黎妍妍 邱夢娟 李錫宏 張藝千 徐婷婷 許汝冰 馬畔 鄭露 李倫安 黃俊斌

摘 ?要：煙草靶斑病是由立枯絲核菌（Kühn）侵染引起的煙草葉部病害，近年來在我國部分省份發(fā)生嚴重，危害煙草生產(chǎn)。為開發(fā)煙草靶斑病的早期快速診斷方法，本研究根據(jù)該病原菌的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS），設計了重組酶聚合酶擴增技術相關引物RsRPA-F3/R3，建立了一種靶斑病菌的重組酶聚合酶擴增結(jié)合側(cè)流層析試紙條（LFD-RPA）檢測方法。該方法能夠在37 ℃，15 min內(nèi)特異性地檢測到（1.40×10?copies/μL）質(zhì)粒DNA，與常規(guī)PCR靈敏度一致。在田間煙草靶斑病實時檢測中，準確率達95.83%。本方法具有快速、簡單、可視化等特點，為煙草靶斑病菌的田間快速診斷提供了技術支撐。

關鍵詞：煙草靶斑病；立枯絲核菌；重組酶聚合酶擴增技術；側(cè)流層析試紙條

中圖分類號：S435.72???????????????????????文獻標識碼：A ?????????????????????文章編號：1007-5119（2023）05-0062-08

Establishment of LFD-RPA Rapid Detection Technique for Tobacco Target Spot

LI Yanyan，?QIU Mengjuan，?LI Xihong， ZHANG Yiqian， XU Tingting，

XU Rubing， MA Pan， ZHENG Lu， LI Lun’an， HUANG Junbin

（1. Tobacco Research Institute of Hubei Province， Wuhan 430030， China; 2.?College of Plant Science and Technology， Huazhong Agricultural University， Hubei Provincial Key Laboratory for Crop Disease Monitoring and Safety Control， Wuhan 430070， China；3. Enshi Marketing Department in Enshi company of Hubei Tobacco company， Enshi， Hubei?445000， China）

Target spot caused by Kühn?is a tobacco leaf disease. In recent years， it has occurred seriously?in some?provinces of China， which endangers tobacco production. In this study， the recombinant enzyme polymerase technology?related primers?RsRPA-F3/R3 were designed according to the internal transcribed?spacer （ITS） of the pathogen， and a method of recombinase polymerase amplification combined with a lateral flow dipstick （LFD-RPA） was developed to establish early and rapid diagnosis technique for tobacco target spot disease. The LFD-RPA detection technology could detect plasmid DNA of ?（1.40×10?copies/μL）?within 15 min?at 37 ℃. The sensitivity was consistent with that of conventional PCR. The detection technology can be applied to the real-time detection of tobacco target spot disease in the field?with a 95.83% accuracy rate. The rapid detection technology established in this study has the characteristics of fast， simple and visual， and provides a new method for the rapid field diagnosis of tobacco target spot.

tobacco target spot; ; recombinase polymerase amplification （RPA）; lateral flow dipstick?（LFD）

基金項目：湖北省煙草公司科技項目（027Y2021-004、027Y2022-020）；中國煙草總公司重大科技項目[110202101045（LS-05）]

作者簡介：黎妍妍（1982-），博士，研究員，主要從事煙草綠色防控技術創(chuàng)新與推廣工作。E-mail：yanyanli0025@126.com

*通信作者。E-mail：李倫安，32616727@qq.com；黃俊斌，junbinhuang@mail.hzau.edu.cn

收稿日期：2023-06-29 ???????????修回日期：2023-09-11

煙草靶斑病是由立枯絲核菌（Kühn）侵染引起的煙草葉部病害，有性世代為瓜亡革菌[?（Frank） Donk]。煙草靶斑病于2006年在我國遼寧省丹東市首次報道，隨后該病害在廣西、黑龍江、吉林、云南、四川、湖南、貴州、湖北等地相繼發(fā)現(xiàn)。?具有菌絲融合現(xiàn)象，至今被報道14個融合群，包括AG-1到AG-13與橋接群AG-BI，國內(nèi)外侵染煙草造成煙草靶斑病的主要是AG-3融合群?。?可在一個生長季節(jié)多次進行再侵染，從而導致煙草靶斑病極易擴散傳播，給煙草產(chǎn)業(yè)造成重大經(jīng)濟損失。

