周麗俐，張婷，王佳*

1.南昌大學(xué) 撫州醫(yī)學(xué)院，江西 撫州 344000

2.雷允上藥業(yè)集團(tuán)有限公司，江蘇 蘇州 215009

六神丸是百草霜為衣的水丸，由麝香、牛黃、珍珠、冰片、蟾酥和雄黃組成[1]，在臨床中應(yīng)用廣泛。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為其具有清涼解毒、消炎止痛的功效，可用于治療喉風(fēng)喉癰、癰瘍疔瘡、無名腫毒等癥[2]。近年來隨著對(duì)六神丸藥效成分的深入研究，證實(shí)了其主要成分具有廣譜的抗炎鎮(zhèn)痛作用。除此之外，隨著相關(guān)臨床療效評(píng)價(jià)的開展，六神丸在臨床中的適應(yīng)證不斷擴(kuò)大，廣泛涉及皮膚科、內(nèi)科、口腔科等各科。但是在治療各類型口腔潰瘍時(shí)，其研究結(jié)果及臨床數(shù)據(jù)基本是基于六神丸聯(lián)合其他藥物治療，如六神丸聯(lián)合黃連素[3]、大慶霉素[4]、利多卡因[5]等。因此推測六神丸可能對(duì)口腔潰瘍?cè)诟鞣N配伍用藥過程中起到重要作用。本研究制備小鼠口腔潰瘍模型，觀察六神丸對(duì)口腔潰瘍的治療作用，并探討其可能的機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

5 周齡C57BL/6JGpt 雄性小鼠，SPF 級(jí)，體質(zhì)量18～22 g，由江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（蘇）2018-0008。飼養(yǎng)環(huán)境溫度為（23±2）℃，濕度為（60±10）%，自由飲水進(jìn)食。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)得到南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（批號(hào)202207A053），遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理要求。

1.2 藥品及試劑

六神丸（雷允上藥業(yè)集團(tuán)有限公司，規(guī)格：10粒/支，批號(hào)SA18034A）；桂林西瓜霜（桂林三金藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格：2.5 g，批號(hào)210973）；白細(xì)胞介素（IL）-6、IL-8 ELISA 檢測試劑盒（江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司，批號(hào) MM-0047R1、MM-0190R1）；NaOH（廣東光華化學(xué)廠有限公司，批號(hào)20100113）；水合氯醛（中國藥品生物制品檢定研究院，批號(hào)100121-199903）；生理鹽水（Beyotime）；異氟烷（深圳瑞沃德，批號(hào)R510-22-10）；β-actin antibody（美國proteintech 公司）；ERK 抗體、抗p-ERK 抗體（Cell Signaling Technology，批號(hào)#4695、#4370）；羊抗兔多克隆抗體（北京博爾西科技有限公司，批號(hào)BHR101）。

1.3 儀器

多功能酶標(biāo)儀（BioTEK Instruments，Inc.）；高速冷凍離心機(jī)（塞洛捷克D3024R）；勻漿機(jī)（拓赫茨THR 勻漿機(jī)）；離心機(jī)（AndyBio）；垂直電泳槽（美國Rio-Rad 公司）；電泳儀（Biometra）；紫外切膠儀（上海勤翔儀器）；水平脫色搖床（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；凝膠自動(dòng)成像系統(tǒng)（美國Rio-Rad 公司）。

2 方法

2.1 藥液制備

取六神丸120 粒，滴加生理鹽水碾碎并研成細(xì)粉，再烘干得到六神丸粉末0.375 g。稱取桂林西瓜霜粉末0.375 g，備用。挑選大小約3 mm×3 mm 的氫氧化鈉片狀晶體于試管中備用，保持干燥。

