魏 晴，薛 娟，梁珊珊 （貴州中醫(yī)藥大學藥學院，貴陽 550025）

艷山姜是姜科植物艷山姜Alpiniazerumbet（Pers.）Burtt.et Smith 的干燥根及根莖，是貴州特色苗藥，能溫中燥濕、行氣止痛，可用于心腹冷痛、胸腹脹滿、消化不良、嘔吐腹瀉等癥[1]。本課題組前期研究結果表明，艷山姜可通過抑制氧化應激和炎癥反應而減輕胃黏膜損傷，對無水乙醇和阿司匹林誘導的小鼠急性胃潰瘍均有明顯的改善作用[2]，但關于其藥效物質(zhì)基礎和分子機制尚不明確。有研究指出，黃酮類成分是艷山姜中的主要成分，其中二氫-5，6-脫氫香豆素、5，6-脫氫卡因均具有抗實驗性潰瘍的作用，二氫-5，6-去氫醉椒素、5，6-去氫醉椒素均能拮抗實驗性胃潰瘍和十二指腸潰瘍，山柰酚可通過調(diào)控白三烯C4和前列腺素E的表達而發(fā)揮抗?jié)冏饔肹3―4]。由此推測，黃酮類成分可能是艷山姜抗?jié)兊挠行С煞帧?/p>

微RNA（microRNA，miRNA）是內(nèi)源性的小非編碼RNA（長度為17～25 個核苷酸），可通過直接與靶基因的3′-非翻譯區(qū)（3′-untranslated region，3′-UTR）結合來負向調(diào)控該靶基因的表達，從而參與多種生理過程[5―6]。研究指出，miRNA-146a-5p（miR-146a-5p）過表達可降低核因子κB p65（nuclear factor-κB p65，NF-κB p65）蛋白及mRNA 的表達水平，同時還能減少炎癥因子[腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）]的分泌，并可負向調(diào)控應激性胃潰瘍的炎癥反應，從而發(fā)揮抗胃潰瘍作用[7]；進一步研究表明，miR-146a-5p 可通過預測靶蛋白腫瘤壞死因子受體關聯(lián)因子6（TNF receptor-associated factor 6，TRAF6）而進一步影響NF-κB 的下游通路，抑制人肝星狀細胞中相關細胞因子的信號轉(zhuǎn)導，對炎癥反應具有重要的調(diào)節(jié)作用[8]?；谄G山姜的傳統(tǒng)功效、miRNA的研究進展和本課題組的前期探索，本研究擬以人胃黏膜細胞為對象，以無水乙醇誘導建立急性胃潰瘍模型，通過檢測細胞中miR-146a-5p 與胃潰瘍、炎癥相關指標的表達/含量，探討艷山姜總黃酮能否通過調(diào)控miR-146a-5p來發(fā)揮抗胃潰瘍作用，為艷山姜及其活性成分的開發(fā)及利用提供實驗基礎。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括CFX96 型定量實時聚合酶鏈式反應（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）儀、Trans-Blot TurboTM型Western轉(zhuǎn)膜儀、DDY-10型電泳儀、Gel Doc XR 型凝膠成像分析儀（美國Bio-Rad 公司），D180型CO2恒溫培養(yǎng)箱（深圳市瑞沃德生命科技有限公司），SMZ645 型光學顯微鏡（日本Nikon 公司），YTMB96A 全自動多功能酶標儀（山東云唐智能科技有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

艷山姜藥材采自貴州省羅甸縣，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學藥學院孫慶文教授鑒定為姜科植物艷山姜A.zerumbet（Pers.）Burtt.et Smith的干燥根及根莖，標本存放于貴州中醫(yī)藥大學藥學院產(chǎn)地加工與炮制實驗室（標本號GY20221005001）。

