李艷峰，盧振民

新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 耳鼻咽喉科，河南 新鄉(xiāng) 453100

分泌性中耳炎為耳鼻喉科常見的疾病之一，是一種中耳非化膿性疾病，以中耳積液、聽力損傷及鼓膜渾濁內(nèi)陷為特征，常發(fā)病于兒童，且其發(fā)病率呈逐年增高態(tài)勢，已經(jīng)成為危害人類身體健康的突出問題[1]。目前，有關(guān)于分泌性中耳炎的發(fā)病機制尚未完全闡明，其病因機制仍然存在一定的爭議。多項研究證實，炎癥效應(yīng)被認(rèn)為是導(dǎo)致中耳黏膜損傷及聽力受損的主要病因，通過改善機體免疫功能并予以抗炎處理是緩解分泌性中耳炎癥狀的重要方式[2-3]。細(xì)胞焦亡作為一種新型促炎性細(xì)胞死亡方式，能夠通過誘發(fā)慢性炎癥反應(yīng)，加速疾病進(jìn)展。研究證實，細(xì)胞焦亡是一種依賴于Caspase-1 介導(dǎo)的細(xì)胞死亡形式，主要是以pro-Caspase-1 活化形成Caspase-1 p20，誘導(dǎo)焦亡執(zhí)行蛋白消皮素 D（GSDMD）發(fā)生剪切形成具有細(xì)胞毒性的GSDMDN，并募集至細(xì)胞膜上形成焦亡小孔，促進(jìn)白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-18 釋放，進(jìn)而誘發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng)[4]。多項研究均已證實，在多種炎癥相關(guān)性疾病中均存在細(xì)胞焦亡的發(fā)生，而通過藥物/基因干預(yù)細(xì)胞焦亡能夠抑制機體過度炎癥反應(yīng)，進(jìn)而改善疾病癥狀[5-6]。結(jié)合分泌性中耳炎以炎癥反應(yīng)為核心的疾病主要病理機制，提示細(xì)胞焦亡很有可能是分泌性中耳炎中耳黏膜損傷的新機制。腺苷酸活化蛋白激酶/NOD 樣受體蛋白3（AMPK/NLRP3）是細(xì)胞焦亡發(fā)生的重要調(diào)控通路，抑制或降低AMPK 活性能夠明顯激活NLRP3 炎癥小體，從而啟動細(xì)胞焦亡[7]。此外，AMPK 和NLRP3 炎癥小體已被證實在分泌性中耳炎體外和體內(nèi)實驗中發(fā)揮關(guān)鍵性調(diào)控作用[8-9]。以上研究共同提示，以AMPK/NLRP3通路介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡為研究切入點可能是揭示分泌性中耳炎新的病理機制及以此探尋新型治療藥物的關(guān)鍵。

牡荊素是一種天然的生物活性黃酮類化合物，多存在山楂葉及其果實、山里紅葉、金蓮花等中藥材中。研究證實，牡荊素具有抗氧化[10]、抗炎[11]、抗腫瘤[12]等多種生物學(xué)功能，且對疾病的防治效果顯著，相比于臨床藥物具有不良反應(yīng)小、安全性高等優(yōu)勢，是一種極具開發(fā)潛力的天然活性物質(zhì)。研究表明，牡荊素能夠通過抑制炎癥反應(yīng)，改善關(guān)節(jié)炎大鼠癥狀[11]。此外，牡荊素亦能夠通過抑制炎癥反應(yīng)，改善哮喘幼鼠肺部損傷[13]。但是，關(guān)于牡荊素對分泌性中耳炎炎癥反應(yīng)的影響及作用機制尚不清楚。為此，本研究擬通過內(nèi)毒素法構(gòu)建分泌性中耳炎大鼠模型，從AMPK/NLRP3 通路介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡途徑，闡明牡荊素對分泌性中耳炎大鼠的保護(hù)作用，旨在為分泌性中耳炎臨床候選治療藥物提供新的選擇。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 雄性，SPF 級，周齡6～8 周，SD 大鼠50 只，體質(zhì)量為（200±10）g，購買于上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司[生產(chǎn)許可證號SCXK（滬）2021-0026]，動物適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，期間正常飲食、飲水。飼養(yǎng)條件：（25±2）℃，環(huán)境相對濕度55%～65%，晝夜各12 h 交替光照。本實驗中涉及的動物研究經(jīng)過新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批（批準(zhǔn)號LLSC2021-06-010）。

