李 萌,馬博華,許 琴,張東輝,李 倩,王曉鋒,尹東鋒*

(1.石河子大學 藥學院,新疆 石河子 832003,2.中國人民解放軍新疆軍區(qū) 總醫(yī)院,新疆 烏魯木齊 830000)

復方雙參合劑是課題組前期將人參皂苷和丹參提取物組合而成的制劑,實驗研究證明其提高抗缺氧耐疲勞作用明顯[1-2]。缺氧疲勞是世居平原地區(qū)的人群快速進入高原環(huán)境時,機體內(nèi)氧化應激失衡、勞動力普遍降低的一種高原反應。因此,尋找有效提高高原環(huán)境下機體作業(yè)能力的干預措施具有重要意義[3]。本實驗在復方雙參合劑的基礎上添加肉蓯蓉和歐白及兩味中藥,組合成復方參及合劑,以期達到效果更優(yōu)的抗缺氧耐疲勞作用。

復方參及合劑以人參、丹參為君藥,人參具有大補元氣、補脾益肺的功效,能提高抗衰老能力[4],增強免疫調(diào)節(jié)作用[5]。研究發(fā)現(xiàn),人參皂苷是人參適應性合成的主要次生代謝產(chǎn)物,具有化學抵御能力、抵抗環(huán)境脅迫的作用[6]。丹參為中醫(yī)臨床常用藥,能夠加快血液循環(huán),提升心肌活力,對肝臟具有保護作用[7],其提取物具有抗癌、抗氧化、增強免疫、修復受損神經(jīng)等藥理作用[8]。復方參及合劑以肉蓯蓉為臣藥,肉蓯蓉作為補益中藥,具有極高的藥用價值,素有“沙漠人參”之美譽,可補腎陽、益精血、保護神經(jīng)及臟器組織[9],肉蓯蓉苯乙醇苷為肉蓯蓉的主要藥效成分,具有抗缺血[10]、抗缺氧、抗疲勞作用[11];以歐白及為佐藥,《中華本草-維吾爾藥卷》中記載,歐白及具有溫腎補陽、填精肥體、滋補支配器官(心、肝、腦等)、強筋健肌、補血生精之功效。對復方參及合劑進行急性毒性實驗研究,可為進一步研究提供實驗數(shù)據(jù)支持和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器

ACS-1.5A型電子計重秤(上海友聲衡器有限公司);TDZ5電動離心機(湖南赫西儀器裝備有限公司);BC-2800Vet全自動血細胞分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司);BS-180全自動生化分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司);YB-6D生物組織石蠟包埋機(湖北孝感亞光電子技術公司);LEICA RM2135回旋式切片機(德國徠卡股份有限公司);CX43光學顯微鏡(日本Olympus工業(yè)有限公司)。

1.2 試藥

人參皂苷提取物(含80%,批號20210420)、肉蓯蓉苯乙醇苷提取物(含80%,批號:20210420)均由西安賽奧生物技術有限公司提供;丹參提取物(10∶1,批號:R18J11Y116119),由上海源葉生物科技有限公司提供;歐白及(原料藥)由新疆維吾爾制藥有限責任公司提供。V-28D獸用血液細胞分析儀用稀釋液(批號:2021112701)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Alanine amino transferase,ALT,批號:140121004)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(Aspartate aminotransferase,AST,批號:140221003)、肌酐(Creatinine,Cr,批號:141121009)、尿素(Urea,Ur,批號:141321005)、葡萄糖(Glucose,Glu,批號:141521005)、尿酸(Uric acid,UA,批號:141221004)、肌酸激酶(Creatine kinase,CK,批號:142522002)、甘油三酯(Triglyceride,TG,批號:141721004)、乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase,LDH,批號:142721003)均由深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司提供。

復方參及合劑制備:將歐白及原料粉碎后過篩,加10倍量蒸餾水,在65℃下攪拌4h,使其完全溶解至膠狀,得到歐白及溶液;歐白及溶液中加入按照質(zhì)量份稱取的丹參提取物,旋槳式攪拌器下600r/min攪拌2h,至藥物混合并完全溶解;在上述溶液中加入按照質(zhì)量份稱取的肉蓯蓉苯乙醇苷提取物,旋槳式攪拌器下700r/min攪拌1.5h,至完全溶解;最后在上述溶液中加入人參皂苷提取物,旋槳式攪拌器下800r/min攪拌1.5h,至四種提取物均完全溶解,根據(jù)不同量的配比制成低、中、高不同濃度的復方參及合劑。

1.3 實驗動物

SPF級昆明小鼠,雌雄各半,體質(zhì)量(20±2)g。購自新疆醫(yī)科大學實驗動物中心,動物許可證號:SCXK(新)2018-0002。適應性飼養(yǎng)1周,溫度18～25℃,相對濕度50%～70%,光照條件為12h明暗交替。動物實驗符合倫理學標準,并得到倫理委員會批準。