兔源TRAF6、NF-κB p65、TNF-α、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）單克隆抗體及辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG 二抗（批號分別為CL647-66498、10745-1-AP、17590-1-AP、10494-1-AP、SA00001-2）均購自武漢三鷹生物技術有限公司；過表達miR-146a-5p（miR-146a-5p mimic）及其陰性對照（mimic NC）、敲減miR-146a-5p（miR-146a-5p inhibitor）及其陰性對照（inhibitor NC）、敲減TRAF6（TRAF6 siRNA）及其陰性對照（NC siRNA）、含TRAF6野生型（TRAF6 WT）或突變型（TRAF6 MUT）的3′-UTR片段均購自生工生物工程（上海）股份有限公司；腺病毒表達載體pacAd5 CMV-GFP（批號VECT10037）購自北京華越洋生物科技有限公司；熒光素酶pmirGLO載體（批號GN1439）購自上海蓋寧生物科技有限公司；Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑（批號MAN0009872）購自美國Sigma公司；正常兔IgG單克隆抗體（貨號10010322-1）購自深圳艾美捷科技有限公司；RNA 提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號分別為CW0581M、CW2569M）均購自康為世紀生物科技股份有限公司；IL-1β、IL-6、前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）檢測試劑盒（貨號分別為A220819、A220815、A220806）均購自武漢華聯(lián)科生物科技有限公司；MTT 試劑（貨號SR0051）購自南京都萊生物技術有限公司；ECL 化學發(fā)光試劑盒（批號P0018S）購自上海碧云天生物技術有限公司；青-鏈霉素雙抗、0.25%胰蛋白酶/乙二胺四乙酸（EDTA）消化液、蛋白裂解液、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（批號D0010）均購自北京索萊寶科技有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)液、胎牛血清均購自美國HyClone公司。

1.3 細胞

人胃黏膜細胞GES-1（貨號BFN60807461）購自美國ATCC細胞庫。

2 方法

2.1 艷山姜總黃酮的制備

取艷山姜藥材，粉碎，取粗粉100 g，用95%乙醇1 000 mL加熱回流提取2 h×3次；合并提取液，過濾，濃縮，制得浸膏（浸膏得率18.69%）。取上述浸膏，用適量水溶解，再加入適量乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，濃縮，制得總黃酮浸膏[總黃酮浸膏得率2.28%，純度42.61%（以蘆丁計）]，再用水溶解，制成質(zhì)量濃度為30 mg/mL（按生藥量計）的艷山姜總黃酮溶液，備用。

2.2 艷山姜總黃酮對細胞活力影響的考察及作用濃度的篩選

2.2.1 對細胞活力影響的考察

將正常GES-1 細胞接種于96 孔板中并分為空白組和艷山姜總黃酮不同質(zhì)量濃度組（24、48、60、80、120 mg/L，質(zhì)量濃度按前期預實驗結果設置），每組設6個復孔。空白組加入RPMI-1640 培養(yǎng)液（含青-鏈霉素雙抗和10%胎牛血清）20 μL，其余各組分別加入含不同質(zhì)量濃度艷山姜總黃酮的RPMI-1640 培養(yǎng)液20 μL；培養(yǎng)24 h 后，每孔加入MTT 溶液20 μL[9]；孵育4 h 后，吸棄培養(yǎng)液，加入二甲基亞砜150 μL，振蕩15 min后，使用酶標儀在490 nm波長處檢測各孔的光密度（OD）值并按下式計算各組細胞活力：細胞活力＝實驗組OD 值/空白組OD值×100%。

2.2.2 作用濃度的篩選

將正常GES-1細胞接種于96孔板中并分為空白組、模型組和模型+艷山姜總黃酮不同質(zhì)量濃度組（24、48、60、80、120 mg/L，質(zhì)量濃度按前期預實驗結果設置），每組設6個復孔。空白組和模型組加入RPMI-1640培養(yǎng)液（含青-鏈霉素雙抗和10%胎牛血清）20 μL；各藥物組加入含不同質(zhì)量濃度艷山姜總黃酮的RPMI-1640 培養(yǎng)液20 μL；培養(yǎng)12 h后，模型組和各藥物組分別加入無水乙醇7 μL以建立急性胃潰瘍細胞模型，空白組加入RPMI-1640 培養(yǎng)液（含青-鏈霉素雙抗和10%胎牛血清）7 μL；培養(yǎng)12 h 后，每孔加入MTT 溶液20 μL，按“2.2.1”項下方法檢測各組細胞活力，以確定后續(xù)實驗中艷山姜總黃酮的最適作用濃度。