2.2 分組與給藥

將32 只C57BL/6JGpt 小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、六神丸組、桂林西瓜霜組，每組各8 只。采用化學(xué)灼燒法[6]。于造模前12 h 禁食，正常飲水。除對(duì)照組外，小鼠經(jīng)4%水合氯醛（0.20 mL/只）麻醉，將3 mm×3 mm 氫氧化鈉片狀晶體放在小鼠口腔左側(cè)頰部黏膜處灼燒20 s，之后迅速移開并用生理鹽水沖洗20 s，2 d 內(nèi)可見3 mm 左右直徑大小的紅白色損傷，傷口轉(zhuǎn)化為中央凹陷并覆以白色偽膜，并伴有口角邊潮濕，臉頰腫脹，甚至口腔內(nèi)出現(xiàn)膿液，即可判定為造模成功。

六神丸組給予局部外敷六神丸，給藥處理前先用異氟烷將小鼠麻醉，將消毒棉簽用生理鹽水潤濕，再用已經(jīng)制備好的六神丸粉末0.375 g，蘸取涂抹于患處，以完全覆蓋創(chuàng)面為標(biāo)準(zhǔn)，2 次/d，連續(xù)治療5 d。桂林西瓜霜組用同樣的方式給予局部外敷桂林西瓜霜粉末0.375 g，2 次/d，涂抹于小鼠口腔潰瘍處，連續(xù)治療5 d。模型組不給予藥物。六神丸與桂林西瓜霜組給藥前使用生理鹽水沖洗口腔，所有小鼠在給藥后禁食禁水0.5 h。實(shí)驗(yàn)過程中所有小鼠均給予正常飲食，自由飲水，所有小鼠均存活并造模成功。

2.3 指標(biāo)檢測

2.3.1 一般狀態(tài) 每天上午10∶00 時(shí)記錄各小鼠體質(zhì)量并觀察各小鼠外觀形態(tài)變化、對(duì)外界反應(yīng)、采食行為等。

2.3.2 潰瘍病理變化 給藥期間觀察潰瘍病理變化和恢復(fù)情況。潰瘍表面感染情況分級(jí)及評(píng)分規(guī)則為0 級(jí)：肉眼觀察潰瘍恢復(fù)至正常狀態(tài)，記0 分；Ⅰ級(jí)：表面無明顯假膜，記1 分；Ⅱ級(jí)：潰瘍表面有薄層黃白色假膜，周圍無水腫，記2 分；Ⅲ級(jí)：潰瘍表面假膜較厚，且周圍伴有炎性水腫，記3 分。顯效：潰瘍表面感染情況評(píng)分0、Ⅰ級(jí)。有效：潰瘍表面感染情況評(píng)分Ⅱ級(jí)。無效：潰瘍表面感染情況評(píng)分Ⅲ級(jí)[7]。

總愈合率＝（顯效例數(shù)＋有效例數(shù)）/總例數(shù)

2.3.3 生理生化指標(biāo) 在治療第5 天后，采用摘眼球取血的方式采集靜脈血0.5 mL，室溫自然凝固20 min，3 000 r/min、4 ℃離心20 min，分離上層血清于離心管中，采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法測定小鼠血清IL-6、IL-8 水平，具體步驟按照ELISA試劑盒說明書來操作。

2.3.4 ERK1/2 磷酸化水平 取小鼠的口腔上皮組織，提取總蛋白，通過二喹啉酸（BCA）方法定量蛋白濃度并配制成2 μg/μL 蛋白濃度，金屬浴煮5 min 使蛋白變性。用β-actin 作為內(nèi)標(biāo)，取樣品5 μg進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析?？辜?xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）抗體和抗 p-ERK 抗體（Cell Signaling Technology，批號(hào)#4695、#4370），1∶1 000 稀釋，二抗用羊抗兔多克隆抗體（北京博爾西科技有限公司，批號(hào)BHR101），1∶10 000 稀釋。

2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行處理分析。兩組連續(xù)性計(jì)量數(shù)據(jù)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較，計(jì)量資料以表示，檢驗(yàn)方法采用單因素方差分析（One way-AVONA）。

