鄭黎明, 甄生華, 黃祖義, 歐陽(yáng)玉律, 戴 峰

(湖北省監(jiān)利市人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科, 湖北 監(jiān)利 433300)

胃癌(Gastric cancer,GC)是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因,盡管有各種治療策略,但患者預(yù)后仍然很差,5年生存率僅為20～25%[1]。因此,有效識(shí)別和開發(fā)用于診斷和治療GC患者的新分子方法仍然是迫切的臨床需求。N6-甲基腺苷(N6-Methyladenosine,m6A)修飾是最普遍的mRNA修飾之一,會(huì)影響mRNA的轉(zhuǎn)錄、穩(wěn)定和翻譯[2]。m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物的核心分子,包括甲基轉(zhuǎn)移酶樣3(methyltransferase-like 3,METTL3)、甲基轉(zhuǎn)移酶樣14和WT1相關(guān)蛋白,介導(dǎo)甲基化修飾[3]。最近,一些研究表明,METTL3功能失調(diào)會(huì)導(dǎo)致人類癌癥的發(fā)生、發(fā)展和耐藥性[4]。然而,METTL3介導(dǎo)的耐藥性生物學(xué)分子機(jī)制需要在GC方面進(jìn)一步探索。一組含有YTH結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)(YTHDF)已被確定為m6A“閱讀器”,可識(shí)別m6A標(biāo)記并介導(dǎo)m6A功能[5]。YTHDF具有許多重要的生物學(xué)功能,尤其對(duì)Hippo信號(hào)通路的轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面[6]。最近研究發(fā)現(xiàn),METTL3啟動(dòng)的m6A mRNA甲基化通過(guò)將YTHDF1/3招募到翻譯起始復(fù)合物來(lái)促進(jìn)Yes相關(guān)蛋白1(Yes-associated protein 1,YAP1) mRNA的翻譯,YAP1表達(dá)和活性的增加可誘導(dǎo)NSCLC耐藥和轉(zhuǎn)移[6]。然而,METTL3是否通過(guò)促進(jìn)m6A依賴的YAP1翻譯誘導(dǎo)GC對(duì)順鉑的耐藥性仍有待進(jìn)一步闡明。在本研究中,我們?cè)u(píng)估了順鉑耐藥GC細(xì)胞中METTL3表達(dá)與YAP1 mRNA的m6A修飾之間的關(guān)系,并闡明了這種關(guān)系是否與順鉑耐藥性有關(guān)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞:順鉑耐藥的AGS/DDP及其親本順鉑敏感的AGS購(gòu)自美國(guó)ATCC,將它們接種在含10%胎牛血清的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM,美國(guó)Gibco公司)中生長(zhǎng)。

1.2質(zhì)粒和小干擾RNA構(gòu)建:人METTL3 siRNA(si-METTL3)、人YAP1 siRNA(si-YAP1)及對(duì)照siRNA(si-NC)由廣州Riobobio公司構(gòu)建。使用Lipofectamine 3000試劑將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。在轉(zhuǎn)染后24h,收獲細(xì)胞并用于實(shí)驗(yàn)。使用Phusion高保真DNA聚合酶(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)從HEK293細(xì)胞制備的cDNA中PCR擴(kuò)增YAP1的整個(gè)序列,并克隆到pcDNA3.1-的HindⅢ/XbaI位點(diǎn)myc-HisA載體。為了設(shè)計(jì)翻譯報(bào)告構(gòu)建體,YAP1的推定m6A修飾位點(diǎn)從HEK293 cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,并克隆到海腎熒光素酶基因的3-UTR的XhoI位點(diǎn)psiCHECK3載體。以上質(zhì)粒載體的構(gòu)建和合成均由上海裕森生物科技有限公司完成。

1.3蛋白質(zhì)免疫印跡:對(duì)于免疫印跡,收獲細(xì)胞,在磷酸鹽緩沖液中洗滌,并在含有150mM NaCl、50mM Tris-HCl(pH 7.4)、0.25%脫氧膽酸鈉、1mM乙二胺四乙酸、1% NP40、1mM NaF、0.2mM 苯甲基磺酰氟、0.1mM原釩酸鈉和蛋白酶/磷酸酶抑制劑混合物中提取蛋白。使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)樣品(10～30μg)并印跡到聚偏二氟乙烯膜上;使用指定的抗體探測(cè)免疫印跡。使用Super Signal West Femto化學(xué)發(fā)光底物(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)使免疫印跡可視化。用Image J軟件對(duì)條帶強(qiáng)度進(jìn)行量化。所有印跡一式三份進(jìn)行。使用的抗體包括針對(duì)YAP1 (1∶1000)、METTL3 (1∶1000)、METTL14 (1∶1000)、WTAP (1∶1,000)和FTO (1∶1000)購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司。針對(duì)抗β-肌動(dòng)蛋白 (1∶10000)和抗FLAG (1∶5000) 抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

