王吳玥，吳寧，宋睿，韓笑，李錦

（1.南京中醫(yī)藥大學，江蘇 南京 210000；2.軍事科學院軍事醫(yī)學研究院毒物藥物研究所，神經藥理學北京市重點實驗室，北京 100850）

口腔頜面部疼痛是臨床中常見的疼痛類型，主要由牙齒、牙齦、頜骨、顳下頜關節(jié)、口腔黏膜等部位引起，其中損傷和感染導致的炎性痛疾病如：牙髓炎、牙周炎和顳下頜紊亂等在臨床中高發(fā)［1］。目前對于口腔頜面部炎性痛的主要治療藥物為非甾體抗炎類藥物，但仍存在損傷胃腸道和腎及增加心血管系統風險等一系列問題［2］?？谇粐妱┑柔槍Σ』紦p傷處的局部給藥是治療口面部疼痛的常見給藥方式，對于提高治療部位的血藥濃度具有良好效果。因此，尋找新的高效低毒的局部藥物治療方法對于口腔頜面部炎性痛治療具有重要意義。

內源性大麻素系統（endocannabinoid system，ECS）發(fā)現于20世紀，參與調節(jié)情緒、疼痛和免疫等生理過程［3］。研究發(fā)現，通過影響ECS 可改善疼痛，直接給予2 種內源性大麻素N-花生酰乙醇酰胺（anandamide，AEA）和2-花生四烯酰甘油（2-arachidonyl glycerol，2-AG）可抑制疼痛，但表現出代謝快和作用時間短的弊端［4］。隨后，人們又通過給予Ⅰ型大麻素受體（cannabinoid receptor 1，CB1R）或Ⅱ型大麻素受體（cannabinoid receptor 2，CB2R）的高選擇性激動劑來鎮(zhèn)痛，但CB1R 和CB2R 在中樞及外周分布廣泛，會造成典型的大麻素受體激動樣癥狀，引發(fā)全身副作用，可能造成依賴［5］。研究者們開始采用2 種大麻素水解酶抑制劑來鎮(zhèn)痛［6］，但這種方式在某些治療劑量下可引起大麻素過量，從而導致耐受。因此，以上3種方式雖有明確的鎮(zhèn)痛效果，但也并非最終理想的治療手段。大麻二酚（cannabidiol，CBD）是大麻提取物中含量較高的物質之一，無精神活性，安全性較高，是脂肪酸酰胺水解酶（fatty acid amide hydrolase，FAAH）的抑制劑和CB1R 的負性變構調節(jié)劑，可雙向調節(jié)ECS功能。目前已有研究表明，ip給予CBD在角叉菜膠、脂多糖和口腔頜面部炎性痛模型中有良好鎮(zhèn)痛作用［7-9］，但是缺乏局部給予CBD 的藥效學作用研究，且關于口面部炎性疼痛鮮有報道。

鎮(zhèn)痛藥的共同作用機制主要是抑制痛覺上行傳導通路，激活痛覺下行調控通路，調節(jié)內源性痛覺調制系統［10］。其中，中央導水管周圍灰質（periaqueductal gray，PAG）、基底外側杏仁核（basal lateral amygdala，BLA）和前扣帶回皮質（anterior cingulate cortex，ACC）是處理疼痛信息和調節(jié)疼痛的重要腦區(qū)。PAG在內源性痛覺調制系統中起承上啟下作用，凡是激活更高級中樞所產生的鎮(zhèn)痛作用，大多都被證明是通過它才得以實現的，Walker等［11］研究發(fā)現，電刺激PAG發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用時，可檢測到PAG的AEA水平升高；BLA和ACC是痛覺下行抑制以及下行易化系統的重要核團。Silva-Cardoso等［12］發(fā)現，在坐骨神經慢性壓迫損傷模型下，ACC-左側前島葉皮質-BLA 神經環(huán)路參與調節(jié)疼痛，ip給予CBD 可通過激活該通路中的CB1R 來發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。上述3個腦區(qū)內源性大麻素的改變均對疼痛產生影響。但在炎性痛過程中，上述3 個腦區(qū)的內源性大麻素如何變化，以及CBD是否以及如何通過影響這些腦區(qū)的內源性大麻素變化來發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用一直未被闡明。因此，本研究首先通過上唇右側sc注射1%福爾馬林溶液建立口腔頜面部炎性痛模型，該模型具有雙相痛的特點，一相痛時期的行為反應在注射后立即產生，主要是由福爾馬林溶液直接激活痛覺感受器導致的，且反應劇烈持續(xù)約6 min，隨后實驗動物進入間歇期，二相痛時期的行為反應一般在15 min左右開始，程度較一相痛時期弱，往往與炎癥反應和中樞敏化相關，持續(xù)時間可至45 min。然后通過上唇右側sc給予CBD 0.01，0.03和0.06 mg來探究其對于口腔頜面部炎性痛模型一相痛以及二相痛時期的鎮(zhèn)痛作用。接下來利用免疫熒光染色檢測了CBD 對三叉神經脊束核尾側亞核（spinal trigeminal nucleus caudal part，Sp5C）和ACC 的c-Fos 表達水平的影響。最后采用內源性大麻素探針結合光纖記錄的方法，在口腔頜面部疼痛發(fā)生過程中，實時在體探究PAG，BLA 和ACC 的內源性大麻素水平變化特點，探討CBD對于口腔頜面部炎性痛鎮(zhèn)痛作用的可能機制。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑和主要儀器