3 結(jié)果

3.1 一般情況及體質(zhì)量變化

造模第1 天對(duì)照組小鼠活動(dòng)敏捷，步態(tài)、行為及對(duì)外界反應(yīng)情況正常，無死亡。模型組、六神丸組和西瓜霜組小鼠皮毛光澤變得黯淡，體質(zhì)量開始減少，活力降低（P＜0.05）。給藥第5 天，對(duì)照組小鼠體質(zhì)量保持穩(wěn)定，一般狀態(tài)與實(shí)驗(yàn)開始前無明顯變化，且無小鼠死亡。六神丸組和桂林西瓜霜組小鼠活力較造模2 d 已經(jīng)有所恢復(fù)，體質(zhì)量逐漸增長，但仍未恢復(fù)到初始體質(zhì)量（P＜0.05）。提示六神丸對(duì)氫氧化鈉誘導(dǎo)的口腔潰瘍具有一定的促進(jìn)恢復(fù)作用，見圖1。

圖1 六神丸對(duì)口腔潰瘍小鼠體質(zhì)量的影響Fig.1 Influence of Liushen Pills on body mass of mice with oral ulcer

3.2 小鼠口腔潰瘍部位組織病理變化的觀察

觀察各組小鼠口腔潰瘍面的基本狀態(tài)，結(jié)果顯示對(duì)照組無潰瘍癥狀出現(xiàn)。其余組別在使用氫氧化鈉灼燒過后可出現(xiàn)明顯的口腔潰瘍，肉眼觀察潰瘍面的黏膜出現(xiàn)大小3 mm×3 mm、覆蓋黃白色偽膜，左側(cè)臉頰充血水腫，說明口腔潰瘍模型制備成功。連續(xù)給藥5 d，對(duì)小鼠口腔潰瘍表面進(jìn)行連續(xù)觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組口腔黏膜始終保持完整、光滑，無明顯損傷。其他各組潰瘍隨時(shí)間的推移均有不同程度的恢復(fù)趨勢。有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道指出[3]小鼠口腔潰瘍模型具有一定自愈性，隨著時(shí)間的延長，潰瘍面積逐漸減小，創(chuàng)面組織表面逐步恢復(fù)。在給藥第2、5 天觀察，與模型組比較，六神丸組和桂林西瓜霜組小鼠口腔潰瘍組織顯著恢復(fù)。給藥5 d，模型組潰瘍表面仍存在假膜、膿液，六神丸組小鼠潰瘍面假膜基本消失、恢復(fù)情況良好，桂林西瓜霜組小鼠基本愈合。結(jié)果表明，六神丸可以改善氫氧化鈉誘導(dǎo)的口腔潰瘍病理狀態(tài)并在一定程度上促進(jìn)恢復(fù)，見圖2。

圖2 六神丸對(duì)小鼠口腔潰瘍部位組織病理變化的影響Fig.2 Effect of Liushen Pills on pathological changes of oral ulcer in mice

3.3 六神丸對(duì)小鼠口腔潰瘍等級(jí)評(píng)分的影響

根據(jù)潰瘍表面感染情況分級(jí)、評(píng)分規(guī)則，造模前模型組、六神丸組、桂林西瓜霜組小鼠口腔潰瘍感染評(píng)分無顯著性差異；在給藥第1、3、5 天，與模型組比較，六神丸組和桂林西瓜霜組小鼠口腔潰瘍等級(jí)評(píng)分均顯著減小（P＜0.05）。此外，六神丸組和桂林西瓜霜組小鼠的治愈率明顯高于模型組（P＜0.05），見表1。結(jié)果提示六神丸可以顯著加快氫氧化鈉誘導(dǎo)的口腔潰瘍的愈合作用。

表1 六神丸治療小鼠口腔潰瘍的等級(jí)評(píng)分和治愈率（，n=8）Table 1 Grade scores and cure rate of oral ulcers treated by Liushen Pills in mice (,n=8)