1.1.2 主要試劑 牡荊素（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%，批號20220312，成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司）；內(nèi)毒素（美國Sigma-Aldrich 公司，批號L6529）；AMPK抑制劑6-[4-(2-哌啶-1-基乙氧基)苯基]-3-吡啶-4-基吡唑并[1,5-A]嘧啶（Compound C）（美國Selleck 公司，批號S7306）；免疫組化檢測試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號SP-9001）；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、IL-6、IL-1β、IL-18 酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號SEKR-0009、SEKR-0005、SEKR-0002、SEKR-0019）；蘇木素-伊紅（HE）檢測試劑盒、BCA 蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒、ECL 發(fā)光液、β-actin 一抗、HRP 標(biāo)記的山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG（碧云天生物技術(shù)公司，批號C0105S、P0009、P0018FS、AF0003、A0412、A0408）；p-AMPK 一抗、AMPK一抗、Caspase-1p20 一抗、GSDMD-N 一抗、IL-1β一抗、IL-18 一抗（美國Cell Signaling Technology，批號2537、2532、89332、37349、63124、57058）。

1.1.3 主要儀器 LD-96A 型酶標(biāo)儀（山東萊恩德智能科技有限公司）；BX53 型光學(xué)顯微鏡（日本Olympus 公司）；BX43 型熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；580-NAVPR2 型ABR 電位儀（上海沫錦醫(yī)療器械有限公司）；Gel dox XR+型凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司）。

1.2 方法

1.2.1 分泌性中耳炎大鼠模型的構(gòu)建以及分組給藥 將50 只SD 大鼠隨機性分為對照組、模型組、牡荊素（3、12 mg/kg）組、牡荊素高劑量＋Compound C 組，每組各10 只。顯微鏡下觀察大鼠外耳道及中耳感染情況排除中耳感染性大鼠。除對照組外，其余各組大鼠均采取內(nèi)毒素法復(fù)制分泌性中耳炎大鼠模型[14]：0.4%的戊巴比妥鈉麻醉大鼠，大鼠仰臥位固定，在手術(shù)顯微鏡下經(jīng)鼓膜穿刺，采用微量注射器注射內(nèi)毒素（200 ng/mL）。造模后光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠鼓膜渾濁、內(nèi)陷以及分泌液等狀況，若大鼠鼓膜出現(xiàn)明顯渾濁，內(nèi)陷且伴有氣泡形成，鼓室積液，視為模型構(gòu)建成功。建模后鼓膜充血，光錐消失，無穿孔。本實驗中分泌性中耳炎大鼠造模成功率為100%。造模成功后1 d，牡荊素3、12 mg/kg組分別 ip 相應(yīng)劑量的牡荊素[15]；牡荊素＋Compound C 組ip 12 mg/kg 的牡荊素后，立即ip 20 mg/kg Compound C[16]；對照組和模型組大鼠分別ip等量的生理鹽水。以上各組均為1 次/d，連續(xù)給藥21 d。

1.2.2 中耳黏膜組織病理學(xué)觀察 給藥結(jié)束后各組大鼠均頸椎脫臼處死，解剖內(nèi)耳，4%多聚甲醛固定，脫鈣，脫水，石蠟包埋切片，行HE 染色，顯微鏡下觀察中耳黏膜組織病理形態(tài)變化。