2.3 細胞中miR-146a-5p表達水平的檢測

采用qRT-PCR 法進行檢測。將正常GES-1 細胞接種于96孔板中并分為空白組、模型組和模型+艷山姜總黃酮組（質(zhì)量濃度按“2.2.2”項下結果設置），每組設6 個復孔。按“2.2.2”項下方法培養(yǎng)、處理后，收集各組細胞，提取總RNA 并使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒處理得到cDNA。以所得cDNA 為模板，進行PCR 擴增。反應體系（20 μL）包括：cDNA模板1 μL，上、下游引物各0.5 μL，水8 μL，2×Mix 10 μL。miR-146a-5p的上游引物為5′-AGAACTGAATTCCATGGGTT-3′，下游引物為5′-GACAGAGATATCCCAGCTGAAGAA-3′，產(chǎn)物長度為397 bp；U6的上游引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′，產(chǎn)物長度為94 bp。反應條件如下：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，進行35 個循環(huán)；72 ℃再延伸5 min。以U6 為內(nèi)參，使用2－ΔΔCt法計算miR-146a-5p 的相對表達量，結果以空白組為參照進行歸一化處理。

2.4 細胞中NF-κB p65、TRAF6、TNF-α 蛋白表達水平的檢測

采用Western blot法進行檢測。收集“2.3”項下空白組、模型組、模型+艷山姜總黃酮組細胞，以RIPA裂解液裂解、提取細胞中的總蛋白，以BCA 法測定蛋白濃度后，于100 ℃下加熱5 min 變性；取變性蛋白適量，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)膜，以5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；加入GAPDH、NF-κB p65、TRAF6、TNF-α一抗（稀釋比例分別為1∶20 000、1∶1 000、1∶2 000、1∶2 000），于4 ℃下孵育過夜；加入相應二抗（稀釋比例為1∶1 000），于室溫下孵育1 h；用ECL 試劑顯影后，使用凝膠成像儀檢測并使用Image-Pro Plus 6軟件進行分析，以目的蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白（GAPDH）灰度值的比值作為目的蛋白的表達水平，結果以空白組為參照進行歸一化處理。

2.5 細胞上清液中IL-1β、IL-6、PGE2水平的檢測

采用ELISA 法進行檢測。收集“2.3”項下空白組、模型組、模型+艷山姜總黃酮組細胞上清液，參照相應試劑盒說明書方法，使用酶標儀檢測各組細胞上清液中IL-1β、IL-6、PGE2水平。

2.6 miR-146a-5p與TRAF6靶向關系的驗證

2.6.1 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?/p>

本課題組前期采用Targetscan 預測軟件，設置物種為“human”，依據(jù)“context score”進行miR-146a-5p 靶點篩選（評分越低則靶向的可能性越大），結果顯示，miR-146a-5p能夠與TRAF6的3′-UTR結合，提示兩者存在靶向關系。為進一步確認兩者關系，本研究采用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炦M行驗證：將含有預測結合位點TRAF6 WT 或TRAF6 MUT 的3′-UTR 片段分別克隆于熒光素酶pmirGLO 載體上，經(jīng)DNA 測序驗證后，利用Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑分別將TRAF6 WT 和miR-146a-5p mimic、TRAF6 WT 和mimic NC、TRAF6 MUT和miR-146a-5p mimic、TRAF6 MUT 和mimic NC 共轉(zhuǎn)染至正常GES-1細胞中（每組設3個復孔）；24 h后取出，使用多功能酶標儀檢測各組細胞的熒光素酶活性。