表1 六神丸治療小鼠口腔潰瘍的等級(jí)評(píng)分和治愈率（，n=8）Table 1 Grade scores and cure rate of oral ulcers treated by Liushen Pills in mice (,n=8)

與對(duì)照組比較：*P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05*P <0.05 vs control group;#P <0.05 vs model group

3.4 六神丸對(duì)口腔潰瘍小鼠血液中IL-6、IL-8 水平的影響

與對(duì)照組比較，模型組小鼠血清中IL-6、IL-8水平顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，六神丸組和桂林西瓜霜組小鼠血清中IL-6 水平顯著降低，六神丸組小鼠血清中的IL-8 水平顯著下降（P＜0.05），而桂林西瓜霜組小鼠的IL-8 水平無顯著性差異，見圖3。結(jié)果提示，六神丸可以降低口腔潰瘍小鼠血清中IL-6、IL-8 炎癥因子的水平，可能是其治療氫氧化鈉誘導(dǎo)的口腔潰瘍的作用機(jī)制之一。

圖3 六神丸對(duì)口腔潰瘍小鼠血清中IL-6、IL-8 水平的影響（，n=8）Fig.3 Effect of Liushen Pills on serum IL-6 and IL-8 levels in oral ulcer mice (,n=8)

3.5 六神丸對(duì)口腔潰瘍小鼠口腔黏膜ERK1/2 磷酸化水平的影響

與對(duì)照組比較，模型組小鼠口腔黏膜組織中ERK1/2 磷酸化水平明顯升高，但總ERK1/2 沒明顯變化，桂林西瓜霜組和六神丸組小鼠口腔黏膜組織中ERK1/2 磷酸化水平明顯降低，六神丸組降低幅度較桂林西瓜霜組明顯，而桂林西瓜霜并未引起模型小鼠口腔黏膜組織中總的ERK1/2 水平，見圖4。

圖4 六神丸對(duì)口腔潰瘍小鼠血清中ERK1/2 磷酸化水平的影響Fig.4 Effect of Liushen Pills on ERK1/2 phosphorylation in serum of oral ulcer mice

4 討論

口腔潰瘍是臨床上常見的口腔疾病，近年來該病的患病率呈顯著的上升趨勢。其發(fā)病機(jī)制至今尚未完全清楚，口腔潰瘍的發(fā)病誘因比較多，包括但不限于遺傳因素、維生素缺乏、精神壓力與內(nèi)分泌紊亂、系統(tǒng)性疾病、創(chuàng)傷等[8]。臨床中以促進(jìn)潰瘍創(chuàng)面愈合，縮短康復(fù)周期，防止復(fù)發(fā)等作為主要治療原則?，F(xiàn)有針對(duì)口腔潰瘍治療的專一、特效方法仍然有待探索。傳統(tǒng)的方法如給予維生素C，可一定程度促進(jìn)瘡面愈合；噴涂西瓜霜粉末有清熱解毒，消腫止痛的功效，但治療效果受限，不利于快速康復(fù)[9]。除此之外還有抗菌類的藥物，但是在實(shí)際臨床應(yīng)用中都存在一定的缺陷，如會(huì)產(chǎn)生耐藥性、對(duì)真菌感染無效且伴有顯著的不良反應(yīng)、停藥后容易復(fù)發(fā)等諸多問題。針對(duì)上述的各種情況，在中醫(yī)學(xué)理論中有著完整的論述和治療方向?？谇粷?cè)谥嗅t(yī)學(xué)中又稱“口瘡”，其發(fā)生原因的闡述與現(xiàn)代的醫(yī)學(xué)研究較為相近。但是在治療方法上以清熱解毒、祛腐生肌、消腫止痛為主要原則。

