劉嬌，周蓓，易蔚，陳明惠

廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530200

從過去的100 年至今，全世界暴發(fā)了多次全球性的流感大流行[1]。全人群對(duì)流感普遍易感，而兒童在流感季節(jié)是重點(diǎn)關(guān)注群體[2]，在每年流行季節(jié)兒童罹患率為20%～30%，特定地區(qū)的兒童流感罹患率可達(dá)到50%左右[3]。甲型流感是春季易流行的常見流感病毒，且甲型流感病毒易變異，流感疫苗預(yù)防接種不能有效預(yù)防變異毒株的感染[4]，西醫(yī)針對(duì)甲型流感常用神經(jīng)氨酸酶抑制劑奧司他韋作為首選用藥[5]，但存在甲型流感病毒耐藥的風(fēng)險(xiǎn)，小兒豉翹清熱顆粒治療兒童甲型流感有顯著效果[6]，且在流行性感冒診療方案、兒童流感中西醫(yī)結(jié)合等專家共識(shí)中作為推薦用藥[7-8]。臨床報(bào)道發(fā)現(xiàn)聯(lián)用小兒豉翹清熱顆粒比單用奧司他韋在使癥狀改善、加快病毒轉(zhuǎn)陰等方面，具有明顯療效[9]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于疾病-靶點(diǎn)-藥物的多層網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，從系統(tǒng)角度預(yù)測藥物靶點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了傳統(tǒng)藥物與現(xiàn)代科學(xué)的接軌，是中醫(yī)藥領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[10-11]。使中醫(yī)現(xiàn)代化具有潛在的發(fā)展前景。分子對(duì)接是研究配體和受體相互作用，并預(yù)測其結(jié)合模式和親合力的一種理論模擬方法[12]，為新型藥物的研發(fā)提供了一個(gè)較好的工具[13]。因此，本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)，分析小兒豉翹清熱顆粒治療甲型流感的作用機(jī)制，為后續(xù)研究提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫信息

UniProt 數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org）；中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)（TCMSP）數(shù)據(jù)庫（https://old.tcmspe.com/tcmsp.php）；GeneCars 數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org）；OMIM 數(shù)據(jù)庫（https://omim.org）；TTD 數(shù)據(jù)庫（https://db.idrblab.net/ttd）；PharmGkb 數(shù)據(jù)庫（https://www.pharmgkb.org）；STRING 數(shù)據(jù)庫（https://cn.string-db.org）；DAVID 數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov）；微生信官網(wǎng)（https://www.bioinformatics.com.cn）。

1.2 篩選藥物及疾病靶點(diǎn)

小兒豉翹清熱顆粒藥物組成有連翹、淡豆豉、薄荷、荊芥、炒梔子、大黃、青蒿、赤芍、檳榔、厚樸、黃芩、半夏、柴胡、甘草，運(yùn)用中草藥系統(tǒng)藥理學(xué)平臺(tái)TCMSP 數(shù)據(jù)庫篩選藥物活性成分，篩選條件為口服生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18[14]。利用UniProt蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫查詢藥物靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的基因名。以“H1N1 influenza A virus”“H1N1”“human influenza A virus”“influenza A”為關(guān)鍵詞檢索疾病靶點(diǎn)，借助GeneCards、OMIM、TTD 及PharmGkb 數(shù)據(jù)庫篩選疾病靶點(diǎn)，GeneCards 靶點(diǎn)篩選條件Relevance score≥5，將獲取疾病靶點(diǎn)取并集。

1.3 構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

將篩選出的藥物活性成分及靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1 軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化，構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 構(gòu)建蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖

將藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)取交集作為治療兒童甲型流感的潛在治療靶點(diǎn)，將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，預(yù)測基因靶點(diǎn)之間相互關(guān)聯(lián)，設(shè)置“organisms”為“HomoSapiens”，最低互作閾值設(shè)置為0.400，將預(yù)測結(jié)果PPI網(wǎng)絡(luò)圖數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1 軟件中可視化。

1.5 基因本體（GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路分析

將交集基因?qū)隓AVID 生物信息數(shù)據(jù)庫中，“SelectIdentifier”選擇為“OFFICIAL_GENE_SYMBOL”，物種選擇為“Homo_sapiens”，進(jìn)行GO富集分析和KEGG 富集分析，得到生物過程（BP）、細(xì)胞組成（CC）、分子功能（MF）及KEGG 通路分析數(shù)據(jù)，將數(shù)據(jù)結(jié)果運(yùn)用微生信在線平臺(tái)繪制出GO 富集和KEGG 通路可視化圖。

