唐 琛，蘭 瑞，付雪琴，王瑋瑋，鄒旭歡，王漫漫，李泓宇，劉 雙

（1.河南中醫(yī)藥大學(xué)，鄭州 450000；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，鄭州 450000）

缺血性腦卒中是由于血栓阻塞大腦動脈而出現(xiàn)局部腦組織缺血缺氧的一種血管疾病，已經(jīng)成為了全球致殘和死亡的第二大原因［1］。 急性缺血性卒中會引起不可逆轉(zhuǎn)的腦損傷，最終導(dǎo)致局灶性神經(jīng)功能障礙［2］。 患者由于神經(jīng)功能的損傷，失去了正常工作和學(xué)習(xí)的能力，給國家與人民帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。 最近有證據(jù)表明，非編碼RNA 參與了缺血性腦卒中的細(xì)胞和分子過程，觸發(fā)了特定的生理病理反應(yīng)，對卒中后的功能恢復(fù)造成了較大影響［3－4］。

近年來，隨著檢測技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多非編碼RNA 在不同生物學(xué)過程中被發(fā)現(xiàn)。 環(huán)狀RNA 是一種非編碼RNA，其經(jīng)歷了一個(gè)環(huán)化過程，沒有典型末端結(jié)構(gòu)，是一種共價(jià)閉合的連續(xù)環(huán)［5］。circRNA 能通過調(diào)節(jié)microRNAs 來調(diào)控基因表達(dá)，并作為潛在的生物標(biāo)志物發(fā)揮作用。 其對RNA 外切酶具有抵抗力，能夠被microRNA 轉(zhuǎn)化為線形RNA，成為內(nèi)源RNA 的競爭者。 circRNA 能在體內(nèi)進(jìn)行翻譯，其異常的表達(dá)與人體多種疾病都具有聯(lián)系［6］。

1 缺血性腦卒中的病理機(jī)制

缺血性腦卒中的基本病理因素是血管內(nèi)的血栓形成，進(jìn)而造成局灶性神經(jīng)元缺失和腦組織的壞死。 50%的缺血性腦卒中是由動脈粥樣硬化及其斑塊破裂所引起，20%是心源性的腦卒中，25%是由小血管病變所致的腔隙性腦梗死，5%的缺血性卒中是由一些特殊原因，如顱外動脈夾層等因素導(dǎo)致［7］。卒中后，機(jī)體經(jīng)歷了小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，線粒體功能障礙，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等多個(gè)病理過程。 當(dāng)卒中發(fā)生后，神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，程序性死亡通路被激活［8］；損傷的腦細(xì)胞釋放出鞘氨醇－1－磷酸，趨化因子等多種物質(zhì)，促使小膠質(zhì)細(xì)胞迅速向病變部位遷移，并使其形態(tài)與功能產(chǎn)生巨大變化，對死亡細(xì)胞和細(xì)胞碎片進(jìn)行吞噬［9］。 腦組織缺氧后，啟動糖酵解進(jìn)行能量代償，代償產(chǎn)生的乳酸使pH 下降，引發(fā)酸中毒和線粒體膜電位的降低。 同時(shí)能量代謝障礙使ATP 酶所依賴的離子泵失活，引起細(xì)胞內(nèi)的鈣離子超載，對線粒體造成損傷［10］。 在腦組織恢復(fù)血供后，“缺血－再灌注損傷”對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)造成影響，使得將大量未折疊的錯誤蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中聚集，激活未折疊蛋白反應(yīng)，進(jìn)一步加重腦損傷，甚至引發(fā)細(xì)胞凋亡［11］。