1.2.3 中耳黏膜厚度測定 將大鼠頸椎脫臼處死后，解剖頭部并分離聽泡，濾紙吸除聽泡水分，于顯微鏡下剝離中耳黏膜組織，最后利用測微計測定各組大鼠黏膜組織厚度，每組測量5 個不同位置，取其平均值為最終黏膜厚度。

1.2.4 大鼠聽力功能檢測 各組大鼠給藥結(jié)束后24 h，采取聽覺腦干誘發(fā)電位（ABR）儀檢測ABR反應(yīng)閾值，以此反映聽力功能變化。各組大鼠麻醉后，置于隔聲屏蔽室內(nèi)，依據(jù)文獻(xiàn)報道[3]嚴(yán)格按照ABR 儀器操作方法進(jìn)行ABR 反應(yīng)閾值測定。

1.2.5 ELISA 檢測TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-18 水平 給藥結(jié)束后，大鼠腹主動脈取血，4 ℃，3 000 r/min 離心10 min，吸取上清液，按照ELISA 檢測說明書測定各組大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-18 水平。

1.2.6 免疫組化檢測中耳黏膜組織p-AMK、NLRP3蛋白陽性表達(dá) 將脫蠟、透明、脫水后的黏膜組織切片抗原修復(fù)，經(jīng)3% H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，山羊血清封閉非特異性位點后，4 ℃孵育p-AMPK一抗（1∶200）、NLRP3 一抗（1∶500）過夜，室溫條件下孵育對應(yīng)二抗30 min，最后滴加DAB 顯色液，經(jīng)蘇木精復(fù)染、脫水、封片處理，顯微鏡下觀察黏膜組織p-AMPK、NLRP3 蛋白表達(dá)，并經(jīng)Image J 軟件對染色結(jié)果進(jìn)行半定量分析。

1.2.7 Western blotting 檢測AMPK/NLRP3 通路及焦亡相關(guān)蛋白表達(dá) 收集各組大鼠中耳黏膜組織，剪碎后混合加入蛋白酶抑制劑的RIPA細(xì)胞裂解液，于4 ℃條件下，裂解30 min。將離心管放置于離心機內(nèi)并設(shè)置：4 ℃、12 000 r/min 離心10 min，吸取上清液。BCA 法測定蛋白質(zhì)濃度，蛋白質(zhì)變性，蛋白上樣，電泳、轉(zhuǎn)膜。室溫條件下PVDF 采用6%BSA 封閉1 h，TBST 洗膜后，4 ℃條件下，分別孵育p-AMPK 一抗（1∶500）、AMPK 一抗（1∶1 000）、NLRP3 一抗（1∶1 000）、Caspase-1 p20 一抗（1∶500）、GSDMD-N 一抗（1∶500）、IL-1β 一抗（1∶1 000）、IL-18 一抗（1∶1 000）、β-actin 一抗（1∶5 000）16 h。次日取出PVDF 膜，TBST 洗滌后加入相應(yīng)HRP 標(biāo)記的山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG 孵育2 h。TBST 洗滌3 次，每次5 min。最后于PVDF膜上滴加顯影液顯影、拍照，實驗結(jié)果采用Image J 軟件進(jìn)行p-AMPK、AMPK、NLRP3、Caspase-1 p20、GSDMD-N、IL-1β、IL-18 蛋白表達(dá)定量分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 牡荊素對大鼠中耳黏膜病理形態(tài)改變和黏膜厚度的影響

對照組大鼠中耳內(nèi)黏膜上皮細(xì)胞排列整齊，血管及纖維細(xì)胞含量豐富，未有明顯的炎性細(xì)胞浸潤等現(xiàn)象。模型組大鼠中耳黏膜細(xì)胞腫脹，黏膜組織明顯增厚（P＜0.05），有多處黏膜細(xì)胞脫落，壞死，可見大量炎性細(xì)胞浸潤。與模型組相比，牡荊素3、12 mg/kg 組大鼠，黏膜上皮細(xì)胞排列較為規(guī)整，腫脹程度減輕，僅有少量的黏膜細(xì)胞脫落，炎性細(xì)胞浸潤程度減輕，中耳黏膜厚度降低（P＜0.05），且伴隨牡荊素劑量的增加，中耳黏膜病理損傷及黏膜厚度均減輕。與牡荊素12 mg/kg 組相比，牡荊素＋Compound C 組大鼠中耳黏膜組織病理損傷程度加重，且黏膜厚度增加（P＜0.05），見圖1、表1。