1.6 分子對(duì)接

借助Cytoscape 3.9.1 軟件中“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖數(shù)據(jù)信息，將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1 軟件中，取與交集靶點(diǎn)相連的網(wǎng)絡(luò)成分，新建交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)可視化圖，根據(jù)degree 大小排序得到排名靠前的小分子配體。借助PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，根據(jù)degree 排名，得到排名靠前的大分子受體。利用PubChem 下載小分子配體 3D 結(jié)構(gòu)，并運(yùn)用OpenBabelGUI 軟件進(jìn)行格式轉(zhuǎn)化mol2 結(jié)構(gòu)；通過UniProt 數(shù)據(jù)庫及PDB 數(shù)據(jù)庫結(jié)合分析找到大分子受體的蛋白結(jié)構(gòu)，利用PyMol 軟件對(duì)大分子蛋白去配體、去水分子等處理，并運(yùn)用AutoDockTool 軟件對(duì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行加氫、活性口袋等處理，借助Autodockgrid 及Autodocktool 計(jì)算結(jié)合能，最后運(yùn)用PyMol 軟件進(jìn)行結(jié)果可視化。

2 結(jié)果

2.1 有效活性成分篩選

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫篩選出小兒豉翹清熱顆粒共有245 種藥物活性成分，獲取藥物活性成分信息，根據(jù)OB 排序，前30 個(gè)化學(xué)成分見表1，借助UniProt進(jìn)行靶點(diǎn)規(guī)范化，得到269 個(gè)藥物靶點(diǎn)。

表1 小兒豉翹清熱顆?；钚曰衔颰able 1 Active components in Xiaoer Chiqiao Qingre Granules

2.2 疾病靶點(diǎn)篩選

通過GeneCards、OMIM、TTD 及PharmGkb 數(shù)據(jù)庫共同篩選疾病靶點(diǎn)，其中在GeneCards 數(shù)據(jù)庫中篩選出1 545 個(gè)甲型流感相關(guān)基因，OMIM 數(shù)據(jù)庫中篩選出520 個(gè)甲型流感相關(guān)基因，TTD 篩選出3 個(gè)甲型流感相關(guān)基因，PharmGkb 數(shù)據(jù)庫篩選出9個(gè)相關(guān)甲型流感基因，取并集，得到2 045 個(gè)疾病靶點(diǎn)。將藥物基因與疾病基因取交集，借助Venny 2.1 繪制韋恩圖，共獲得131 個(gè)交集靶點(diǎn)，見圖1。

圖1 藥物-疾病靶點(diǎn)韋恩圖Fig.1 Venn diagram of drug-disease target

2.3 “藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將TCMSP、UniProt 數(shù)據(jù)庫獲得的相關(guān)藥物活性成分及靶點(diǎn)基因數(shù)據(jù)信息，通過Cytoscape 3.9.1構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2。通過網(wǎng)絡(luò)分析共獲得484 個(gè)節(jié)點(diǎn)和4 474 條邊。根據(jù)“藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，將藥物所有小分子的節(jié)點(diǎn)大小用“degree”表示，得到活性小分子得分排序?yàn)椋洪纹に兀?31）、豆甾醇（239）、山柰酚（229）、β-谷甾醇（224）、木犀草素（166）、黃芩素（131）、漢黃芩素（82）、柚皮素（70）。這些小分子可能是小兒豉翹清熱顆粒的關(guān)鍵活性成分。

圖2 藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Network diagram of drug-component-target

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

將交集基因?qū)隨TRING 蛋白互作分析數(shù)據(jù)庫中，物種選擇為人類，基因靶點(diǎn)之間相互作用關(guān)系以PPI 網(wǎng)絡(luò)圖呈現(xiàn)，將STRING 數(shù)據(jù)庫運(yùn)算出的PPI網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1 可視化，見圖3。其中，形狀越大、顏色越深代表相互關(guān)聯(lián)作用最強(qiáng)。通過Cytoscape 3.9.1 軟件cytoNCA 插件對(duì)PPI 網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行核心靶點(diǎn)篩選，通過degree 值排序，得出前10 位的核心靶點(diǎn)，見表2。

圖3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 Protein-protein interaction networks

