR-144-3p表達(dá)比較:晚期NSCLC患者中,Ⅳ期患者血清miR-499、miR-144-3p相對(duì)表達(dá)量低于ⅢB及ⅢC期者(P<0.05),低分化者則低于中高分化者(P<0.05),見表2。

表2 NSCLC患者血清miR-499 miR-144-3p相對(duì)表達(dá)量

2.3miR-499、miR-144-3p高表達(dá)與低表達(dá)者預(yù)后生存時(shí)間比較:以≥平均值作為高表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn),晚期NSCLC患者血清miR-499≥0.74有55例,<0.74有52例;血清miR-144-3p≥0.82有54例,<0.82有53例。晚期NSCLC患者隨訪時(shí)間為4～56個(gè)月,中位隨訪時(shí)間34個(gè)月,血清miR-499高表達(dá)者預(yù)后死亡10例(18.18%),平均生存時(shí)間(48.16±2.29)個(gè)月,血清miR-499低表達(dá)者死亡24例(46.15%),平均生存時(shí)間(35.58±2.82)個(gè)月,Kaplan-Meier法繪制生存曲線見圖1a,Log Rank法檢驗(yàn)顯示,血清miR-499高表達(dá)者生存率明顯高于低表達(dá)者(Log Rank χ2=9.159,P=0.002);血清miR-144-3p高表達(dá)者預(yù)后生存時(shí)間(48.02±2.32)個(gè)月,血清miR-144-3p低表達(dá)者預(yù)后生存時(shí)間(35.93±2.79)個(gè)月,分別死亡10例(18.52%)、24例(45.28%),生存曲線見圖1b,Log Rank法檢驗(yàn)顯示,血清miR-144-3p高表達(dá)者生存率明顯高于低表達(dá)者(Log Rank χ2=8.345,P=0.004)。

圖1 miR-499、miR-144-3p高表達(dá)與低表達(dá)者預(yù)后生存曲線

3 討 論

晚期NSCLC放化療效果不理想,預(yù)后差、生存期短,即便是驅(qū)動(dòng)基因陰性的晚期NSCLC,5年生存率也不超過50%[6]。目前,臨床迫切需要新的治療靶點(diǎn),改善晚期NSCLC患者預(yù)后。miR可調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移等多種腫瘤生物學(xué)行為,目前miR的表達(dá)譜主要由腫瘤組織獲得,但晚期惡性腫瘤患者無法手術(shù)切除,不適合經(jīng)腫瘤組織檢測(cè)miR表達(dá)。然而,miR在外周血中可以微泡形式、與脂類結(jié)合形式,或以蛋白復(fù)合物的形式存在,故miR在外周血中能持續(xù)穩(wěn)定存在,近年研究也重點(diǎn)分析循環(huán)中的miR表達(dá)譜,發(fā)現(xiàn)miR在多種惡性腫瘤中異常表達(dá)[7]。本研究嘗試分析血清miR在EGFR/ALK野生型晚期NSCLC惡性程度與預(yù)后生存時(shí)間判斷中的應(yīng)用價(jià)值,為晚期NSCLC治療新靶點(diǎn)提供數(shù)據(jù)支持。

本研究中,NSCLC組血清miR-499相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組,提示miR-499在晚期NSCLC循環(huán)中呈低表達(dá),即miR-499的下調(diào)可能參與NSCLC的發(fā)生。目前,miR-499被發(fā)現(xiàn)在多囊卵巢綜合癥、睡眠呼吸暫停綜合癥等多種慢性疾病中存在異常表達(dá)[8]。近年研究顯示,miR-499基因多態(tài)性與肝細(xì)胞癌、食管鱗狀細(xì)胞癌等惡性腫瘤患病風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)。雖然,miR-499異常表達(dá)在多種疾病中可見,但其具體作用機(jī)制尚未闡明[9]。另外,本研究還發(fā)現(xiàn),Ⅳ期NSCLC患者血清miR-499相對(duì)表達(dá)量低于ⅢB及ⅢC期者,低分化者則低于中高分化者,提示惡性程度更高、侵襲更廣的NSCLC患者血清miR-499表達(dá)更低,miR-499可能與NSCLC的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)。Li[10]等發(fā)現(xiàn),miR-499可靶向調(diào)控癌基因VAV3,介導(dǎo)NSCLC的增殖與轉(zhuǎn)移,與本文結(jié)論相似。Sun[11]等研究發(fā)現(xiàn),miR-144-3p可使Ⅺ型膠原α1基因沉默,參與肺腺癌的侵襲與遷移過程。Fang[12]等通過裸鼠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),miR-144-3p可通過調(diào)控肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor,HGF)癌基因的表達(dá),影響肺癌組織的生長(zhǎng)。上述報(bào)道均提示,miR-144-3p可能通過調(diào)控原癌基因的表達(dá),參與肺癌的生長(zhǎng)及侵襲過程。本研究中,miR-144-3p在晚期NSCLC患者血清中呈低表達(dá),且Ⅳ期及低分化的NSCLC患者血清miR-144-3p相對(duì)表達(dá)量低于ⅢB、ⅢC期及中高分化者,提示miR-144-3p的低表達(dá)可能參與NSCLC的增殖、侵襲、遷移過程,與上述報(bào)道結(jié)論相似。

NSCLC的預(yù)后分子生物學(xué)標(biāo)志物是近年研究的熱點(diǎn),但目前仍缺乏準(zhǔn)確、有效的標(biāo)志物。本研究對(duì)EGFR/ALK野生型晚期NSCLC患者預(yù)后生存情況展開分析,發(fā)現(xiàn)血清miR-499、miR-144-3p高表達(dá)者生存率明顯高于低表達(dá)者,提示miR-499、miR-144-3p不僅與NSCLC惡性生物學(xué)行為有關(guān),還能預(yù)測(cè)患者預(yù)后。且循環(huán)中的miR-499、miR-144-3p檢測(cè)簡(jiǎn)單易行、有可重復(fù)性,在NSCLC預(yù)后監(jiān)測(cè)中具有較大前景。

綜上所述,miR-499、miR-144-3p低表達(dá)可能與晚期NSCLC的增殖、侵襲、遷移密切相關(guān),且監(jiān)測(cè)血清miR-499、miR-144-3p表達(dá)情況對(duì)判斷患者預(yù)后生存率有利。