表1 各組大鼠中耳黏膜厚度比較（，n=10）Table 1 Comparison of thickness of middle ear mucosa in each group (,n=10)

表1 各組大鼠中耳黏膜厚度比較（，n=10）Table 1 Comparison of thickness of middle ear mucosa in each group (,n=10)

與對照組比較：*P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05；與牡荊素3 mg·kg-1 組比較：&P＜0.05；與牡荊素12 mg·kg-1 組比較：@P＜0.05*P <0.05 vs control group;#P <0.05 vs model group;&P <0.05 vs vitexin 3 mg·kg-1 group;&P <0.05 vs vitexin 12 mg·kg-1 group

圖1 各組大鼠中耳病理學(xué)變化（HE，×200）Fig.1 Pathological changes in the middle ear of rats in each group (HE,×200）

2.2 牡荊素對大鼠聽覺功能的影響

與對照組相比，模型組大鼠ABR 反應(yīng)閾值明顯增加（P＜0.05）。與模型組相比，牡荊素3、12 mg/kg 組大鼠ABR 反應(yīng)閾值明顯降低（P＜0.05），且呈劑量相關(guān)性。與牡荊素12 mg/kg組相比，AMPK抑制劑Compound C 能夠增加大鼠ABR 反應(yīng)閾值（P＜0.05），見表2。

表2 各組大鼠ABR 反應(yīng)閾值比較（，n=10）Table 2 Comparison of ABR response thresholds in each group of rats (,n=10)

表2 各組大鼠ABR 反應(yīng)閾值比較（，n=10）Table 2 Comparison of ABR response thresholds in each group of rats (,n=10)

與對照組比較：*P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05；與牡荊素3 mg·kg-1 組比較：&P＜0.05；與牡荊素12 mg·kg-1 組比較：@P＜0.05*P <0.05 vs control group;#P <0.05 vs model group;&P <0.05 vs vitexin 3 mg·kg-1 group;&P <0.05 vs vitexin 12 mg·kg-1 group

2.3 牡荊素對大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β 水平影響

與對照組相比，模型組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-18 水平明顯增加（P＜0.05）。與模型組相比，牡荊素3、12 mg/kg 組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-18 水平均明顯降低（P＜0.05），且呈劑量相關(guān)性。與牡荊素12 mg/kg 組相比，牡荊素＋Compound C 組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-18 水平明顯增加（P＜0.05），見表3。

表3 各組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-18 水平比較（，n=10）Table 3 Comparison of serum TNF-α,IL-6,IL-1β,IL-18 levels in each group of rats (,n=10)

表3 各組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-18 水平比較（，n=10）Table 3 Comparison of serum TNF-α,IL-6,IL-1β,IL-18 levels in each group of rats (,n=10)

與對照組比較：*P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05；與牡荊素3 mg·kg-1組比較：&P＜0.05；與牡荊素12 mg·kg-1 組比較：@P＜0.05*P <0.05 vs control group;#P <0.05 vs model group;&P <0.05 vs vitexin 3 mg·kg-1 group;&P <0.05 vs vitexin 12 mg·kg-1 group

2.4 牡荊素對大鼠中耳黏膜細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與對照組相比，模型組大鼠中耳黏膜組織Caspase-1p20、GSDMD-N、IL-1β、IL-18 蛋白相對表達(dá)量明顯升高（P＜0.05）。與模型組相比，牡荊素3、12 mg/kg 組大鼠中耳黏膜組織Caspase-1p20、GSDMD-N、IL-1β、IL-18 蛋白相對表達(dá)量均明顯降低（P＜0.05），且呈劑量相關(guān)性。與牡荊素12 mg/kg組相比，AMPK 抑制劑Compound C 能夠明顯逆轉(zhuǎn)上述蛋白表達(dá)（P＜0.05），見圖2、表4。