2.6.2 RNA結合蛋白免疫沉淀實驗

將正常GES-1細胞接種于6孔板中并分為不加抗體的input組（作背景參考）、與正常兔IgG抗體共孵育的陰性對照組和與TRAF6 抗體共孵育的anti-TRAF6 組，每組設3個復孔。收集細胞，使用RNA結合蛋白免疫沉淀裂解緩沖液裂解；取裂解物100 μL，與含磁珠的緩沖液混合后，與正常兔IgG 抗體或TRAF6 抗體（稀釋比例均為1∶200）一起孵育；蛋白經(jīng)蛋白酶K 緩沖液消化后，使用Trizol 試劑盒分離上述抗體結合的RNA，采用qRTPCR 法測定miR-146a-5p 的表達水平（具體操作和結果處理同“2.3”項）。若TRAF6抗體結合的miR-146a-5p的表達高于陰性對照，則說明miR-146a-5p 與TRAF6 有特異性結合。

2.6.3 Western blot實驗

將正常GES-1 細胞接種于6 孔板中并分為mimic NC 組、miR-146a-5p mimic 組、inhibitor NC 組和miR-146a-5p inhibitor 組，每組設6 個復孔。利用Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑分別轉(zhuǎn)染mimic NC、miR-146a-5p mimic、inhibitor NC、miR-146a-5p inhibitor；24 h后，收集各組細胞，采用Western blot 法檢測TRAF6 蛋白的表達水平（具體操作和結果處理同“2.4”項）。

2.7 過表達miR-146a-5p或敲減TRAF6對模型細胞上清液中IL-1β、IL-6、PGE2影響的檢測

為進一步確認miR-146a-5p 能否通過TRAF6 調(diào)控胃潰瘍的發(fā)生，本研究借助過表達miR-146a-5p 或敲減靶點TRAF6 蛋白的方式，觀察急性胃潰瘍模型細胞上清液中IL-1β、IL-6、PGE2的變化情況。取正常GES-1細胞，消化后接種于6 孔板中，培養(yǎng)24 h；將細胞分為模型組、模型+mimic NC 組、模型+miR-146a-5p mimic 組（過表達miR-146a-5p 實驗），以及空白組、空白+NC siRNA組、空白+TRAF6 siRNA 組和模型組、模型+NC siRNA組、模型+TRAF6 siRNA組（敲減TRAF6實驗），每組設6個復孔。除模型組/空白組外，其余各組分別利用Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染mimic NC、miR-146a-5p mimic、NC siRNA、TRAF6 siRNA；24 h 后，除空白組、空白+NC siRNA 組、空白+TRAF6 siRNA 組外的其余各組細胞均加入無水乙醇70 μL 以建立急性胃潰瘍細胞模型。培養(yǎng)12 h后，收集各組細胞，采用Western blot法檢測各組細胞中TRAF6 蛋白的表達水平（空白組、空白+NC siRNA 組、空白+TRAF6 siRNA 組，具體操作和結果處理同“2.4”項）以驗證TRAF6 的敲減情況。再采用ELISA 法檢測細胞上清液中IL-1β、IL-6、PGE2水平（模型組、模型+mimic NC組、模型+miR-146a-5p mimic組和模型組、模型+NC siRNA 組、模型+TRAF6 siRNA 組，具體操作同“2.5”項）。

2.8 敲減miR-146a-5p 對艷山姜總黃酮抗胃潰瘍作用的影響

本研究進一步通過敲減miR-146a-5p 的方式，觀察轉(zhuǎn)染miR-146a-5p inhibitor 能否逆轉(zhuǎn)艷山姜總黃酮對無水乙醇致胃黏膜細胞損傷的改善作用。取正常GES-1細胞，消化后接種于6 孔板中，培養(yǎng)24 h；將細胞分為模型+艷山姜總黃酮組、模型+艷山姜總黃酮+inhibitor NC組、模型+艷山姜總黃酮+miR-146a-5p inhibitor 組，每組設6 個復孔。除模型+艷山姜總黃酮組外，其余各組分別利用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染inhibitor NC和miR-146a-5p inhibitor；24 h 后，各組細胞均用含艷山姜總黃酮（質(zhì)量濃度按“2.2.2”項下結果設置）的RPMI-1640 培養(yǎng)液200 μL；培養(yǎng)12 h 后，各組細胞均加入無水乙醇70 μL以建立急性胃潰瘍細胞模型。培養(yǎng)12 h后，收集各組細胞，采用Western blot 法檢測各組細胞中TRAF6 蛋白的表達水平（具體操作和結果處理同“2.4”項），采用ELISA法檢測細胞上清液中IL-1β、IL-6、PGE2水平（具體操作同“2.5”項）。