表2 核心靶點(diǎn)信息分析Table 2 Analysis of core target information

2.5 GO 富集分析和KEGG 信號(hào)通路分析

通過DAVID 數(shù)據(jù)庫分析得出910 條GO 富集條目及174 條KEGG 信號(hào)通路，其中，GO 功能富集結(jié)果包括BP 704 個(gè)，CC 72 個(gè)，MF 134 個(gè)。選取GO 富集分析中每組前10 位繪制條形圖，見圖4。由圖可知，BP 主要與細(xì)胞凋亡過程、炎癥應(yīng)答、細(xì)胞凋亡過程的正負(fù)調(diào)控、對(duì)藥物的反應(yīng)等相關(guān)，CC 主要與膜筏、胞外區(qū)、線粒體、細(xì)胞質(zhì)等相關(guān)。MF 主要與酶結(jié)合、蛋白結(jié)合、細(xì)胞因子活性、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等相關(guān)。

圖4 GO 富集分析條形圖Fig.4 Bar chart of GO enrichment analysis

KEGG 信號(hào)通路分析收集排名前20 位的信號(hào)通路繪制氣泡圖，見圖5，顏色越深氣泡越大，說明富集程度越大。由圖可知，KEGG 信號(hào)通路主要與TNF 信號(hào)通路、Toll 樣受體信號(hào)通路、IL-17 信號(hào)通路、糖尿病并發(fā)癥的AGE-RAGE、C 型凝集素受體信號(hào)通路等通路密切相關(guān)。

圖5 KEGG 信號(hào)通路氣泡圖Fig.5 Bubble diagram of KEGG signaling pathway

2.6 分子對(duì)接

新建交集基因可視化網(wǎng)絡(luò)圖按照degree 排名前8位小分子配體分別是槲皮素、山柰酚、木犀草素、β-谷甾醇、豆甾醇、黃芩素、漢黃芩素、柚皮素。根據(jù)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖篩選degree 排名前10 的核心靶點(diǎn)是蛋白激酶B1（AKT1）、腫瘤壞死因子（TNF）、TP53、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、IL-1B、血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）、胱天蛋白酶3（CASP3）、絲裂原活化蛋白激酶3（MAPK3）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）。將小分子配體和核心靶點(diǎn)受體進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)合能顯示出有良好的結(jié)合性，繪制分子對(duì)接結(jié)合能柱狀見圖6。利用PyMol 將蛋白受體與分子配體進(jìn)行分子對(duì)接，見圖7。

圖6 分子對(duì)接結(jié)合能柱狀圖Fig.6 Bar chart of molecular docking binding energy

圖7 分子對(duì)接圖Fig.7 Molecular docking diagram

3 討論

春季風(fēng)正木時(shí)，氣候溫暖多風(fēng)，陽氣上升，清代葉天士在《溫?zé)嵴摗吩唬骸按涸率茱L(fēng)，其氣已暖”。甲型流感感染后以發(fā)熱、頭痛、肌痛和全身不適起病，體溫可達(dá)39～40 ℃[1]，具有極強(qiáng)的傳染性，能夠引起大范圍流傳的外感熱病，符合“時(shí)行感冒、溫病、瘟疫”范疇[15]。初期常辨證為邪犯肺胃證，具有疏風(fēng)解表、清熱導(dǎo)滯等功用。小兒豉翹清熱顆粒是由連翹、淡豆豉、薄荷、荊芥、炒梔子、大黃、青蒿、赤芍、檳榔、厚樸、黃芩、半夏、柴胡、甘草14 味中藥組成，源于兒科名家李少川教授50 余年行醫(yī)經(jīng)驗(yàn)，在銀翹散和達(dá)原飲基礎(chǔ)上化裁而成[16]，選取吳鞠通《溫病條辨》中的“辛涼平劑”銀翹散，主治溫病初起，邪在衛(wèi)分；達(dá)原飲源自《瘟疫論》，用于瘟疫初起，邪伏膜原。在溫病初起階段疏散風(fēng)熱、辟穢化濁，同時(shí)兼顧小兒肺脾不足的特點(diǎn)，達(dá)到疏風(fēng)解表、清熱導(dǎo)滯的作用。

本研究確定了小兒豉翹清熱顆粒的主要成分是槲皮素、山柰酚、木犀草素、β-谷甾醇、豆甾醇、黃芩素、漢黃芩素、柚皮素。并獲取了治療甲型流感的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)AKT1、TNF、TP53、IL-6、IL-1B、VEGFA、STAT3、CASP3。KEGG 通路主要與Toll樣受體信號(hào)通路作為主要通路之一。