表4 各組大鼠中耳黏膜組織Caspase-1p20、GSDMD-N、IL-1β、IL-18 蛋白相對表達(dá)量（，n=6）Table 4 Relative expression of caspase-1p20,GSDMD-N,IL-1β,and IL-18 proteins in the middle ear mucosa of rats in each group (,n=6)

表4 各組大鼠中耳黏膜組織Caspase-1p20、GSDMD-N、IL-1β、IL-18 蛋白相對表達(dá)量（，n=6）Table 4 Relative expression of caspase-1p20,GSDMD-N,IL-1β,and IL-18 proteins in the middle ear mucosa of rats in each group (,n=6)

與對照組比較：*P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05；與牡荊素3 mg·kg-1組比較：&P＜0.05；與牡荊素12 mg·kg-1 組比較：@P＜0.05*P <0.05 vs control group;#P <0.05 vs model group;&P <0.05 vs vitexin 3 mg·kg-1 group;&P <0.05 vs vitexin 12 mg·kg-1 group

圖2 各組大鼠中耳黏膜組織Caspase-1p20、GSDMD-N、IL-1β、IL-18 蛋白凝膠電泳圖Fig.2 Gel electrophoresis of caspase-1p20,GSDMD-N,IL-1β and IL-18 proteins in middle ear mucosa of rats in each group

2.5 牡荊素對大鼠黏膜組織中AMPK/NLRP3 通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

免疫組化染色結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組大鼠中耳黏膜組織p-AMPK 陽性表達(dá)明顯減少，NLRP3 陽性表達(dá)明顯增加（P＜0.05）。與模型組相比，牡荊素3、12 mg/kg 組大鼠中耳黏膜組織p-AMPK 陽性表達(dá)顯著增加，NLRP3 陽性表達(dá)明顯減少，且呈劑量相關(guān)（P＜0.05）。與牡荊素12 mg/kg組相比，AMPK 抑制劑Compound C 能夠明顯逆轉(zhuǎn)p-AMPK、NLRP3 陽性表達(dá)（P＜0.05），見圖3、表5。Western blotting 檢測顯示，模型組大鼠中耳黏膜組織p-AMPK 蛋白表達(dá)降低，NLRP3 蛋白表達(dá)增加（P＜0.05）。與模型組相比，牡荊素3、12 mg/kg組大鼠中耳黏膜組織p-AMPK 蛋白表達(dá)升高，NLRP3 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），且呈劑量相關(guān)性。與牡荊素 12 mg/kg 組相比，AMPK 抑制劑Compound C 能夠明顯逆轉(zhuǎn)p-AMPK、NLRP3 蛋白表達(dá)（P＜0.05），見圖4、表6。

表5 各組大鼠中耳黏膜組織p-AMPK、NLRP3 蛋白陽性表達(dá)比較結(jié)果（，n=6）Table 5 Comparison of p-AMPK and NLRP3 protein positive expression in middle ear mucosa tissues of rats in each group (,n=6)

表5 各組大鼠中耳黏膜組織p-AMPK、NLRP3 蛋白陽性表達(dá)比較結(jié)果（，n=6）Table 5 Comparison of p-AMPK and NLRP3 protein positive expression in middle ear mucosa tissues of rats in each group (,n=6)

與對照組比較：*P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05；與牡荊素3 mg·kg-1 組比較：&P＜0.05；與牡荊素12 mg·kg-1 組比較：@P＜0.05*P <0.05 vs control group;#P <0.05 vs model group;&P <0.05 vs vitexin 3 mg·kg-1 group;&P <0.05 vs vitexin 12 mg·kg-1 group