CBD（云南漢木森生物科技有限公司，批號：L1810L01），氯胺酮（軍事醫(yī)學研究院毒物藥物研究所提供），鹽酸甲苯噻嗪（上海源葉生物科技有限公司，批號：S44817），多聚甲醛粉末（國藥集團化學試劑有限公司，批號：158127）；二甲亞砜溶液（美國Sigma 公司，批號：RNBD1994）；甲醛溶液（國藥集團公司，批號：20210329）；PBS粉末（中國中杉金橋公司，批號：23020301），兔抗小鼠c-Fos單克隆抗體（美國CST公司，批號：2250S），Alexa Fluor 594 標記山羊抗兔IgG 抗體（中國中杉金橋公司，批號：8889S），重組腺相關病毒探針rAAV-hSyn-eCB 2.0（布林凱斯生物技術有限公司，批號：BC-0286），冷凍切片組織包埋劑（美國SAKURA 公司，批號：2499-00），蓖麻油溶液（美國Aladdin 公司，批號：L2145463），自凝牙科水泥（賀利氏古莎齒科有限公司），1454瞬干膠（北京天山新材料技術有限公司）；微量進樣器（上海安亭科學儀器有限公司），雙色單通道光纖記錄儀器、三色單通道光纖記錄儀器（千奧星科南京生物科技有限公司，型號：QAXK-FD-FPSLED，QAXK-FPS-SS-LED），冰凍切片機（德國徠卡公司，型號：CM1900），全景腦片高通量成像系統（日本奧林巴斯公司，型號：VS200）。

1.2 動物和分組處理

56 只雄性SPF 級8 周齡C57BL/6J 小鼠，體重20～22 g（北京斯貝福生物技術有限公司），生產許可證號：SCXK（京）2019-0010。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度22～25 ℃，濕度約50%，明暗交替12 h（早上7∶00-晚上7∶00 燈光照明）。飼養(yǎng)期間，動物可自由攝食及飲水。實驗均在早上9∶00 至下午6∶00 期間進行，并于正式實驗前提前將小鼠放入實驗環(huán)境中適應30 min。實驗中所有動物的處理均符合軍事醫(yī)學研究院倫理審查委員會的要求，倫理審批號：IACUC-2022-024W。分組①其中40 只小鼠隨機分為正常對照組、模型組、模型+CBD（每側0.01，0.03 和0.06 mg）組，每組8 只。分組②剩余的16 只小鼠隨機分為正常對照組、模型組、模型+CBD 0.06 mg組，每組5～6只。

1.3 口腔頜面部炎性痛模型的建立和小鼠抓臉時間檢測

取1.2 分組①小鼠，正常對照組sc 給予10 μL溶劑（2%二甲亞砜+5%蓖麻油），5 min 后sc 給予生理鹽水30 μL；模型組sc給予溶劑10 μL，5 min 后sc 給予1%福爾馬林30 μL；CBD 組分別給予3 個劑量的CBD 10 μL，5 min 后sc 給予1%福爾馬林30 μL。隨即將小鼠放入20 cm×15 cm×20 cm聚乙烯觀察盒中，觀察記錄45 min 內小鼠抓臉時間；以每3 min 作為一個時間點記錄一次抓臉時間。記錄鎮(zhèn)痛作用最強劑量CBD 0.06 mg 組一相痛時期（0～6 min）和二相痛時期（15～45 min）抓臉總時間。