3.1 抗炎作用

Toll 受體信號(hào)通路（TLRs）是小兒豉翹清熱顆粒作用在甲型流感病毒主要通路之一，TLRs 是先天性免疫的始動(dòng)環(huán)節(jié)，存在非特異免疫細(xì)胞及某些體細(xì)胞表面的識(shí)別受體，通過調(diào)控下游髓分化因子88（MyD88）轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑募集下游白介素1 受體關(guān)聯(lián)激酶1（IRAK1）和IRAK2，使IRAK磷酸化脫離MyD88并與腫瘤壞死因子受體相關(guān)蛋白6（TRAF6）結(jié)合，從而激活I(lǐng)κB 激酶（IKK 復(fù)合體）并導(dǎo)致NF-κB 信號(hào)通路激活，使TNF、IL-6 及IL1B 炎癥細(xì)胞因子表達(dá)，從而調(diào)節(jié)病毒感染引起的炎癥反應(yīng)。相關(guān)研究證實(shí)，小兒豉翹清熱顆粒的主要成分中山柰酚、β-谷甾醇及漢黃芩素抵抗甲型流感發(fā)揮抗病毒作用可能與TLRs 下游NF-κB 信號(hào)通路發(fā)生聯(lián)系[17-19]，且槲皮素和豆甾醇都直接或間接發(fā)揮抗炎作用[20-21]。

3.2 抗病毒作用

木犀草素和黃芩素可通過抑制病毒蛋白的合成從而達(dá)到抗病毒作用，Yan 等[22]發(fā)現(xiàn)木犀草素通過抑制病毒外殼蛋白Ⅰ復(fù)合物的表達(dá)，而黃芩素則是通過抑制甲型H5N1 流感病毒的NP 蛋白的產(chǎn)生[23]；TP53 和STAT3 是甲型流感病毒作用靶點(diǎn)，TP53 通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控hGBP1 的表達(dá)發(fā)揮抗病毒效應(yīng)[24]，流感病毒誘導(dǎo)的宿主細(xì)胞STAT3 分子早期活化被RIG-I/MAVS 信號(hào)通路調(diào)控而達(dá)到抗病毒作用[25]。

3.3 通便作用

小兒豉翹清熱顆粒藥物組成中檳榔、厚樸、大黃有下氣導(dǎo)滯功用，《黃帝內(nèi)經(jīng)》提到肺與大腸相表里，與小兒豉翹清熱顆粒具有疏風(fēng)解表、清熱導(dǎo)滯相契合，本項(xiàng)研究中槲皮素、山柰酚、木犀草素等具有通便效果，Liu 等[26]提出槲皮素可以通過增加Cajal 間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物（c-Kit 和SCF）以及水通道蛋白3 的水平來緩解便秘；吳浩等[27]提出槲皮素、山柰酚、木犀草素可能通過調(diào)節(jié)M 受體及其下游信號(hào)通路PKC 蛋白的表達(dá)發(fā)揮潤腸通便的作用。

3.4 細(xì)胞凋亡及氣道水腫

AKT1 及CASP3 抑制流感病毒細(xì)胞凋亡的作用靶點(diǎn)。AKT1 是絲氨酸/蘇氨酸激酶，它通過多種途徑磷酸化促進(jìn)細(xì)胞生長及抑制細(xì)胞凋亡作用[28]。相關(guān)研究表明通過抑制CASP3 的激活，使裂解的RARP、Caspase-8 和Bax 表達(dá)下調(diào)，從而抑制病毒感染誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[29]。在減輕氣道水腫方面：VEGFA 屬于血管內(nèi)皮生長因子（VEGF），相關(guān)研究提出炎癥介質(zhì)可以促進(jìn)VEGF 與其受體的表達(dá)，VEGF 的升高可導(dǎo)致支氣管血管的滲透性增加，引起肺間質(zhì)內(nèi)物質(zhì)改變，造成氣道水腫，增加氣道感染風(fēng)險(xiǎn)[30-31]。

綜上所述，本項(xiàng)研究從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接的角度出發(fā)，發(fā)現(xiàn)小兒豉翹清熱顆粒治療甲型流感通過多靶點(diǎn)、多通路、多效應(yīng)發(fā)揮著作用，主要與炎癥反應(yīng)、病毒感染、細(xì)胞凋亡等相關(guān)，并預(yù)測可能與Toll 樣受體信號(hào)通路相關(guān)，同時(shí)分子對(duì)接顯示出活性關(guān)鍵分子與核心靶點(diǎn)受體對(duì)接有良好的結(jié)合性。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突