植物病害的快速診斷技術可為病害的及時防控提供重要參考依據(jù)。植物病原真菌檢測和鑒定主要采用常規(guī)組織分離法對田間病害樣品進行分離，再進一步對分離物使用柯赫氏法則驗證，操作程序復雜，且鑒定過程存在的人為誤差可能影響試驗結(jié)果。分子生物學檢測技術的出現(xiàn)解決了傳統(tǒng)檢測技術耗時長、準確率低的弊端，常規(guī)PCR、實時熒光定量PCR、巢氏PCR、多重PCR等技術已用于煙草黑脛病、根黑腐病、青枯病、猝倒病等煙草病害的檢測，但這些檢測技術均需要價格昂貴的熱循環(huán)儀等設備，易受到設備條件限制。

重組酶聚合酶擴增技術（Recombinase ploymerase amplication，RPA）是一種新型恒溫核酸擴增技術，與PCR相比，操作簡便、反應快速、靈敏度高、特異性強，是一種可以替代PCR 的核酸檢測技術。與側(cè)流層析試紙條（Lateral flow dipstick，LFD）結(jié)合的LFD-RPA檢測方法通過在基礎體系中加入核酸外切酶Ⅳ、生物素（Biotin）標記的引物，并攜帶熒光基團（FAM）的探針，最終形成5′端帶有FAM、3′端帶有Biotin標記的產(chǎn)物。當產(chǎn)物加入定量的緩沖液后可分別與試紙條上的Biotin抗體和FAM抗體發(fā)生抗原抗體反應，從而在檢測線上顯色。該方法操作簡單，僅需肉眼就可完成反應結(jié)果的判別，不需借助其他設備或儀器，在短時間內(nèi)可完成大量樣品的檢測，在口岸與田間檢測中具有極大的應用潛力。

迄今為止，LFD-RPA檢測技術已廣泛應用在食品、人體和動物病原微生物以及植物病原微生物的檢測中。但目前關于絲核菌屬LFD-RPA檢測的報道較少，僅鞠玉亮等以小麥紋枯病菌（）的ITS（Internal Transcribed Spacer，內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)）序列為靶標基因建立了Rc-LFD-RPA技術，尚未見煙草靶斑病菌LFD-RPA檢測方法的報道。本研究根據(jù)煙草靶斑病菌ITS序列建立RPA擴增技術與LFD試紙條結(jié)合的LFD-RPA檢測方法，為煙草靶斑病的田間快速可視化檢測提供重要參考依據(jù)和技術支持。

1??材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?供試菌株 ?本研究供試菌株信息見表1，?AG-3 PT菌株由沈陽農(nóng)業(yè)大學吳元華教授提供。其他菌株經(jīng)組織分離、柯赫氏法則驗證、形態(tài)學與分子鑒定后，由華中農(nóng)業(yè)大學植物真菌病害研究室保藏。