表6 各組大鼠中耳黏膜組織p-AMPK/AMPK、NLRP3 蛋白相對表達(dá)量（，n=6）Table 6 Relative expression of p-AMPK/AMPK and NLRP3 proteins in the middle ear mucosa of rats in each group (,n=6)

表6 各組大鼠中耳黏膜組織p-AMPK/AMPK、NLRP3 蛋白相對表達(dá)量（，n=6）Table 6 Relative expression of p-AMPK/AMPK and NLRP3 proteins in the middle ear mucosa of rats in each group (,n=6)

與對照組比較：*P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05；與牡荊素3 mg·kg-1 組比較：&P＜0.05；與牡荊素12 mg·kg-1 組比較：@P＜0.05*P <0.05 vs control group;#P <0.05 vs model group;&P <0.05 vs vitexin 3 mg·kg-1 group;&P <0.05 vs vitexin 12 mg·kg-1 group

圖3 免疫組化檢測p-AMPK、NLRP3 陽性表達(dá)（IHC，×200）Fig.3 Immunohistochemical detection of positive expression of p-AMPK and NLRP3 (IHC,× 200)

圖4 各組大鼠中耳黏膜組織p-AMPK、AMPK、NLRP3蛋白凝膠電泳圖Fig.4 Gel electrophoresis of p-AMPK,AMPK and NLRP3 protein in middle ear mucosa of rats in each group

3 討論

中耳炎可分為化膿性和非化膿性中耳炎，是由多種原因誘發(fā)的中耳全部或部分中耳炎性病變。非化膿性中耳炎是導(dǎo)致兒童聽力損傷以及言語功能障礙的臨床常見疾病，具有一定的自限性，但是仍有20%～40%患者會出現(xiàn)反復(fù)發(fā)作，嚴(yán)重的影響了患者的生活質(zhì)量[17]。因此，積極探尋分泌性中耳炎的病因及機制并予以藥物干預(yù)治療是臨床治療規(guī)范方案治療的前提。

炎癥基因和細(xì)胞因子誘發(fā)的免疫炎癥是分泌性中耳炎的主要致病因素，抑制炎癥細(xì)胞因子釋放，可顯著恢復(fù)中耳通氣，改善分泌性中耳炎[18-19]。牡荊素主要是從山楂葉總黃酮分離、純化而得到的活性單體化合物，具有顯著的抗炎作用，能夠明顯減輕關(guān)節(jié)炎癥狀，并通過抑制炎癥因子表達(dá)改善葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎[20]?；谝陨涎芯?，推測牡荊素可能通過抑制炎癥反應(yīng)發(fā)揮分泌性中耳炎治療作用。