1.4 免疫熒光法檢測小鼠Sp5C 和ACC 腦區(qū)c-Fos蛋白表達水平

1.3 行為實驗結束45 min 后（相當于注射福爾馬林90 min 后），正常對照組、模型組和模型+CBD 0.06 mg 組隨機選取4 只小鼠，麻醉后，依次用生理鹽水和4%多聚甲醛溶液灌流后取腦，并進行冰凍切片，切片厚度30 μm，切取包含Sp5C 和ACC 腦區(qū)的冠狀腦片進行免疫熒光染色。首先用PBS 洗去腦片上的包埋劑，共3 次每次5 min，隨后用PBS配制10%山羊血清，加入Triton X-100（終濃度0.3%）混勻作封閉液。用封閉液37 ℃封閉1 h。結束后，加入用封閉液稀釋的c-Fos 抗體（1∶300），4 ℃孵育18～24 h。24 h后用PBS 漂洗3 次，每次5 min，再加入用封閉液稀釋的Alexa Fluor 594 山羊抗兔IgG 抗體（1∶500），室溫避光孵育2 h，最后PBS 漂洗3 次后用含DAPI 的封片劑封片固定。待封片劑晾干后，放入-20 ℃保存。全景腦片高通量成像系統掃描腦區(qū)，Image J軟件進行c-Fos陽性細胞個數定量統計分析。

1.5 光纖記錄法檢測小鼠PAG，BLA 和ACC 腦區(qū)內源性大麻素表達水平

取1.2 分組②小鼠，采用光纖記錄定量福爾馬林二相痛時期PAG，BLA 和ACC 腦區(qū)的內源性大麻素水平變化。本熒光探針eCB2.0 基于大麻素受體設計，遞質探針與熒光基團偶聯，遞質的變化導致熒光強度發(fā)生變化，這一變化被轉化為電信號，以F值表示。

1.5.1 病毒注射與光纖埋置

小鼠稱重后用氯胺酮100 mg·kg-1和鹽酸甲苯噻嗪50 mg·kg-1麻醉至翻正反射消失，使用碘伏消毒頭皮并使用眼科剪在眼睛到顱骨后部做切口。隨后將小鼠固定在立體定位儀上，在眼睛上涂抹紅霉素眼膏后再用干凈的棉簽蘸取生理鹽水擦拭顱骨表面，過程中保持顱骨表面潔凈干燥。利用立體定位儀找到目標坐標后用顱骨鉆進行打孔并用針挑破硬腦膜。用注射泵輕微接觸Bregma 點并將該點設為零點，然后移至目標位點處，立體定位坐標參考Franklin 和Paxino 的小鼠腦圖譜，前后AP（anterior-posterior，AP），中旁（medial-lateral，ML）和背腹（dorsal-ventral，DV）表示相對于Bregma 距離。PAG 坐標為（AP：-4.55 mm，ML：-0.45 mm，DV：-2.68 mm），BLA 坐標為（AP：-1.5 mm，ML：-3.0 mm，DV：-4.68 mm），ACC 定位為（AP：+1.55 mm，ML：+0.35 mm，DV：-2.35 mm）。鉆孔結束后，吸取病毒并于顱骨下針。將300 nL rAAVhSyn-eCB 2.0 病毒探針［13］以30 nL·min-1速度分別注入每只小鼠PAG，BLA 和ACC 腦區(qū)中，注射結束后，注射玻璃針懸停10 min使病毒充分擴散。

病毒注射完成后，將陶瓷插芯垂直插入病毒原注射位點并深入目的坐標DV 上方0.02 mm，隨后固定陶瓷插芯并將小鼠轉移至飼養(yǎng)籠中飼養(yǎng)。在進行后續(xù)的行為實驗前，小鼠進行3 周手術恢復和表達。