2 方法

2.1 半數(shù)致死量(LD50)實驗

SPF級昆明小鼠24只,雌雄各半,按體質(zhì)量隨機分成8組,每組3只,分別為正常對照雌、雄組、低劑量雌、雄組(1.0g/kg)、中劑量雌、雄組(2.0g/kg)、高劑量雌、雄組(3.0g/kg),各組小鼠給藥前禁食不禁水12h,按20mL/kg體質(zhì)量灌胃,2次/d,連續(xù)7d,并記錄每日體質(zhì)量。觀察小鼠活動變化,精神狀態(tài)、進食情況、體質(zhì)量變化及死亡數(shù),于末次給藥1h后處死并立即解剖,觀察小鼠心、肝、腦、肺等臟器變化。

2.2 最大給藥量(MLD)實驗

SPF級昆明小鼠24只,分組及給藥方式同上“2.1”項,按20mL/kg體質(zhì)量灌胃,3次/d,連續(xù)觀察7d,并記錄每日體質(zhì)量,小鼠處理同“2.1”項。

2.3 急性毒性實驗

SPF級昆明小鼠112只,雌雄各半,分為8組,每組14只,分別為正常對照雌、雄組、低劑量雌、雄組(1.0g/kg)、中劑量雌、雄組(2.0g/kg)、高劑量雌、雄組(3.0g/kg),實驗前禁食不禁水12h,按20mL/kg體質(zhì)量灌胃(每1mL含6g生藥量),每日1次,連續(xù)14d,記錄給藥前、給藥第7天、給藥第14天的體質(zhì)量,并觀察小鼠活動變化、精神狀態(tài)、進食情況、體質(zhì)量變化等毒性反應及死亡情況。

2.3.1 指標檢測 于末次給藥1h后記錄小鼠體質(zhì)量并采集血液,采用全自動血細胞分析儀檢測血常規(guī)指標:白細胞數(shù)(White blood cell,WBC)、淋巴細胞數(shù)(Lymph,Lym)、單核細胞數(shù)(Monday,Mon)、中性粒細胞數(shù)(Granulocyte,Gran)、紅細胞數(shù)(Red blood cell,RBC)、血紅蛋白(Hemoglobin,Hb)、紅細胞壓積(Red blood cell specific volume,HCT)、血小板數(shù)(Platelet,Plt)、血小板壓積(Plateletocrit,PCT);采用全自動生化分析儀檢測生化指標:谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、肌酐(Cr)、尿素(Ur)、葡萄糖(Glu)、尿酸(UA)、肌酸激酶(CK)、甘油三酯(TG)、乳酸脫氫酶(LDH)。

2.3.2 臟器組織病理學檢查 于末次給藥1h后處死小鼠,取心、肝、腦、肺臟器組織,用甲醛溶液固定、組織脫水、石蠟包埋、HE染色,做病理組織學檢查。

2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理

3 結果

3.1 半數(shù)致死量實驗結果

小鼠分別灌胃低、中、高3個劑量組藥物濃度的復方參及合劑后觀察7d,各組小鼠均無異常表現(xiàn),精神狀態(tài)良好,飲食正常,未發(fā)現(xiàn)死亡,解剖后觀察各臟器組織未發(fā)現(xiàn)異常變化,各組小鼠體質(zhì)量均明顯增加,證明此藥無明顯毒性反應,見圖1。

3.2 最大給藥量實驗結果

小鼠分別灌胃低、中、高3個劑量組藥物濃度的復方參及合劑后觀察7d,各組小鼠均無異常表現(xiàn),精神狀態(tài)良好,飲食正常,也未發(fā)現(xiàn)死亡,解剖后觀察各臟器組織亦未發(fā)現(xiàn)異常變化,各組小鼠體質(zhì)量均明顯增加,證明此藥無明顯的毒副作用,見圖2。

圖2 小鼠MLD體質(zhì)量變化曲線

3.3 急性毒性實驗結果

3.3.1 小鼠體質(zhì)量變化 與給藥前相比,給藥7d、給藥14d,各組小鼠均無異常表現(xiàn),精神狀態(tài)良好,飲食正常,無實驗動物死亡,且隨著實驗時間延長,各組小鼠體質(zhì)量均增加,但無顯著性差異(P>0.05),見表1。

表1 復方參及合劑對各組小鼠體質(zhì)量變化的影響

3.3.2 小鼠血常規(guī)檢測指標變化 與正常對照組比較,給藥組血常規(guī)數(shù)量包括白細胞數(shù)、淋巴細胞數(shù)、單核細胞數(shù)、中性粒細胞數(shù)、紅細胞數(shù)、血紅蛋白數(shù)、紅細胞壓積數(shù)、血小板數(shù)、血小板壓積數(shù)均無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表2。