2 circRNA 的生物學(xué)功能

1976 年，circRNA 首次被人類報(bào)道發(fā)現(xiàn)［12］。 由于數(shù)量較少，circRNA 最初被研究人員認(rèn)為是一種“類病毒”，是選擇性剪接錯誤產(chǎn)生的副產(chǎn)品，對某些高等植物具有致病性。 隨著生物信息技術(shù)的不斷發(fā)展，經(jīng)過大量的轉(zhuǎn)錄分析后，越來越多的circRNA 出現(xiàn)在人類的視野中［13］。 Salzman 等［14］不僅在人類的細(xì)胞中檢測出了多種circRNA，還證明了這是人類細(xì)胞基因表達(dá)程序的普遍特征。 研究發(fā)現(xiàn)，組織細(xì)胞中circRNA 的含量比長鏈信使RNA（linear mRNA）更為豐富，有些甚至能夠達(dá)到linear mRNA 的10 倍以上［15－16］。 此外，circRNA 在人體組織中的分布也十分廣泛，其存在于各種器官和組織，如大腦、腸道、心臟、肝、肺、皮膚、骨骼肌、脂肪、血管等［17］。 circRNA 可根據(jù)結(jié)構(gòu)分為內(nèi)含子環(huán)化、外顯子環(huán)化以及內(nèi)含子－外顯子共同環(huán)化三種類型［18］；與linear mRNA 相比，其元典型的末端結(jié)構(gòu)，circRNA 的3’和5’端連接在一起，形成了一個(gè)共價(jià)閉合 的 環(huán) 狀 結(jié) 構(gòu)， 因 此 其 更 加 穩(wěn) 定［19］。 由 于circRNA 的獨(dú)特結(jié)構(gòu)，使它們能夠在樣品處理中選擇性富集，更適合一些疾病的診斷，其在某些疾病當(dāng)中的異常表達(dá)已得到證實(shí)，如神經(jīng)元紊亂、動脈粥樣硬化等［20］。 circRNA 有一定的特異性，在不同的時(shí)間、不同物種、不同疾病中的表達(dá)差異巨大；而且circRNA 還能模擬競爭性內(nèi)源RNA 的角色，改變基因的表達(dá)方式［21］。 微小RNA（microRNAs）是一種小型非編碼RNA，其參加了細(xì)胞增殖、遷移、分化和凋亡在內(nèi)的多種細(xì)胞事件的轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控，在基因調(diào)控與生物的正常發(fā)育方面扮演著重要角色［22］。 研究表明，部分circRNA 可以通過調(diào)控microRNAs 的活性，從而在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，這一過程被稱為microRNA 海綿［23］。 值得關(guān)注的是，盡管circRNA 在基因表達(dá)調(diào)控中的機(jī)制和其確切作用尚未被完全闡明，但學(xué)者普遍認(rèn)為，circRNA 在未來具有很大潛力成為臨床診斷標(biāo)記物和疾病的新型治療靶點(diǎn)。

3 circRNA 與缺血性腦卒中的相關(guān)性

由于只有一小部分基因能夠合成circRNA，circRNA 的表達(dá)水平在所有組織中都較低。 然而，在大腦中circRNA 的含量遠(yuǎn)高于心臟、肝、肺等其他組織［24］。 在人腦中發(fā)現(xiàn)的circRNA 高達(dá)65 731種［25］，因此circRNA 很有可能參與了大腦的功能調(diào)節(jié)。 最近的研究結(jié)果顯示，circRNA 及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)與神經(jīng)系統(tǒng)和血管系統(tǒng)關(guān)系密切，circRNA 可以抑制神經(jīng)元凋亡和自噬，增強(qiáng)神經(jīng)可塑性，促進(jìn)微血管的生成，減少血腦屏障的損傷［26］。 腦卒中發(fā)病機(jī)制與神經(jīng)炎癥、能量衰竭、興奮性毒性、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激、鐵死亡等相關(guān)［27－28］，上調(diào)卒中后miRNAs水平，如miR-9、miR-424、let-7c、miR-99a、miR-207、miR-29c、miR-122 和miR-210 等能夠預(yù)防上述病理事件。 卒中后改變的circRNAs 被發(fā)現(xiàn)包含許多miRNAs 結(jié)合位點(diǎn)，表明它們可能調(diào)節(jié)miRNA 介導(dǎo)翻譯過程，從而影響腦卒中的病理過程［29］。

4 缺血性腦卒中領(lǐng)域circRNA 的應(yīng)用

4.1 circRNA 有望成為缺血性腦卒中的治療靶點(diǎn)