1.5.2 光纖記錄

光纖與小鼠頭部陶瓷插針連接，使用光纖記錄系統采集動物在口腔頜面部炎性痛模型下大腦的熒光信號。實驗前，打開雙色、三色單通道光纖記錄儀提前預熱，光纖先漂白20 min 以避免光纖的自發(fā)熒光影響真實熒光信號。實驗時小鼠插上光纖（小鼠頭部的陶瓷光纖需預先用生理鹽水輕微擦拭），待基線穩(wěn)定后按照1.3 實驗流程給予生理鹽水、福爾馬林和CBD，全程記錄470 nm 和405 nm信號。

1.5.3 光纖記錄數據分析

光纖記錄分析使用千奧星科生物科技有限公司提供的腳本獲取ΔF/F 軌跡，采用當前熒光強度F和基線熒光強度F0的差值再除以基線熒光強度F0的值〔即ΔF/F0=（F-F0）/F0值〕表示熒光強度變化，F0為事件前100 s 信號積分平均值。熒光信號以100 Hz 采樣。在數據分析過程中，以405 nm 激發(fā)光為參考通道，利用MATLAB 軟件，對數據進行預處理，通過運動矯正去除背景噪聲信號，結合多項式矯正算法對信號進行擬合，改善光漂白效應即熒光信號或光纖的自發(fā)熒光由于長時間記錄導致漂白基線逐步下降，從而得到真實熒光數據。分析數據時，選擇注射CBD 或溶劑的前100 s 作為基線，選擇注射福爾馬林或生理鹽水后（1300～4000 s）的二相痛時期進行分析。具體實驗流程參見圖1。

Fig.1 Experimental procedure of fiber photometry recording during phaseⅡin formalin-induced orofacial inflammatory pain.Mice were anesthetized and fixed in the stereotaxic fram.rAAV-hSyn-eCB 2.0 was unilaterally injected into the periaqueductal gray（PAG）,basal lateral amygdala（BLA）and anterior cingulate cortex（ACC）.After three weeks,mice were divided into normal control group,model group,and model+cannabidiol（CBD）0.06 mg group.The normal control group was given 10 μL of vehicle（2% DMSO+5% castor oil）and 30 μL of saline 5 min later.The model group received 10 μL of vehicle followed by 30 μL of 1% formalin after a duration of 5 min.The CBD group received a dosage of 0.06 mg of CBD in 10 μL,followed by 30 μL of formalin solution at a concentration of 1% after a duration of 5 min.The 100 s before injection of CBD or vehicle was calculated as the baseline,analysis was performed through the phase Ⅱpain period (1300-4000 s) after injection of formalin or saline.The fluorescence intensity changes (peak value-valley value) in the PAG,BLA,and ACC were recorded as indexes for analysis.

1.6 病毒注射位置驗證

實驗結束后，進行病毒注射位置驗證。麻醉小鼠后，經心臟灌流4 ℃預冷的PBS 溶液和4%多聚甲醛溶液。灌流結束后迅速取出鼠腦，放入4%多聚甲醛溶液中4 ℃浸泡過夜進行后固定，后固定完成后于4 ℃在PBS 配制的20%和30%蔗糖溶液中梯度脫水2 d，至鼠腦沉至管底脫水完全。隨后進行冰凍切片，切片厚度為30 μm。隨后用PBS 振蕩漂洗3 次，每次5 min，完全洗去包埋液。選擇包含目的腦區(qū)的腦片，滴加DAPI 的防熒光淬滅的封片劑進行封片。待封片劑晾干后，將腦片保存于-20 ℃冰箱或立即使用全景腦片高通量成像系統進行成像。

1.7 統計學分析

實驗數據結果以±s表示，采用GraphPad Prism 8.0軟件作圖，并對數據進行統計分析。45 min內每3 min 的抓臉時間數據采用雙因素方差分析，45 min 內抓臉時間、一相痛和二相痛時期抓臉時間、c-Fos 表達以及不同腦區(qū)內源性大麻素水平變化均采用單因素方差分析，組間比較均采用Bonferroni檢驗，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 CBD 對福爾馬林誘導的口腔頜面部炎性痛模型小鼠抓臉時間的影響

如表1 所示，在45 min 內，與正常對照組相比，模型組小鼠抓臉時間顯著增加（P＜0.01）；與模型組比較，模型+CBD（0.03 和0.06 mg）組小鼠的抓臉時間顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），提示在該模型下，CBD 0.03和0.06 mg具有鎮(zhèn)痛作用，且CBD 0.06 mg鎮(zhèn)痛作用最為顯著。