1.1.2 ?試劑 ?2×Heff?PCR Master購自上海翊圣生物科技有限公司；NaOH溶液購自上海國藥集團化學試劑有限公司；Tris?HCl（pH=8.0）購自北京Solarbio公司；熒光定量PCR試劑盒（2×?Green?qPCR SuperMix）和-T1Cloning?Kit購自北京全式金公司；大腸桿菌DH5α由日本Takara公司提供；TIANprep Mini Plasmid Kit（質(zhì)粒小提試劑盒）由北京天根生物科技有限公司提供；土壤DNA提取試劑盒（EZNA? Soil?DNA Kit）和DNA純化試劑盒（DNA Pure?Cycle?Kit）購自美國Omega?Bio-Tek公司；TwistAmp? Basic?Kit（核酸等溫擴增試劑盒）與Milenia HybriDetect試紙條購買于英國TwistDX公司；RPA核酸擴增試劑盒（試紙條法）購自江蘇奇天基因生物科技有限公司；DNA純化試劑盒（DNA Pure?Cycle?Kit）購自美國Omega?Bio-Tek公司；10×Loading Buffer購于日本Takara公司。

1.2 ?方法

1.2.1 ?基因組DNA提取??供試菌株基因組DNA提?。簩⑺泄┰嚲昃糜赑DA平板25 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，挑取邊緣菌絲塊于新鮮PDA平板25 ℃恒溫培養(yǎng)7 d后使用CTAB法提取真菌基因組DNA。

田間煙草病害樣品DNA提?。菏褂肗aOH快速裂解法提取，每毫克煙草葉片組織中加入10 μL?的0.5 mol/L NaOH溶液，在研缽中將植物組織充分磨碎成糊后，轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中；12 000 r/min離心6 min；取上清液5 μL，加入495 μL 0.1 mol/L Tris-HCl（pH=8.0），混合均勻，得到含有靶斑病菌的煙草基因組DNA溶液。

1.2.2 ?引物篩選與探針設計 ?根據(jù)TwistDX官網(wǎng)（www.twistdx.co.uk）提供的引物與探針設計原則，選擇AG-3的ITS序列靶標基因，設計煙草靶斑病RPA上、下游引物。利用DNAMAN軟件將?AG-3 ITS序列（HQ241274.1）和GenBank數(shù)據(jù)庫中已報道的我國各省份煙草靶斑病菌進行序列比對，選擇特異性區(qū)域，使用Primer?primer 5.0軟件設計引物RsRPA-F1/R1、RsRPA-F2/R2和RsRPA-F3/R3（表2）。使用TwistAmp? Basic?Kit等溫擴增，擴增體系為：29.5?μL?Rehydration Buffer、2.4?μL?F/R（10?μmol/L）、12.2?μL?ddHO以及1?μL分離菌株XFQJ2-4的基因組DNA（40?ng/μL），然后將預混液加到含有凍干酶粉的TwistAmp? Basic反應管中，渦旋振蕩后再加入2.5 μL MgAc（280 nmol/L）激活反應，將反應管放入PCR儀中于39?℃、30?min孵育。選擇與煙草靶斑病為害癥狀相似的煙草炭疽病菌（）、煙草赤星病菌（）和煙草莖點霉葉斑病菌（）的DNA，進行Basic-RPA反應，初步篩選RPA引物的特異性。擴增產(chǎn)物使用DNA Pure-cycle Kit純化后，吸取4?μL擴增產(chǎn)物與1?μL的10×Loading Buffer混合，使用1%瓊脂糖凝膠進行顯色反應檢測。根據(jù)初篩后的引物設計LFD-RPA相關探針。

1.2.3??LFD-RPA檢測方法的建立 ?使用RPA核酸擴增試劑盒（試紙條法）進行LFD-RPA檢測，反應體系：25?μL緩沖液V、2.1?μL Primer RsRPA-F3、2.1?μL RsBio-R3、0.6 μL探針RsRPA-P（引物和探針濃度為10 μmol/L）、15.7?μL ddHO、2 μL DNA模板。將預混液加入到含有凍干酶粉的反應管中，最后加入2.5 μL的乙酸鎂激活反應，將反應管放入PCR儀中37?℃孵育15 min。吸取5?μL反應產(chǎn)物加入到100 μL HybriDetect分析緩沖液中，室溫下孵育3～5?min，然后將側(cè)流試紙條樣品端浸入反應管中，在3～5?min內(nèi)觀察質(zhì)控線和檢測線是否出現(xiàn)有顏色條帶。如質(zhì)控線和檢測線均出現(xiàn)條帶，則為陽性結(jié)果；如質(zhì)控線出現(xiàn)條帶，而檢測線未出現(xiàn)條帶，則判定為陰性結(jié)果。