隨著高通量測序技術(shù)的不斷發(fā)展，circRNA 在缺血性腦卒中領(lǐng)域的研究也不斷深入。 大量的臨床觀察和實(shí)驗(yàn)研究證明，多數(shù)circRNA 能夠通過海綿吸附microRNA 或作用于下游調(diào)節(jié)因子等方式參與缺血性腦卒中的調(diào)控。 雖然circRNA 的具體調(diào)控機(jī)制仍需要進(jìn)一步的研究，但不少學(xué)者認(rèn)為在缺血性腦卒中領(lǐng)域circRNA 具有非常良好的應(yīng)用前景。circRNA 在臨床診療上具有重大意義，其對缺血性腦卒中具有雙重調(diào)節(jié)作用。 某些circRNA 能夠減輕急性缺血性腦卒中（acute ischemic stroke，AIS）的炎癥反應(yīng)、保護(hù)星形膠質(zhì)細(xì)胞、增強(qiáng)神經(jīng)元的可塑性，促進(jìn)患者卒中后的功能恢復(fù)。 而另一些circRNA 則發(fā)揮負(fù)面作用，如激活腦梗死周圍皮質(zhì)的星形膠質(zhì)細(xì)胞；加劇腦水腫；加重缺血性卒中急性期的腦損傷等。 增加具有保護(hù)作用circRNA 的表達(dá)，可以促進(jìn)患者的病情恢復(fù)；對負(fù)面效果的circRNA 進(jìn)行沉默或者基因敲除，同樣能夠?qū)δX卒中起到治療作用（表1）。

表1 circRNA 在缺血性腦卒中領(lǐng)域的意義Table 1 Significance of circRNA in the field of ischaemic stroke

4.1.1 缺血性腦卒中后發(fā)揮保護(hù)作用的circRNA

circSCMH1：Yang 等［30］發(fā)現(xiàn)，與常人相比，急性缺血性卒中患者血漿中環(huán)狀 RNA SCMH1（circSCMH1）的水平顯著降低，在卒中小鼠的血漿和梗死灶周圍皮質(zhì)中circSCMH1 的水平也明顯下降。 并且使用細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）技術(shù)，將circSCMH1 輸入卒中患者腦內(nèi)，顯著促進(jìn)了患者卒中后的功能恢復(fù)。 證明circSCMH1 的應(yīng)用增強(qiáng)了神經(jīng)元的可塑性，抑制了神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)和外周免疫細(xì)胞的滲透。

circRNA-0025984：Zhou 等［31］使用熒光素酶報(bào)告基因分析，證實(shí)了circRNA-0025984 和ten-eleven translocation methylcytosine dioxygenase 1（TET1）分別是miR-1433p 的海綿和靶標(biāo)。 在模擬缺血條件下培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中，circRNA-0025984 顯著減少。 circRNA-0025984 過表達(dá)明顯減少了星形膠質(zhì)細(xì)胞的自噬和凋亡，這種神經(jīng)保護(hù)作用與miR-143-3p 的直接海綿作用有關(guān)，miR-143-3p 進(jìn)而直接靶向TET1。 TET1 通過使其啟動子去甲基化而顯著誘導(dǎo)ORP150 表達(dá)，從而增加GRP78 水平。 該研究表明circRNA-0025984 可 以 通 過 miR-143-3p／TET1／ORP150 通路減輕缺血性卒中損傷并保護(hù)星形膠質(zhì)細(xì)胞。

circ-FoxO3：Yang 等［32］發(fā)現(xiàn)在小鼠大腦中動脈阻塞／再灌注模型中，circ-FoxO3 上調(diào)了腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的自噬通量。 circ-FoxO3 通過與mammalian target of rapamycin（mTOR）和E2F1 相互作用激活自噬，從而觸發(fā)細(xì)胞毒性聚集體的自噬降解。 自噬能夠把受損的細(xì)胞器清除，并將它們轉(zhuǎn)化為營養(yǎng)物質(zhì)，從而確保細(xì)胞的病理狀態(tài)下存活［33］。 circ-FoxO3 通過抑制mTORC1 來促進(jìn)自噬，以減少缺血／再灌注時(shí)血腦屏障的損傷。

circ-DLGAP4：Zhu 等［34］采用定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測了170 名AIS 患者外周血單核細(xì)胞中circ-DLGAP4 和miR-143 的表達(dá)。 研究顯示AIS 患者外周血單核細(xì)胞中circ-DLGAP4 的表達(dá)水平明顯下調(diào)，且與miR-143 的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)；而miR-143已經(jīng)被證明是一個(gè)促炎基因［35－36］。 circ-DLGAP4 能通過海綿吸附促炎microRNA，如miR-143，來減輕AIS 的炎癥反應(yīng)，且其表達(dá)水平與AIS 病情嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)。