2.9 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 21.0 軟件和GraphPad Prism 8 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)均以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 艷山姜總黃酮對細胞活力的影響及作用濃度篩選結果

隨著艷山姜總黃酮質(zhì)量濃度的升高，各藥物組細胞活力均較空白組逐漸降低，但組間比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），詳見圖1A。與空白組比較，模型組細胞活力顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，模型+艷山姜總黃酮48、60、80、120 mg/L組細胞活力均顯著升高（P＜0.05 或P＜0.01），詳見圖1B。因此，選取對細胞無明顯毒性但能改善無水乙醇所致?lián)p傷的60 mg/L作為后續(xù)實驗艷山姜總黃酮的作用濃度。

圖1 艷山姜總黃酮對細胞活力的影響及作用濃度篩選的結果（±s，n＝6）

3.2 艷山姜總黃酮對模型細胞中miR-146a-5p、炎癥相關蛋白表達和上清液中IL-1β、IL-6、PGE2水平的影響

與空白組比較，模型組細胞中miR-146a-5p 的相對表達量和上清液中PGE2水平均顯著降低（P＜0.01），細胞中NF-κB p65、TRAF6、TNF-α蛋白的表達水平和上清液中IL-1β、IL-6水平均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，模型+艷山姜總黃酮組細胞中miR-146a-5p的相對表達量和上清液中PGE2水平均顯著升高（P＜0.01），細胞中NF-κB p65、TRAF6、TNF-α蛋白的表達水平和上清液中IL-1β、IL-6 水平均顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01）。結果見圖2、表1。

表1 艷山姜總黃酮對模型細胞上清液中IL-1β、IL-6、PGE2水平的影響（±s，n＝6）

表1 艷山姜總黃酮對模型細胞上清液中IL-1β、IL-6、PGE2水平的影響（±s，n＝6）

a：與空白組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.01。

組別空白組模型組模型+艷山姜總黃酮組IL-1β/（ng/mL）3.17±0.12 18.32±1.13a 8.25±0.32b IL-6/（ng/mL）5.95±0.35 18.11±1.22a 8.68±0.92b PGE2/（ng/mL）6.86±0.38 3.14±0.19a 4.53±0.23b

圖2 艷山姜總黃酮對模型細胞中miR-146a-5p 和NFκB p65、TRAF6、TNF-α 蛋白表達的影響（±s，n＝6）

3.3 miR-146a-5p與TRAF6靶向關系的驗證結果

雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y果（圖3A）顯示，轉(zhuǎn)染TRAF6 WT 后，共轉(zhuǎn)染miR-146a-5p mimic 細胞的熒光素酶活性顯著低于共轉(zhuǎn)染mimic NC 細胞（P＜0.01）；而轉(zhuǎn)染TRAF6 MUT后，共轉(zhuǎn)染miR-146a-5p mimic細胞的熒光素酶活性與共轉(zhuǎn)染mimic NC 細胞比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。RNA結合蛋白免疫沉淀實驗結果（圖3B）顯示，與陰性對照比較，miR-146a-5p 在TRAF6抗體上的表達顯著升高（P＜0.01）。進一步的Western blot 實驗結果（圖3C、3D）顯示，與mimic NC 組比較，轉(zhuǎn)染miR-146a-5p mimic 后，細胞中TRAF6 蛋白的表達水平顯著降低（P＜0.01）；與inhibitor NC 組比較，轉(zhuǎn)染miR-146a-5p inhibitor 后，細胞中TRAF6 蛋白的表達水平顯著升高（P＜0.01）。

圖3 miR-146a-5p與TRAF6靶向關系的驗證結果

3.4 過表達miR-146a-5p或敲減TRAF6對模型細胞上清液中IL-1β、IL-6、PGE2水平的影響

3.4.1 過表達miR-146a-5p實驗

與模型組或模型+mimic NC 組比較，模型+miR-146a-5p mimic 組細胞上清液中IL-1β、IL-6 水平均顯著降低（P＜0.05），PGE2水平顯著升高（P＜0.05），結果見表2。