1.2.4??LFD-RPA檢測靈敏度評價 ?將稀釋好的1.40×10、1.40×10、1.40×10、1.40×10、1.40×10、1.40×10?copies/μL六個濃度梯度的質(zhì)粒DNA進行常規(guī)PCR、熒光定量PCR與LFD-RPA檢測，每個處理3次重復。同時將LFD-RPA反應產(chǎn)物純化回收后使用1%瓊脂糖凝膠電泳進行顯色反應。

1.2.5??LFD-RPA檢測特異性評價 ?選擇與煙草靶斑病病害癥狀相似、常見煙草真菌病害以及水稻紋枯病病原菌的DNA進行特異性檢測，供試菌株見表1，同時將LFD-RPA反應產(chǎn)物純化回收后使用1%瓊脂糖凝膠電泳進行顯色反應。

1.2.6??田間自然發(fā)病樣品的LFD-RPA檢測 ?將田間自然發(fā)病樣品按常規(guī)組織分離法進行病原菌的分離，將能分離得到?AG-3的樣品記為陽性樣品，未能分離得到?AG-3的樣品記為陰性樣品，陽性樣品和陰性樣品按照1.2.1的方法提取DNA后進行LFD-RPA檢測，每個處理3次重復，同時將LFD-RPA反應產(chǎn)物純化回收后使用1%瓊脂糖凝膠電泳進行顯色反應。

1.2.7??常規(guī)PCR和熒光定量PCR檢測 ?使用?AG-3融合群熒光定量PCR特異性引物RsTqF1（5′-AAGAGTTTGGTTGTAGCTGGTCTA?TTT-3′）/RsTqR1（5′-AATTCCCCAACTGTCTCA?CAAGTT-3′）用于常規(guī)PCR檢測。常規(guī)PCR擴增體系（總體系為25 μL）：2×HeffTM PCR Master Mix?12.5 μL，RsTqF1 1 μL，RsTqR1 1 μL，DNA模板1 μL，ddHO 9.5 μL。PCR反應程序：94?℃預變性5 min；94?℃變性30 s，63 ℃退火30 s，72?℃延伸15?s，35個循環(huán)；72?℃終延伸5 min。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后使用DNA Pure?Cycle?Kit回收，克隆至pEASY?-T1載體，轉(zhuǎn)至大腸桿菌感受態(tài)DH5α細胞中，經(jīng)含有氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)基篩選后，獲得陽性轉(zhuǎn)化子并測序。將測序成功的陽性轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)入LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h后使用TIANprep Mini Plasmid Kit提取過表達質(zhì)粒DNA，使用NanoDrop? Lite分光光度計測定質(zhì)粒DNA濃度為61.7?ng/μL，質(zhì)粒拷貝濃度（copies/μL）=6.02×10×質(zhì)粒質(zhì)量濃度（g/μL）/質(zhì)粒分子質(zhì)量（g/mol），質(zhì)粒分子質(zhì)量（g/mol）=質(zhì)粒堿基數(shù)（bp）×650 da/bp。式中質(zhì)粒堿基數(shù)為4026 bp（其中-T1載體片段大小為3928 bp，目的片段擴增長度為98 bp），計算得到質(zhì)粒DNA拷貝數(shù)為1.40×10?copies/μL。將稀釋好的1.40×10～1.40×10?copies/μL?5個濃度梯度的質(zhì)粒DNA進行實時熒光定量PCR檢測，擴增體系為：10 μL?2×?Green?qPCR SuperMix，10 μmol/L上、下游引物RsTqF1/RsTqR1各0.4 μL，模板DNA 2 μL，加入ddHO補足到20 μL。熒光定量PCR反應在CFX96 Real-time?PCR System中進行，反應程序為：初始階段95 ℃?15 min，95 ℃反應15 s，56 ℃反應30 s，共擴增40個循環(huán)。熔解曲線的檢測中，從60 ℃到95 ℃每30 s增加0.5 ℃。每個濃度處理3次，熒光定量PCR擴增完成后，根據(jù)值（）與其相對應的質(zhì)粒DNA拷貝數(shù)的對數(shù)（）在Microsoft?Office?Excel?2016中繪制標準曲線并計算相關系數(shù)。