Tab.1 Effect of CBD on face rubbing time in formalininduced orofacial inflammatory pain model mice

在45 min 內抓臉時間結果（圖2A）顯示，其中0～6 min 為一相痛時期，與正常對照組相比，模型組小鼠在3 和6 min 抓臉時間顯著高于對照組（P＜0.05，P＜0.01），而模型+CBD 0.06 mg 組抓臉時間與模型組相比無顯著差異。15～45 min為二相痛時期，與正常對照組相比，模型組小鼠從18～33 min和45 min的抓臉時間均顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，模型+CBD 0.06 mg組小鼠在21，27和30 min的抓臉時間均顯著降低。一相痛（圖2B）和二相痛（圖2C）總抓臉時間結果顯示，與正常對照組相比，模型組小鼠一相痛（0～6 min）和二相痛（15～45 min）時期的抓臉時間顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，CBD 0.06 mg 可顯著降低小鼠在二相痛時期的抓臉總時間（P＜0.01）。以上結果提示，在該模型下上唇右側sc 給予CBD 0.06 mg 可顯著降低二相痛時期模型小鼠的疼痛反應，具有抗炎性痛作用。

Fig.2 Effect of CBD 0.06 mg on face rubbing time within 45 min（A），phaseⅠ（B）and phaseⅡ（C）pain in formalininduced orofacial inflammatory pain model mice.See Tab.1 for the mouse treatment.±s，n=8.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model group.

2.2 CBD 對福爾馬林誘導的口腔頜面部炎性痛模型小鼠Sp5C和ACC腦區(qū)c-Fos蛋白表達的影響

c-Fos熒光表達實驗結果如圖3所示，與正常對照組相比，模型組小鼠Sp5C 和ACC 腦區(qū)c-Fos 蛋白表達均顯著增多（P＜0.01）；與模型組相比，模型+CBD 組的Sp5C 和ACC 腦區(qū)c-Fos 蛋白表達均顯著減少（P＜0.01）。提示上唇右側sc 給予CBD 0.06 mg 可顯著降低模型小鼠Sp5C 和ACC 腦區(qū)c-Fos 蛋白表達，CBD 通過抑制痛覺上行傳導通路發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。

Fig.3 Effect of CBD 0.06 mg on c-Fos expression in the trigeminal spinal tract nucleus caudal subnucleus（Sp5C）and ACC in formalin-induced orofacial inflammatory pain model mice detected by immunofluorescence analysis.See Tab.1 for the mouse treatment.The arrows indicate c-Fos positive neurons.B and C were the quantitative result of A.±s.n=4.＊＊P＜0.01，compared with normal control group；##P＜0.01，compared with model group.

2.3 CBD對福爾馬林誘導的口腔頜面部炎性痛模型小鼠PAG，BLA和ACC腦區(qū)內源性大麻素變化水平的影響

光纖記錄結果（圖4）顯示，與正常對照組相比，模型組小鼠PAG，BLA 和ACC 腦區(qū)內源性大麻素變化水平均無顯著變化；與模型組小鼠相比，模型+CBD 0.06 mg 組小鼠BLA 腦區(qū)內源性大麻素變化水平顯著升高（P＜0.05）（圖4B）。提示在福爾馬林誘導的口腔頜面部炎性痛二相痛時期，上唇右側sc給予CBD 0.06 mg 可通過上調下行調控通路中內源性大麻素水平來發(fā)揮抗炎性痛作用。

Fig.4 Effect of CBD 0.06 mg on changes of endocannabinoid（ECB）levels in periaqueductal gray（PAG，A），basal lateral amygdala（BLA，B），anterior cingulate cortex（ACC，C）during phase Ⅱpain in formalin-induced orofacial inflammatory pain model mice by fiber photometry recording.See Fig.1 for the mouse treatment.F：raw fluorescence signal；F0：baseline fluorescence signal.Change of levels of ECB=（F-F0）/F0.±s，n=5-6.＊P＜0.05，compared with normal control group.