4.1.2 缺血性腦卒中后發(fā)揮損害作用的circRNA

circCDC14A：Zuo 等［37］發(fā)現(xiàn)在急性卒中后，患者血 漿 中 circCDC14A 表 達(dá) 明 顯 升 高， 證 實(shí)circCDC14A 和卒中有關(guān)，并且可作為急性缺血性卒中診斷和預(yù)測預(yù)后生物標(biāo)志物［38］。 進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，通過慢病毒干擾卒中小鼠circCDC14A 表達(dá)，可顯著減少再灌注72 h 的腦死塞體積和3 d、5 d、7 d梗死區(qū)皮質(zhì)活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞密度。 表明下調(diào)circCDC14A 表達(dá)能減輕腦梗塞周圍皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活，從而減輕缺血性卒中急性期腦損傷。

circTTC3：Toll like receptor 4（TLR4）已被證實(shí)在卒中進(jìn)展過程中參與神經(jīng)干細(xì)胞的調(diào)控［39］。Yang 等［40］發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注損傷小鼠circTTC3的表達(dá)顯著增加，circTTC3 的缺失可減輕腦梗塞、改善神經(jīng)功能和降低腦含水量。 同時(shí)，circTTC3 的缺失下調(diào)了TLR4 的表達(dá)，miR-372-3p 抑制劑可以逆轉(zhuǎn)這一作用。 研究證實(shí)，在腦梗死中，circTTC3 可通過miR-372-3p／TLR4 軸調(diào)控腦缺血再灌注損傷。

circCELF1：Li 等［41］通過RT-qPCR 法和Western blot 法分別檢測了RNA 和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，從而探究circCELF1 的表達(dá)對星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡和自噬的影響。 RT-qPCR 的結(jié)果分析表明，在缺氧－葡萄糖剝奪／復(fù)氧（OGD／R）誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞模型中，circCELF1 的表達(dá)顯著增加，通過上調(diào)NFAT5 水平，誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡和自噬。 在circCELF1的基因敲除后，星形膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡和自噬受到了抑制。 用短暫性大腦中動脈閉塞（tMCAO）小鼠模型進(jìn)行的體內(nèi)研究也表明circCELF1 的基因敲除有助于減輕神經(jīng)損傷。

circHIPK2：Wang 等［42］發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)干細(xì)胞中過表達(dá)的circHIPK2 減少了神經(jīng)元的分化；而circHIPK2 的沉默促進(jìn)了神經(jīng)元的分化。 沉默circHIPK2 后對神經(jīng)元具有持續(xù)的保護(hù)作用。 除此之外，研究還發(fā)現(xiàn)精胺氧化酶（spermine oxidase，Smox）是circHIPK2 重要的下游調(diào)節(jié)因子，而Smox屬于多胺氧化酶的一種，其已經(jīng)被證明與缺血性腦損傷密切相關(guān)［43］。 沉默circHIPK2 可以有效促進(jìn)卒中后的功能恢復(fù)，改善腦可塑性；circHIPK2 的沉默有望成為缺血性卒中治療的有效手段。

4.2 circRNA 有望成為缺血性腦卒中的生物標(biāo)記物并進(jìn)行預(yù)后評價(jià)

生物標(biāo)記物有助于進(jìn)行疾病的早期診斷及后期監(jiān)測，對了解疾病的病因和發(fā)病機(jī)制具有很好的輔助作用。 長鏈非編碼RNA（lncRNA）已經(jīng)被認(rèn)為是卒中潛在的生物標(biāo)記物［44］。 在缺血性腦卒中的發(fā)生發(fā)展中，circRNA 同樣起到了重要作用，其成為缺血性腦卒中診斷方法和評估患者預(yù)后的可能性正在被眾多學(xué)者關(guān)注。

Zu 等［45］對200 例72 h 內(nèi)AIS 的患者進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)大動脈粥樣硬化性卒中、小動脈閉塞型卒中、心源性栓塞型卒中3 種circRNA 水平均顯著升高；在起病24 h 內(nèi)入院的患者中，早期神經(jīng)功能惡化（early neurological deterioration， END） 患 者 的circFUNC1 水平顯著高于無END 的患者。 發(fā)病24 h 內(nèi)的circFUNDC1 的表達(dá)水平與患者的基線及第7天NIHSS 評分呈正相關(guān)。 研究表明，在卒中24 h 之內(nèi)，檢測外周血中circFUNC1 水平能夠反映神經(jīng)功能障礙的嚴(yán)重程度，對于急性卒中的轉(zhuǎn)歸和長期存活而言，circFUNC1 可能是一個(gè)潛在的預(yù)測指標(biāo)。