1.4Poly(A) RNA斑點(diǎn)印跡:使用TRIzol試劑(美國(guó)Invitrogen公司)從AGS和AGS/DDP細(xì)胞中分離總RNA。然后,使用Oligotex mRNA mini kit(德國(guó)Qiagen公司)從總RNA中純化poly(A) RNA。使用UV交聯(lián)劑將Poly(A) RNA (100ng)交聯(lián)到Hybond N+膜上。使用抗m6A抗體(1∶1000,德國(guó)Synaptic Systems公司)探測(cè)膜,并使用Super Signal West Femto化學(xué)發(fā)光底物(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)對(duì)印跡進(jìn)行可視化。

1.5熒光素酶測(cè)定:使用雙熒光素酶報(bào)告分析系統(tǒng)(美國(guó)Promega公司)測(cè)量用psiCHECK3載體轉(zhuǎn)染的AGS和AGS/DDP細(xì)胞裂解物中的海腎熒光素酶活性。該載體產(chǎn)生的螢火蟲熒光素酶活性用于標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)染效率的結(jié)果。

1.6Tunel檢測(cè):通過(guò)Tunel染色評(píng)估細(xì)胞凋亡誘導(dǎo),并使用原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(瑞士Roche Life Science公司)進(jìn)行檢測(cè)。將2 × 104個(gè)細(xì)胞接種到置于24孔板內(nèi)的蓋玻片上并孵育24h。使用Lipofectamine 3000試劑將指定的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞24h。然后用順鉑(10μg/mL)處理細(xì)胞24h。用磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞并使用Cytofix/Cytoperm試劑在4 ℃下固定20min。細(xì)胞用50μL Tunel溶液在37 ℃染色1h,然后用磷酸鹽緩沖鹽水洗滌2次。使用配備有FITC濾光片的Axiovert 200M熒光顯微鏡檢測(cè) DNA片段化。

1.7小鼠異種移植模型:雄性BALB/c裸鼠(6周大)購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,并飼養(yǎng)在光照和溫度控制室的籠子中。將用指定的敲除質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的AGS或AGS/DDP細(xì)胞(2×106個(gè)細(xì)胞/100μL/小鼠)皮下注射到小鼠側(cè)腹。5天后,將小鼠分成指定的組,每周2次腹腔注射二甲亞砜(n = 8)或順鉑(5mg/kg,n = 12),連續(xù)6周。給藥6周后,對(duì)小鼠實(shí)施安樂(lè)死,計(jì)算所有組的腫瘤重量。

1.8統(tǒng)計(jì)分析:使用Prism 8進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。雙尾學(xué)生t檢驗(yàn)用于評(píng)估兩個(gè)獨(dú)立組之間的比較。單因素方差分析和Tukey多重比較檢驗(yàn)用于多組比較分析。P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1AGS/DDP細(xì)胞中METTL3表達(dá)上調(diào):與AGS細(xì)胞相比,AGS/DDP中的METTL3、METTL14和WTAP表達(dá)顯著上調(diào),而FTO表達(dá)保持相對(duì)不變(圖1A、B)。然后通過(guò)使用m6A特異性抗體對(duì)poly(A) RNA進(jìn)行斑點(diǎn)印跡來(lái)確定m6A修飾的程度,結(jié)果顯示AGS/DDP與AGS細(xì)胞相比顯著上調(diào)(圖1C)。AGS/DDP細(xì)胞中的METTL3敲除消除了mRNA的m6A修飾(圖1D)?？傊?這些結(jié)果表明METTL3表達(dá)在順鉑抗性GC細(xì)胞中增加,導(dǎo)致mRNA的m6A修飾增強(qiáng)。

圖1 AGS/DDP細(xì)胞中METTL3表達(dá)上調(diào)