2.4 探針表達驗證

結果如圖5所示，注射腦核團示意圖如圖5A 所示；熒光表達位置如圖5B 所示，在PAG，BLA 和ACC 腦區(qū)處均可見清晰的綠色熒光信號表達，證明探針表達良好且位置準確；將所納入記錄的小鼠均進行冰凍切片并對于探針埋植位置進行描繪，如圖5C所示均準確埋植于記錄目標位置，表明記錄結果準確可靠。

3 討論

本研究結果顯示，在福爾馬林誘導的口腔頜面部炎性痛模型小鼠預先上唇右側sc 給予CBD 0.03和0.06 mg 可顯著降低二相痛時期小鼠的疼痛反應。CBD 可在二相痛時期發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用，說明其對于炎癥和中樞敏化均可能產生影響［14］，雖然本研究中并未探究CBD的抗炎作用，但有研究表明在礦物油致痛模型大鼠ip 給予CBD 可顯著降低炎性因子IL-1β 的表達［15］。并且，本課題組前期［16］研究發(fā)現，ip 給予CBD（30 和60 mg·kg-1）在福爾馬林誘導的口腔頜面部炎性痛二相痛時期具有鎮(zhèn)痛作用，且可通過降低唇部組織促炎因子來發(fā)揮抗炎性痛作用。以上結果提示CBD 對于緩解口面部炎性痛具積極作用。而在口面部炎性疼痛的臨床治療中，局部給藥可以提高病痛部位的局部藥物濃度，具有便捷、起效快的特點，通常會帶來更高的治療效率和依從性，所以對于這一給藥方式下藥物作用的研究具有較高的臨床價值。已有研究報道，右耳局部涂抹CBD 油10 g·L-1可緩解由巴豆油誘導的右耳炎性痛［17-18］，與本研究CBD 的鎮(zhèn)痛作用相似，進一步說明CBD局部給藥具有良好的生物利用度和治療效果，以上結果可能為之后的CBD 局部治療臨床應用提供實驗證據。

上唇右側sc 給予CBD 是否可以通過影響中樞系統發(fā)揮其鎮(zhèn)痛作用是本研究關心的重點，本研究從中樞系統疼痛調節(jié)中重要的神經物質基礎-疼痛環(huán)路中的上行傳導和下行抑制兩個方面對CBD 鎮(zhèn)痛作用機制進行了探究，但是需要指出的是本實驗中局部給予CBD 的鎮(zhèn)痛作用也可能是首先通過影響注射部位的炎癥反應或者抑制口腔頜面部痛覺感受器的電活動，導致痛覺信號向中樞傳導的水平受到抑制，從而導致相關腦區(qū)c-Fos 因疼痛所激活的神經元數量下降，以及內源性大麻素的水平改變。CB2R 和瞬時感受器電位香草酸1 型受體（transient receptor potential vanilloid receptor 1，TRPV1R）很可能參與到CBD 鎮(zhèn)痛的外周受體機制。CB2R 主要分布于外周免疫系統，廣泛參與炎癥調節(jié)；TRPV1R 主要分布于傷害性感覺神經元，在體內主要參與傷害性信號的傳導以及痛覺調制。CBD 抑制FAAH 會使得AEA 升高，而AEA 可以激動CB2R 以及TRPV1R［19-20］，Costa 等［21］發(fā)現ip 給予TRPV1R 抑制劑可逆轉CBD 在完全弗氏佐劑誘導的足底炎性痛模型下的鎮(zhèn)痛作用，而Negrete等［22］在與上述相同疼痛模型中可通過ip給予CB2R激動劑從而影響一氧化氮信號通路來發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。另外，FAAH 水解AEA 后產物花生四烯酸是前列腺素的合成前體，CBD 也可能通過抑制FAAH 減少前列腺素的合成從而達到鎮(zhèn)痛作用。對于上行傳導通路，本研究選取了與口面部疼痛調節(jié)最為密切的2個腦區(qū)Sp5C與ACC進行研究。本研究結果顯示，預先sc 給予CBD 可顯著降低Sp5C 和ACC腦區(qū)的c-Fos 陽性神經元數量，提示CBD 可通過抑制痛覺上行傳導通路來發(fā)揮其作用。需要指出的是，有關口面部疼痛環(huán)路的最新報道發(fā)現臂旁核是Sp5C 的下級核團，因此本研究如果增加對于臂旁核c-Fos的檢測會更具有說服力。