表2 復方參及合劑對各組小鼠全血檢測指標變化的影響

3.3.3 小鼠生化檢測指標變化 與空白組比較,各組小鼠ALT、AST、UA、UREA、CREA、GLU、TG、CK、LDH均無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表3。

表3 復方參及合劑對各組小鼠生化檢測指標變化的影響

3.3.4 小鼠臟器組織病理變化 與正常組相比,復方參及合劑不同劑量組小鼠心臟、肝臟、腦、肺組織均無顯著性差異,各組織器官結構正常,未發(fā)現(xiàn)異常病理學變化,見圖3。

圖3 組織病理切片(HE×100)

4 討論

復方中藥制劑多組分間相互作用,具有多方面、多層次、多靶點的治療優(yōu)勢,發(fā)揮著綜合生物效應[12],但其作用機理較為復雜,其安全性問題成為保護臨床受試者安全、理解藥物毒理學特性的重要來源[13],也是影響民族醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)健康持續(xù)發(fā)展的重大科學問題[14-15]。ZHU等[16]實驗研究表明,人參皂苷可對腦血管疾病發(fā)揮有益的藥理和藥效作用,可顯著減輕血管舒縮功能,阻礙血小板活化,發(fā)揮抗血小板和抗血栓的作用。YU等[17]在研究丹參提取物協(xié)同效應和有效分子機制時,觀察到其對心臟具有保護作用,病理學檢查發(fā)現(xiàn),可減輕抗癌藥物引起的心肌細胞凋亡,有效減少與氧化應激反應和各種代謝途徑相關的蛋白質(zhì)的羥基化,保護介導的H9c2細胞的凋亡。藍天偉[18]研究發(fā)現(xiàn),肉蓯蓉苯乙醇苷能增強細胞存活能力,減少H2O2誘導細胞損傷后LDH釋放量,有效降低細胞凋亡率,抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激引起的心肌細胞損傷,發(fā)揮保護細胞的作用。實驗研究表明,人參皂苷[5]、丹參提取物[17]、肉蓯蓉苯乙醇苷[19]均具有確切的療效且無毒性反應。

急性毒性實驗是指受試動物1次或24h內(nèi)多次染毒后出現(xiàn)毒性反應的實驗[20]。半數(shù)致死量(LD50)是評價藥物急性實驗的一個重要指標,能夠有效評價藥物的急性毒性,LD50越大,表明該藥物毒性越低[21],實驗中未測出復方參及合劑的LD50值,表明復方參及合劑毒性很小,不存在毒副作用。最大給藥量(MLD)是指在合理的給藥濃度及給藥容量的前提下,1日內(nèi)單次或多次(2～3次)允許給予實驗動物的最大給藥劑量,在一定時間內(nèi)出現(xiàn)的毒性反應[20]。本實驗通過多次灌胃給藥,觀察不同劑量組小鼠活動變化、精神狀態(tài)、飲食情況、體質(zhì)量均無異常表現(xiàn),亦未出現(xiàn)中毒或死亡情況,小鼠各臟器組織均未見異常[22],小鼠灌胃給藥復方參及合劑低、中、高劑量組最大給藥量分別為3.0g/kg、6.0g/kg、9.0g/kg,相當于臨床擬推薦日劑量0.3g/70kg的700倍、1 400倍、2 100倍。血液學檢查和血液生化檢查是評價藥物對機體和組織器官病變的重要指標[23],能夠衡量出藥物對血液細胞及肝腎功能的損傷[24],實驗結果顯示,與正常對照組比較,復方參及合劑低、中、高劑量組白細胞數(shù)、淋巴細胞數(shù)、單核細胞數(shù)、中性粒細胞數(shù)、紅細胞數(shù)、紅細胞壓積數(shù)、血小板數(shù)、血小板壓積數(shù)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、肌酐、尿素、葡萄糖、尿酸、肌酸激酶、甘油三酯、乳酸脫氫酶等均無顯著性差異。組織HE染色是深入至組織細胞水平,對實驗動物的健康進行直觀判斷的一種病理學檢查[25],鏡下觀察顯示,各臟器組織結構均正常,無明顯病理性變化。

綜上所述,將丹參提取物、人參皂苷提取物、肉蓯蓉苯乙醇提取物、歐白及組合成復方參及合劑,以灌胃給藥的方式研究其對雌雄雙性小鼠的急性毒性作用,結果發(fā)現(xiàn),經(jīng)組合后可多途徑、多靶點作用于機體,無急性毒性反應且安全性較高,可為其進一步藥理學研究、作用機制研究提供理論依據(jù)。但此次實驗主要針對急性毒性進行研究,可能還存在慢性毒性或亞慢性毒性,因而對于復方參及合劑的安全性評價還需進行綜合考慮[26]。