2.2METTL3提高AGS/DDP細(xì)胞中YAP1的翻譯效率:我們接下來(lái)評(píng)估了在AGS/DDP細(xì)胞中觀察到的m6A YAP1水平升高是否與YAP1翻譯增強(qiáng)有關(guān)。與親本AGS細(xì)胞相比,AGS/DDP細(xì)胞中YAP1表達(dá)的免疫印跡顯示出顯著上調(diào)(圖2A)。為了檢查由METTL3介導(dǎo)的m6A修飾是否負(fù)責(zé)增強(qiáng)AGS/DDP細(xì)胞中YAP1 mRNA的翻譯,通過(guò)將推定的源自YAP1的m6A修飾位點(diǎn)插入熒光素酶基因的3'-UTR區(qū)域來(lái)設(shè)計(jì)翻譯報(bào)告基因構(gòu)建體(圖2B)。細(xì)胞裂解物中熒光素酶活性的分析顯示,與AGS細(xì)胞相比,AGS/DDP中攜帶野生型YAP1 m6A基序的熒光素酶報(bào)告基因的翻譯在其3'-UTR中增加。相比之下,YAP1 m6A基序的突變減少了熒光素酶報(bào)告基因的翻譯,表明YAP1的m6A修飾增加增強(qiáng)了其在AGS/DDP細(xì)胞中的翻譯(圖2C)。通過(guò)AGS/DDP細(xì)胞中的METTL3敲除進(jìn)一步檢查了調(diào)節(jié)YAP1翻譯的機(jī)制,這導(dǎo)致攜帶YAP1 m6A基序的熒光素酶報(bào)告基因的翻譯減少(圖2D)?？傊?這些結(jié)果表明m6A修飾對(duì)于增強(qiáng)AGS/DDP細(xì)胞中YAP1的翻譯至關(guān)重要。

圖2 METTL3提高AGS/DDP細(xì)胞中YAP1的翻譯效率

2.3METTL3提高AGS/DDP細(xì)胞中YAP1的蛋白質(zhì)水平:接下來(lái),我們檢查了METTL3調(diào)節(jié)的YAP1翻譯效率是否影響其在AGS和AGS/DDP細(xì)胞中的蛋白質(zhì)水平。AGS細(xì)胞中METTL3的過(guò)表達(dá)顯著增加了YAP1蛋白表達(dá),而AGS/DDP細(xì)胞中的METTL3敲除降低了YAP1表達(dá)(圖3A、B)。為了比較AGS和AGS/DDP細(xì)胞之間YAP1的蛋白質(zhì)合成速率(翻譯效率),我們通過(guò)環(huán)亮氨酸處理抑制m6A修飾,結(jié)果顯示AGS/DDP細(xì)胞中YAP1蛋白水平以劑量依賴方式降低(圖3C)。為了檢查環(huán)亮氨酸是否通過(guò)減少m6A修飾來(lái)降低YAP1表達(dá),我們用環(huán)亮氨酸處理過(guò)表達(dá)METTL3的AGS細(xì)胞,結(jié)果顯示METTL3誘導(dǎo)的YAP1增強(qiáng)表達(dá)在環(huán)亮氨酸處理后降低,進(jìn)一步表明 METTL3通過(guò)m6A修飾mRNA增加YAP1表達(dá)(圖3D)。

圖3 METTL3提高AGS/DDP細(xì)胞中YAP1的水平

2.4METTL3促進(jìn)的YAP1表達(dá)對(duì)順鉑耐藥的AGS/DDP細(xì)胞凋亡影響:Tunel染色檢查DNA的凋亡片段顯示,與順鉑處理的AGS/DDP細(xì)胞相比,順鉑處理的METTL3或YAP1敲除的AGS/DDP細(xì)胞中DNA片段化明顯增加(圖4)。

圖4 METTL3促進(jìn)的YAP1表達(dá)對(duì)順鉑耐藥的AGS/DDP細(xì)胞凋亡影響

圖5 METTL3的抑制通過(guò)降低YAP1表達(dá)來(lái)恢復(fù)體內(nèi)順鉑的敏感性

2.5METTL3的抑制通過(guò)降低YAP1表達(dá)來(lái)恢復(fù)體內(nèi)順鉑的敏感性:使用異種移植模型研究METTL3對(duì)體內(nèi)順鉑抗性的影響。將用si-NC或si-METTL3轉(zhuǎn)染的AGS/DDP細(xì)胞皮下注射到BALB/c裸鼠的側(cè)腹。與DMSO處理相比,順鉑在AGS小鼠中顯著減少腫瘤重量,但在AGS/DDP小鼠中沒(méi)有變化(圖5A)。與皮下注射si-NC轉(zhuǎn)染的AGS/DDP小鼠相比,順鉑顯著降低了si-METTL3轉(zhuǎn)染的AGS/DDP小鼠的腫瘤重量(圖5A)。此外,METTL3敲除顯著降低了小鼠腫瘤中的m6A水平和YAP1 蛋白水平(圖5B-C)。這些結(jié)果表明,敲除METTL3通過(guò)降低YAP1蛋白表達(dá)使AGS/DDP細(xì)胞對(duì)順鉑敏感,從而抑制GC中致瘤性。