本研究通過構(gòu)建分泌性中耳炎大鼠模型，觀察牡荊素對其治療作用。研究發(fā)現(xiàn)，牡荊素能夠通過抑制炎癥因子釋放，改善分泌性中耳炎大鼠中耳黏膜病理性損傷。但是，有關(guān)牡荊素是通過何種機制抑制炎癥反應(yīng)發(fā)揮抗分泌性中耳炎作用尚未完全闡明。細(xì)胞焦亡為炎癥性細(xì)胞死亡方式，廣泛參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展。多項研究已證實，抑制Caspase-1 介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡能夠明顯降低炎癥因子釋放，進(jìn)而改善疾病癥狀[21-22]。袁玥等[23]研究證實，細(xì)胞焦亡的發(fā)生及其過程中的相關(guān)促炎癥細(xì)胞因子的釋放，會導(dǎo)致炎癥反應(yīng)進(jìn)一步擴大，加重氣道炎癥性疾病的進(jìn)展，提示細(xì)胞焦亡可能參與分泌性中耳炎炎癥反應(yīng)過程。Ding 等[24]研究證實，牡荊素能夠通過抑制GSDMD 介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡，降低炎癥因子水平，進(jìn)而緩解草酸鈣晶體誘導(dǎo)的腎結(jié)石小鼠癥狀。既往研究共同提示，牡荊素可能通過調(diào)控細(xì)胞焦亡通路發(fā)揮抗分泌性中耳炎作用?；诖?，本研究檢測了焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)牡荊素能夠明顯抑制焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)，降低炎癥反應(yīng)，進(jìn)而改善分泌性中耳炎大鼠中耳黏膜損傷。AMPK/NLRP3 信號通路是與細(xì)胞焦亡發(fā)生密切相關(guān)。研究證實，NLRP3 炎癥小體的組裝是激活細(xì)胞焦亡過程中關(guān)鍵基因Caspase-1 的前體，當(dāng)細(xì)胞受到外界危險信號刺激后，NLRP3、ASC 及pro-Caspase-1 三者會組裝為NLRP3 炎癥小體蛋白復(fù)合物，導(dǎo)致pro-Caspase-1 裂解形成具有活性的cleaved-Caspase-1（Caspase-1p20）誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡發(fā)生[25]，此過程可由AMPK 通路調(diào)控[26]。此外，抑制AMPK信號通路可顯著促進(jìn)NLRP3 炎癥小體活化，從而啟動細(xì)胞焦亡[27]。以往研究也證實，AMPK 和NLRP3 炎癥小體參與中耳炎疾病的發(fā)生發(fā)展，激活A(yù)MPK 通路或是抑制NLRP3 炎癥小體活化介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)能夠明顯改善內(nèi)皮細(xì)胞及中耳黏膜的損傷[28-29]，提示AMPK、NLRP3 基因可能是分泌性中耳炎疾病發(fā)生的重要調(diào)控因子。此外，Zhang 等[30]研究證實，牡荊素能夠通過抑制NLRP3 炎癥小體介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)改善慢性腦缺血性神經(jīng)損傷。Inamdar 等[31]研究發(fā)現(xiàn)，牡荊素能夠通過激活A(yù)MPK 信號通路，改善高脂飲食喂養(yǎng)誘導(dǎo)的小鼠非酒精性脂肪肝病變。以上研究共同表明，牡荊素很有可能通過調(diào)控AMPK、NLRP3 蛋白表達(dá)，發(fā)揮抗分泌性中耳炎作用。本研究結(jié)果顯示，與模型組相比，牡荊素能夠激活A(yù)MPK 通路，抑制NLRP3 蛋白表達(dá)，從而改善分泌性中耳炎大鼠中耳黏膜損傷，表明牡荊素可能通過調(diào)控AMPK/NLRP3 通路，抑制分泌性中耳炎大鼠細(xì)胞焦亡。鄧宏哲等[32]研究證實，人參皂苷Rg1 能夠通過激活A(yù)MPK 途徑抑制NLRP3 炎癥小體活化介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡，發(fā)揮抗博來霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化保護(hù)作用，且此保護(hù)作用可被AMPK 抑制劑Compound C 逆轉(zhuǎn)。為進(jìn)一步明確AMPK/NLRP3 通路在牡荊素抑制分泌性中耳炎中的作用，本研究通過對牡荊素高劑量大鼠ip AMPK 抑制劑，觀察牡荊素對大鼠分泌性中耳炎的作用能否被逆轉(zhuǎn)。結(jié)果顯示，與牡荊素組相比，AMPK 抑制劑Compound C 能夠抑制AMPK 通路，促進(jìn)NLRP3 炎癥小體活化介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡，誘發(fā)炎癥反應(yīng)，損害分泌性中耳炎大鼠中耳黏膜組織，從而逆轉(zhuǎn)牡荊素對分泌性中耳炎的保護(hù)作用。以上研究結(jié)果進(jìn)一步證實了牡荊素改善大鼠分泌性中耳炎與調(diào)控AMPK/NLRP3 介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡相關(guān)。

綜上所述，本研究通過探討牡荊素對分泌性中耳炎大鼠炎癥的影響及機制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，牡荊素能夠通過活化AMPK，抑制NLRP3 炎癥小體活化介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡，減輕炎癥反應(yīng)，從而改善分泌性中耳炎大鼠中耳黏膜損傷。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突