2??結(jié) ?果

2.1 ?引物的篩選

對設計的3對RPA引物進行初篩，產(chǎn)物純化后經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果表明（圖1），RsRPA-F1/R1與RsRPA-F2/R2引物?；暂^差，其他參考菌株也出現(xiàn)擴增條帶；而RsRPA-F3/R3引物僅能檢測到?AG-3分離菌株XFQJ2-4的基因組DNA，其他菌株無擴增條帶。因此，選取RsRPA-F3/R3引物設計探針并進行后續(xù)LFD-RPA試驗。

2.2 ?熒光定量PCR標準曲線的建立

使用10倍梯度濃度的質(zhì)粒DNA進行熒光定量PCR擴增，結(jié)果表明，該引物熔解曲線峰值單一（圖2A），值為80.5 ℃，表明該引物為特異性擴增引物；根據(jù)值（）與其相對應的質(zhì)粒DNA拷貝數(shù)的對數(shù)（）繪制標準曲線（圖2B），線性回歸方程為=?3.495+37.836，決定系數(shù)2=0.998 5，擴增效率=93.25%，符合高效率擴增條件。

2.3 ?LFD-RPA檢測靈敏度評價

靈敏度試驗結(jié)果表明（圖3），濃度為1.40×10～1.40×10?copies/μL的?AG-3質(zhì)粒DNA均能夠在LFD試紙條上出現(xiàn)檢測線，結(jié)果呈陽性，其中1.40×10?copies/μL濃度的質(zhì)粒DNA的檢測線微弱；而濃度為1.40×10?copies/μL與1.40×10?copies/μL的AG-3質(zhì)粒DNA在LFD試紙條上只能夠顯出質(zhì)控線，結(jié)果呈陰性。常規(guī)PCR檢測結(jié)果與瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果和LFD方式檢測結(jié)果一致。然而，熒光定量PCR檢測1.40×10?copies/μL濃度的質(zhì)粒DNA時，值<35，說明LFD-RPA檢測技術的靈敏度與常規(guī)PCR一致，略低于熒光定量PCR。

2.4 ?LFD-RPA檢測特異性評價

分別使用瓊脂糖凝膠電泳和LFD對表1中18個菌株的DNA擴增產(chǎn)物進行檢測，結(jié)果表明（圖4）：2個菌株（XFQJ2-4和XEHL3-5）與標準菌株?AG-3 PT擴增條帶清晰，LFD出現(xiàn)檢測線，結(jié)果呈陽性；而其他菌株檢測結(jié)果呈陰性，與瓊脂糖凝膠電泳的檢測結(jié)果一致。

2.5 ?田間自然發(fā)病樣品的LFD-RPA檢測效果

對32個田間自然發(fā)病樣品進行了常規(guī)組織分離、凝膠電泳檢測和LFD-RPA檢測。根據(jù)常規(guī)組織分離法分離結(jié)果，1～24號樣品能夠分離到煙草靶斑病病原菌，25～32號樣品未分離到該病原菌。瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果與常規(guī)組織分離法分離結(jié)果一致（圖5），1～24號樣品均能擴增出大小為207 bp的條帶，為陽性樣品；而25～32號樣品無擴增條帶，為陰性樣品。在LFD-RPA檢測結(jié)果中，24個陽性樣品中有1個檢測為陰性（樣品9），為假陰性，其他23個陽性樣品均出現(xiàn)檢測線，8個陰性樣品的檢測結(jié)果與常規(guī)組織分離法和瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果一致，僅出現(xiàn)質(zhì)控線，說明LFD-RPA檢測體系的準確率為95.83%。