六神丸來源于《雷允上誦芬堂方》，是我國著名的傳統(tǒng)國藥精粹。六神丸具有清熱解毒、消腫止痛、斂瘡生肌之功效，以及無論內(nèi)服、外敷，對(duì)紅腫癰癤、口咽糜爛等癥均有奇效[10]，這都符合前文所述對(duì)于口腔潰瘍的治療原則。這提示了可以進(jìn)一步探索六神丸對(duì)于口腔潰瘍的療效。有臨床報(bào)道[11-12]，六神丸與多種藥物聯(lián)合使用對(duì)各類型的口腔潰瘍患者具有較好的治療效果，對(duì)口腔黏膜損傷有一定的保護(hù)作用。研究表明六神丸具有很好的抑制炎癥和鎮(zhèn)痛效果，對(duì)非感染性和感染性炎癥均具有良好的抑制作用[13]，且對(duì)于口腔內(nèi)黏膜的治療，采用含服給藥方式的效果比傳統(tǒng)給藥方式更突出，藥物有效濃度持續(xù)時(shí)間更長，對(duì)人體的不良反應(yīng)也更小。

本研究結(jié)果顯示，與模型組相比，六神丸組與桂林西瓜霜組小鼠的體質(zhì)量顯著增高，表明六神丸通過對(duì)小鼠口腔潰瘍感染處的鎮(zhèn)痛作用，減輕潰瘍所帶來的疼痛感對(duì)小鼠進(jìn)食、情緒等方面的影響，進(jìn)而可降低口腔潰瘍對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響，也提示六神丸可以緩解進(jìn)食、正常生理活動(dòng)下因潰瘍面的造成的疼痛、改善小鼠精神狀態(tài)、促進(jìn)體質(zhì)量的恢復(fù)。多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究均采用潰瘍面積大小或者愈合時(shí)間作為衡量指標(biāo)[10,14-16]。本研究采用潰瘍表面感染分級(jí)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，以此對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步的量化處理，使結(jié)果更具直觀性和對(duì)比性。結(jié)果顯示，治療第5 天，六神丸組和桂林西瓜霜組小鼠的口腔潰瘍等級(jí)評(píng)分顯著低于模型組。

急性的創(chuàng)傷可以導(dǎo)致口腔黏膜上皮水腫和早期炎癥細(xì)胞浸潤[9]，故小鼠血清中的炎性因子如IL-6、IL-8 在口腔潰瘍的發(fā)生中扮演著重要的角色。其中IL-6 能夠促進(jìn)機(jī)體釋放多種炎癥因子，從而造成炎性損傷[17]；IL-8 能夠促進(jìn)機(jī)體巨噬細(xì)胞釋放多種趨化因子，導(dǎo)致機(jī)體的局部炎癥反應(yīng)，從而引起黏膜損傷[18]。結(jié)果顯示，與模型組相比，六神丸組與桂林西瓜霜組小鼠血清IL-6、IL-8 水平顯著降低。實(shí)驗(yàn)造模成功小鼠會(huì)出現(xiàn)高炎癥狀態(tài)，六神丸可以通過抗炎作用對(duì)小鼠口腔潰瘍起到顯著的保護(hù)作用。ERK1/2 是MAPK 蛋白家族成員之一，是調(diào)節(jié)正常細(xì)胞增殖、存活和分化的關(guān)鍵信號(hào)通路。本研究顯示，六神丸組小鼠口腔黏膜組織中ERK1/2 磷酸化水平明顯降低，表明六神丸可以通過降低ERK1/2 磷酸化水平調(diào)控正常細(xì)胞增殖，保護(hù)黏膜細(xì)胞、緩解潰瘍損傷，促進(jìn)小鼠恢復(fù)。

綜上所述，六神丸能緩解口腔潰瘍小鼠口腔組織損傷，抑制炎性因子的釋放，促進(jìn)小鼠恢復(fù)，其對(duì)小鼠的療效觀察較為滿意，提供了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)，具有良好的應(yīng)用前景。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突