研究表明，在疼痛狀態(tài)下會引起腦內或疼痛部位內源性大麻素變化，Guindon 等［4］對注射福爾馬林5 和35 min 后的大鼠足部進行取材，發(fā)現足爪背部中端和足爪背部近端的2-AG水平升高；Beaulieu等［23］檢測了不同濃度福爾馬林（0.9%，1%，2.5%和5%）誘導的相同模型的足底AEA 含量，結果發(fā)現AEA 含量均無顯著變化。Petrosino 等［5］在神經病理性疼痛模型中發(fā)現第7 天的AEA 和2-AG 水平均顯著升高，而第3 天PAG 腦區(qū)的2-AG 無變化。內源性大麻素在腦內含量極低，且有著按需合成、降解迅速的特點。因此，即使采用更為靈敏的高效液相方法檢測組織中的內源性大麻素含量，在某些研究中仍由于處死動物后進行檢測很可能錯過了相應變化窗口，導致并未檢測出內源性大麻素變化。本研究首次在急性痛模型下采用最新的內源性大麻素探針結合光纖記錄的方式，在疼痛的不同階段精準并實時在體的記錄內源性大麻素變化，結果顯示，預先sc 給予CBD 可顯著升高二相痛時期BLA的內源性大麻素水平，但對其他兩個腦區(qū)內源性大麻素水平無顯著影響。有研究表明，激活BLA-前額葉皮質-PAG 這條下行抑制系統神經環(huán)路可發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用［24］；而Yin等［25］發(fā)現，腹外側中央導水管周圍灰質（ventrolateral periaqueductal gray，vlPAG）-中央內側核-BLA的新型神經環(huán)路參與疼痛調節(jié)，表明BLA-PAG 具間接雙向投射關系。內源性大麻素中AEA水平升高會激活CB1R，有研究表明，電針可通過激活vlPAG 的GABA 能神經元中CB1R 來發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用［26］；而Deli 等［27］研究發(fā)現，在福爾馬林炎性痛模型中可通過激活BLA 的CB1R 來發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。因此，推測CBD的中樞鎮(zhèn)痛作用可能通過BLA 的內源性大麻素水平升高進而激動下行抑制系統來發(fā)揮。在中樞層面，5-羥色胺1A受體（5-hydroxytryptamine 1A receptor，5-HT1AR）同樣參與疼痛調節(jié)，CBD 是5-HT1AR 的激動劑，Thapa 等［28］發(fā)現，ip給予5-HT1AR 拮抗劑WAY100635 可抑制CBD 在角膜疼痛模型下的鎮(zhèn)痛作用，表明CBD在炎性痛中的中樞受體機制復雜，因而在后續(xù)實驗中仍需通過ip給予相關受體拮抗劑來探究其中樞受體機制。關于本研究中對于其他腦區(qū)內源性大麻素水平并無變化的現象，可能與取材部位及模型不同有關。此外，炎癥部位和中樞內源性大麻素的變化在時程上并不統一，而神經病理性疼痛在疼痛發(fā)生時即可迅速通過初級神經元傳導至中樞產生痛覺，并引發(fā)較炎癥性疼痛更為持久的中樞敏化。需要指出的是，大麻素在腦中含量極低，其變化不容易捕捉，并且在本研究記錄過程中發(fā)現一些小鼠的記錄噪音較大，故采用了組別變化值（最高值-最低值）進行比較。本研究仍存在不足，以上結果并不能反映內源性大麻素在絕對量上的改變，在之后的實驗中還應測量絕對量的變化。另外，本研究光纖埋置更偏向于背外側中PAG，但也有文獻報道腹外側PAG 參與調節(jié)內源性大麻素系統與鎮(zhèn)痛，如Yuan等［29］在腹外側PAG 給予CB1R 拮抗劑AM251 后可逆轉電針對骨關節(jié)炎的鎮(zhèn)痛作用，提示后續(xù)研究可對于PAG進行亞區(qū)的細分，以便進一步探究CBD抗口腔頜面部炎性痛的中樞機制。

綜上所述，本研究發(fā)現，sc 給予CBD 對于福爾馬林誘導的口面部疼痛具有良好的鎮(zhèn)痛作用，這一作用可能與CBD 抑制痛覺上行傳導以及激活下行抑制通路有關。