3??討 ?論

前人對融合群的ITS序列進行了分析，本研究將AG-3的ITS序列作為RPA檢測體系的靶標序列設計RPA引物，同時與LFD結(jié)合建立了煙草靶斑病的LFD-RPA快速檢測方法。該方法能夠在37 ℃，15 min內(nèi)特異性檢測到濃度為1.40×10?copies/μL的質(zhì)粒DNA，與常規(guī)PCR靈敏度一致，略低于熒光定量PCR。將該方法應用于田間煙草靶斑病病害樣品中，發(fā)現(xiàn)能夠以約95%的檢出率特異性地檢測煙草靶斑病田間樣品。該方法特異性高、操作簡便、反應迅速，結(jié)果可視化，無需使用大型設備，可用于田間靶斑病樣品的實時檢測。

的快速檢測方式主要包括多重PCR、熒光定量PCR、巢式PCR等，近些年隨著核酸等溫擴增技術的發(fā)展，LAMP檢測技術也廣泛地應用于的檢測中。張照茹根據(jù)水稻紋枯病菌（?AG1-IA）的rDNA-ITS序列建立的RS-ITS-LAMP快速檢測體系，根據(jù)羥基萘酚藍（HNB）顏色反應可觀察到該體系的最低檢測極限為1 pg/μL，是普通PCR的100倍，該檢測方法具有高特異性，能夠從其他融合群中特異性識別出AG1-IA。肖艷松等根據(jù)?AG-3的ITS序列設計的熒光LAMP檢測體系能夠特異性檢測煙草靶斑病菌，檢測的最低DNA濃度為100?pg/μL。目前關于絲核菌屬LFD-RPA檢測的報道較少，鞠玉亮等以小麥紋枯病菌（）的ITS序列為靶標基因建立的Rc-LFD-RPA技術，可在38 ℃的等溫環(huán)境中30 min完成檢測，檢測極限為1 pg/μL，與常規(guī)PCR檢測極限一致，為絲核菌屬真菌的LFD-RPA檢測技術提供了重要參考依據(jù)和技術支持。暫未有煙草靶斑?。ˋG-3）LFD-RPA快速檢測技術的報道，因此本研究結(jié)果可填補該領域的技術空白。

雖然本研究建立的LFD-RPA檢測靈敏度較熒光定量PCR略低，但可以滿足田間環(huán)境下對該病害的檢測，其快速擴增與操作簡便等優(yōu)勢明顯優(yōu)于熒光定量PCR。該體系存在假陰性誤差的原因，主要有檢測樣品的純度，操作過程引起的誤差等，本研究使用NaOH快速裂解法提取田間樣品的DNA可能導致提取的DNA純度較差，擴增體系中可能存在干擾物質(zhì)影響LFD檢測線上的Biotin抗體與產(chǎn)物發(fā)生抗原抗體反應，從而影響在檢測線上的顯色；又或者使用LFD方式進行終端檢測時，需要將LFD試紙條插入稀釋后的擴增產(chǎn)物反應3～5 min，開蓋面臨環(huán)境核酸氣溶膠污染的風險，從而導致結(jié)果存在誤差。近年來一次性封閉式核酸檢測裝置的研發(fā)可使該問題得到一定改善。

4??結(jié) ?論

本研究根據(jù)煙草靶斑病菌的ITS序列設計LFD-RPA引物與探針，開發(fā)了一種能夠特異性檢測?AG-3融合群的可視化快速檢測方法，經(jīng)過反復驗證，該方法能夠特異性檢測煙草靶斑病田間樣品，可應用到該病害的田間快速檢測中。

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