表2 過表達miR-146a-5p對模型細胞上清液中IL-1β、IL-6、PGE2水平的影響（±s，n＝6）

表2 過表達miR-146a-5p對模型細胞上清液中IL-1β、IL-6、PGE2水平的影響（±s，n＝6）

a：與模型組比較，P＜0.05；b：與模型+mimic NC組比較，P＜0.05。

組別模型組模型+mimic NC組模型+miR-146a-5p mimic組PGE2/（ng/mL）5.92±0.28 5.74±0.27 6.93±0.32ab IL-1β/（ng/mL）3.20±0.12 3.02±0.11 2.17±0.09ab IL-6/（ng/mL）6.03±0.38 5.89±0.32 4.64±0.18ab

3.4.2 敲減TRAF6實驗

轉(zhuǎn)染TRAF6 siRNA 后，細胞中TRAF6 蛋白的表達水平顯著低于空白組細胞和轉(zhuǎn)染NC siRNA的細胞（P＜0.05），表明敲減TRAF6蛋白的GES-1細胞構建成功（圖4）。與模型組或模型+NC siRNA 組比較，模型+TRAF6 siRNA 組細胞上清液中IL-1β、IL-6 水平均顯著降低（P＜0.05），PGE2水平顯著升高（P＜0.05），說明TRAF6蛋白能夠激活下游通路，刺激無水乙醇誘導的GES-1細胞分泌炎癥因子（表3）。

表3 敲減TRAF6 對細胞上清液中IL-1β、IL-6、PGE2水平的影響（±s，n＝6）

表3 敲減TRAF6 對細胞上清液中IL-1β、IL-6、PGE2水平的影響（±s，n＝6）

a：與模型組比較，P＜0.05；b：與模型+NC siRNA組比較，P＜0.05。

組別模型組模型+NC siRNA組模型+TRAF6 siRNA組PGE2/（ng/mL）5.86±0.28 5.80±0.27 6.84±0.29ab IL-1β/（ng/mL）3.17±0.12 3.14±0.11 2.05±0.08ab IL-6/（ng/mL）5.95±0.35 5.91±0.34 3.17±0.17ab

3.5 敲減miR-146a-5p對模型細胞中TRAF6蛋白表達及上清液中IL-1β、IL-6、PGE2水平的影響

與模型+艷山姜總黃酮組或模型+艷山姜總黃酮+inhibitor NC組比較，模型+艷山姜總黃酮+miR-146a-5p inhibitor組細胞中TRAF6蛋白的表達水平和上清液中IL-1β、IL-6水平均顯著升高（P＜0.05），PGE2水平顯著降低（P＜0.05）。結果見圖5、表4。

表4 敲減miR-146a-5p 對模型細胞上清液中IL-1β、IL-6、PGE2水平的影響（±s，n＝6）

a：與模型+艷山姜總黃酮組比較，P＜0.05；b：與模型+艷山姜總黃酮+inhibitor NC組比較，P＜0.05。

PGE2/（ng/mL）6.28±0.34 5.89±0.30 3.47±0.19ab組別模型+艷山姜總黃酮組模型+艷山姜總黃酮+inhibitor NC組模型+艷山姜總黃酮+miR-146a-5p inhibitor組IL-1β/（ng/mL）2.28±0.09 2.31±0.10 3.68±0.28ab IL-6/（ng/mL）5.01±0.29 4.89±0.27 6.24±0.38ab

圖5 敲減miR-146a-5p 對模型細胞中TRAF6 蛋白表達的影響

4 討論

作為貴州特色苗藥，艷山姜常被用于治療胃潰瘍?，F(xiàn)代研究表明，黃酮類成分是艷山姜的主要成分，包括蘆丁、槲皮素和山柰酚等；同時，黃酮類成分也是艷山姜的藥效成分，具有降壓、利尿和抗?jié)兊幕钚訹10]。因此，本研究以艷山姜總黃酮為干預成分，以人GES-1細胞為對象，評價艷山姜總黃酮對無水乙醇致急性胃潰瘍模型細胞的改善作用。結果表明，艷山姜總黃酮能通過抑制細胞中NF-κB p65、TRAF6、TNF-α蛋白的表達和下游炎癥因子IL-1β、IL-6的分泌，從而發(fā)揮對胃黏膜細胞損傷的改善作用。