3 討 論

許多化療藥物被證實(shí)在GC治療中有效,基于順鉑的方案已在臨床上廣泛使用[7]。研究發(fā)現(xiàn),順鉑在化療開始時(shí)表現(xiàn)出80%的高反應(yīng)率;然而,大多數(shù)患者的腫瘤復(fù)發(fā)發(fā)生在6個(gè)月內(nèi)[8]。研究表明,GC細(xì)胞中YAP1蛋白水平上調(diào),這在順鉑耐藥中起重要作用[9]。然而,對(duì)于順鉑耐藥腫瘤中YAP1上調(diào)的機(jī)制仍然知之甚少。在本研究中,我們將METTL3鑒定為順鉑耐藥GC細(xì)胞中YAP1表達(dá)的正調(diào)節(jié)因子。

RNA甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3在mRNA的共有“GGAC”基序內(nèi)催化m6A的形成[10]。盡管mRNA中的m6A修飾已被認(rèn)可近50年,但這些修飾的分布及其在生理學(xué)和疾病中的作用直到最近才被闡明[10]。m6A是mRNA中最豐富的內(nèi)部化學(xué)修飾[11]。值得注意的是,METTL3表達(dá)在幾種腫瘤中上調(diào)。在這里,我們發(fā)現(xiàn)METTL3表達(dá)在順鉑抗性GC細(xì)胞系中增加,而m6A去甲基化酶FTO的表達(dá)沒(méi)有改變,并且由METTL3介導(dǎo)的mRNA的全局m6A修飾也在順鉑抗性GC細(xì)胞中增加。最近的研究表明,m6A促進(jìn)特定mRNA的翻譯以誘導(dǎo)癌癥的耐藥性[12]。YAP1 mRNA被報(bào)道含有m6A修飾[5]。我們假設(shè)順鉑抗性GC細(xì)胞中METTL3表達(dá)和YAP1 mRNA m6A修飾的升高可能促進(jìn)YAP1的翻譯。為了闡明潛在機(jī)制,我們使用了基于熒光素酶的翻譯報(bào)告基因?qū)ζ渲嘘P(guān)系進(jìn)行探索,結(jié)果表明由METTL3介導(dǎo)的m6A修飾增加促進(jìn)了YAP1在順鉑抗性細(xì)胞中的翻譯效率,進(jìn)一步證實(shí)了增加的YAP1蛋白源自增強(qiáng)的mRNA翻譯。

報(bào)道表明,YAP1表達(dá)的增加促進(jìn)了睪丸腫瘤和肝癌對(duì)順鉑的內(nèi)在耐藥性[13-14]。在胃癌中,研究發(fā)現(xiàn),YAP1的上調(diào)增強(qiáng)GC細(xì)胞的順鉑抗性和促進(jìn)了裸鼠異種移植物腫瘤的生長(zhǎng)、順鉑耐藥性[15]。與先前研究一致,在這里,我們進(jìn)一步證明了順鉑抗性胃癌細(xì)胞中的METTL3敲除可降低YAP1表達(dá),從而恢復(fù)了順鉑誘導(dǎo)的順鉑抗性胃癌細(xì)胞凋亡,增加了胃癌細(xì)胞中順鉑的敏感性。此外,我們?cè)谛∈螽惙N移植模型中的發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步支持了敲除METTL3通過(guò)降低YAP1蛋白表達(dá)使AGS/DDP細(xì)胞對(duì)順鉑敏感,從而抑制胃癌中致瘤性?？傊?這些數(shù)據(jù)表明,由METTL3表達(dá)增加介導(dǎo)的YAP1翻譯增強(qiáng)促進(jìn)了胃癌對(duì)順鉑的耐藥性。由于METTL3調(diào)節(jié)幾種mRNA的m6A修飾,未來(lái)的研究應(yīng)該分析來(lái)自順鉑敏感和耐藥腫瘤樣本的m6A修飾轉(zhuǎn)錄組,以確定METTL3是否作為在順鉑耐藥中最關(guān)鍵的靶標(biāo)。此外,盡管已經(jīng)描述了許多介導(dǎo)METTL3功能的下游途徑,但對(duì)調(diào)節(jié)METTL3的上游機(jī)制知之甚少。在未來(lái),我們將嘗試探索METTL3的上游信號(hào)通路,并強(qiáng)調(diào)METTL3相關(guān)通路為治療靶點(diǎn)。

總之,本研究揭示了METTL3誘導(dǎo)的YAP1表達(dá)上調(diào)作為GC中順鉑耐藥的新機(jī)制,并建議METTL3作為化療的新靶點(diǎn)。值得注意的是,最近描述了一種有效的METTL3抑制劑[16]。盡管需要利用METTL3的藥理學(xué)抑制劑進(jìn)行進(jìn)一步研究,以提供有關(guān)METTL3抑制在順鉑耐藥GC中的臨床療效的信息,但本研究結(jié)果強(qiáng)調(diào)了抑制METTL3功能以恢復(fù)GC患者對(duì)順鉑敏感性的可能性。