Zheng 等［46］對急性缺血性卒中患者進(jìn)行了一項(xiàng)病例對照研究，探究了患者NIHSS 評分、腦缺血時(shí)間與hsa＿circ＿0004099 表達(dá)水平的相關(guān)性，并構(gòu)建了接收者操作特性分析（ROC）曲線。 結(jié)果表明，NIHSS 評分、腦缺血時(shí)間均與hsa＿circ＿0004099 表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)；hsa＿circ＿0004099 的表達(dá)水平在一定程度上反映了腦缺血的嚴(yán)重程度。 ROC 曲線分析顯示，hsa＿circ＿0004099 的表達(dá)曲線下面積（AUC）是0.923，其對AIS 的發(fā)生有良好的預(yù)測價(jià)值。 因此hsa＿circ＿0004099 是一種能夠診斷AIS 和判斷患者預(yù)后的潛在工具，具有極大的臨床價(jià)值。

Liu 等［47］從大腦中動脈閉塞小鼠的缺血半暗帶中篩選circOGDH，并采用定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測AIS 患者血漿中的circOGDH 含量。 結(jié)果顯示，大腦中動脈閉塞小鼠的缺血半暗帶和AIS 患者血漿中的circOGDH 表達(dá)顯著提升。 與無腦血管疾病的對照組相比，circOGDH 的表達(dá)增強(qiáng)了50 倍以上。 此外，在AIS 患者血漿中circOGDH 的表達(dá)水平與缺血半暗帶的大小呈正相關(guān)。 這些結(jié)果表明circOGDH 可能是檢測缺血半暗帶的一種敏感的特異性標(biāo)記物；在臨床中，檢測患者血漿中circOGDH 的含量將是一種方便、快速、經(jīng)濟(jì)的缺血半暗帶預(yù)測方法。

5 總結(jié)和展望

缺血性腦卒中的早診斷，早治療是影響患者預(yù)后轉(zhuǎn)歸的關(guān)鍵所在。 現(xiàn)今缺血性腦卒中的診斷主要依靠影像學(xué)檢查，如CT、MRI 等方法，暫時(shí)缺乏能夠廣泛運(yùn)用于臨床和判斷患者預(yù)后的生物標(biāo)志物［48］。 目前的治療方式以藥物治療、血管治療以及靜脈溶栓等方式為主；但靜脈溶栓治療存在治療時(shí)間窗口窄、療效差等缺點(diǎn)。 因此，尋找可靠的生物標(biāo)記物和新型治療方法對本病至關(guān)重要。 近年來，隨著高通量測序技術(shù)的不斷發(fā)展，人們對非編碼RNA 的研究也逐漸增多。 研究發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)血管單元中，circRNA 扮演了重要角色，參與了缺血性腦卒中如神經(jīng)炎癥、神經(jīng)元死亡、血腦屏障損傷、動脈粥樣硬化等多個(gè)環(huán)節(jié)，其可能是缺血性腦卒中診療的理想靶點(diǎn)［49］。 盡管circRNA 與缺血性腦卒中之間的關(guān)系研究還處在初級階段，但隨著眾多學(xué)者的密切關(guān)注， circRNA 已經(jīng)成為了新的研究熱點(diǎn)，circRNA 有望在未來幾年內(nèi)應(yīng)用于缺血性腦卒中的診斷和治療。

缺血性腦卒中后，circRNA 出現(xiàn)顯著的差異性表達(dá)，大多circRNA 可通過海綿吸附microRNA，引起microRNA 下游腦卒中相關(guān)靶基因的釋放，通過作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞、激活細(xì)胞自噬、減少炎癥反應(yīng)等過程對缺血性卒中進(jìn)行調(diào)控。 動物實(shí)驗(yàn)和臨床研究結(jié)果顯示，沉默或過表達(dá)某些circRNA 能夠?qū)θ毖阅X卒中起到顯著治療作用；circRNA 的研究成果為缺血性腦卒中的診療提供了新的可能。但由于目前對circRNA 的機(jī)制研究仍較缺乏，circRNA 的應(yīng)用仍面臨許多挑戰(zhàn)，希望在未來能夠?qū)ircRNA 的作用進(jìn)行深入研究，并將其應(yīng)用于臨床，成為缺血性腦卒中的新療法。