miRNA由內(nèi)源基因編碼，對多種生物學行為具有重要的調(diào)節(jié)作用，可廣泛參與多種基因表達和RNA 沉默的調(diào)控[11―12]。綜合既往文獻和現(xiàn)代研究進展，本研究選擇了與胃潰瘍相關的miR-146a-5p進行研究，結果表明，在無水乙醇誘導的急性胃潰瘍模型細胞中，miR-146a-5p 的相對表達量顯著降低，而模型+艷山姜總黃酮組細胞中miR-146a-5p的相對表達量顯著升高。

為進一步探索miR-146a-5p 對胃潰瘍的調(diào)控作用，本研究通過qRT-PCR、Western blot、細胞轉(zhuǎn)染等實驗對miR-146a-5p的靶點和調(diào)控機制進行了探討。雙熒光素酶報告基因、RNA 結合蛋白免疫沉淀實驗和針對TRAF6 蛋白的Western blot 實驗結果均證實了miR-146a-5p與TRAF6蛋白之間存在靶向關系，且miR-146a-5p能夠負向調(diào)控TRAF6蛋白的表達。本研究經(jīng)進一步過表達miR-146a-5p 或敲減TRAF6 后發(fā)現(xiàn)，無水乙醇致急性胃潰瘍模型細胞上清液中與炎癥相關的IL-1β 和IL-6水平均顯著降低，而與胃潰瘍相關的PGE2水平顯著升高，說明過表達miR-146a-5p 或敲減TRAF6 均能抑制下游炎癥因子的釋放，從而發(fā)揮抗胃潰瘍作用。

為進一步探索TRAF6 對下游通路的影響，本研究通過Western blot法對TRAF6下游的NF-κB p65和TNFα蛋白表達情況進行檢測，結果顯示，在無水乙醇誘導的急性胃潰瘍模型細胞中，艷山姜總黃酮能顯著提高上述蛋白的表達。TRAF6、NF-κB p65、TNF-α均為NF-κB信號通路上的關鍵蛋白，而NF-κB通路能夠調(diào)控胃黏膜上皮細胞炎癥反應的發(fā)生[13―15]。研究指出，在生長因子等活性物質(zhì)的刺激下，胃潰瘍患者的胃黏膜上皮細胞通透性增加，可使有毒物質(zhì)和病原微生物穿過胃壁，從而激活TRAF6；TRAF6 可進一步激活下游核因子κB 抑制因子B（inhibitory subunit of NF-κB，IкB），使細胞質(zhì)中原本與IкB蛋白相結合的NF-кB從復合體中釋放出來，并遷移到細胞核中；細胞核中的NF-кB可觸發(fā)其他促炎細胞因子（如IL-1β 和TNF-α）的轉(zhuǎn)錄和釋放，從而促進潰瘍的發(fā)展[16―18]。本研究結果還表明，艷山姜總黃酮可上調(diào)無水乙醇致急性胃潰瘍模型細胞中miR-146a-5p 的表達；敲減miR-146a-5p 可逆轉(zhuǎn)艷山姜總黃酮對急性胃潰瘍模型細胞的改善作用，增加IL-1β、IL-6 的分泌，提示艷山姜總黃酮可通過上調(diào)miR-146a-5p 而抑制TRAF6的表達，進一步抑制下游炎癥因子的分泌，從而發(fā)揮抗胃潰瘍作用。

綜上所述，艷山姜總黃酮對無水乙醇致胃黏膜細胞損傷有一定的改善作用，其機制可能與上調(diào)miR-146a-5p的表達、抑制TRAF6蛋白的表達，進而抑制相關炎癥因子的分泌有關。本研究結果為艷山姜總黃酮促進miR-146a-5p 表達、參與調(diào)控胃潰瘍的研究提供了新的證據(jù)，對進一步挖掘胃潰瘍的治療方法具有重要意義。