管藝同，朱 淵，陸益紅

江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，南京 210019

蔗糖由一分子葡萄糖和一分子果糖的半縮醛羥基彼此縮合脫水而構(gòu)成，為自然界中分布最廣泛的非還原性二糖，有旋光性，但無變旋光作用。作為一種常見的輔料，其在藥品和生物制品中應(yīng)用廣泛，不僅可以作為矯味劑或賦形劑應(yīng)用于糖漿劑、顆粒劑、片劑、口服溶液劑、注射劑等劑型的生產(chǎn)[1]，還可在生物制品中充當(dāng)冷凍干燥保護(hù)劑[2]。蔗糖通過改變生物制品在凍干過程中的物理化學(xué)環(huán)境，可以減輕細(xì)胞的損傷和一些蛋白質(zhì)的鈍化，盡可能保持原有的生物學(xué)活性，并提高制劑穩(wěn)定性[3]。因此，蔗糖在制劑制備過程中發(fā)揮著十分重要的作用。

蔗糖的含量往往對(duì)制劑的有效性、穩(wěn)定性和安全性存在著一定程度的影響，例如在生物制品中，蔗糖對(duì)蛋白質(zhì)的保護(hù)作用有時(shí)依賴于濃度。一般來說，在特定的濃度范圍內(nèi)，蔗糖的保護(hù)作用隨著濃度升高而增強(qiáng)。然而，當(dāng)達(dá)到一定濃度后，保護(hù)作用達(dá)到最大值，進(jìn)一步提高蔗糖濃度則不再增加保護(hù)效果，甚至可能降低保護(hù)作用[4]。此外，蔗糖的含量還會(huì)影響制劑的滲透壓，且由于不同個(gè)體耐糖量存在顯著差異，過量攝入蔗糖可能對(duì)身體產(chǎn)生不利影響。故為使蔗糖充分發(fā)揮藥用輔料的作用，有必要建立方法以準(zhǔn)確測(cè)定其在藥品和生物制品中的含量，從而指導(dǎo)生產(chǎn)工藝的優(yōu)化和調(diào)整。

蔗糖含量的測(cè)定方法包括基于氧化還原反應(yīng)的經(jīng)典化學(xué)方法、旋光法、色譜法、近紅外光譜法、毛細(xì)管電泳法等。由于蔗糖在各類制劑產(chǎn)品中存在的形式各有不同，且不同產(chǎn)品中的蔗糖含量差異較大。因此，應(yīng)針對(duì)各類產(chǎn)品的不同特性以及蔗糖含量的水平差異，選擇最合適的方法。本文列舉了目前較為常用的各類蔗糖含量測(cè)定方法，并對(duì)各方法的優(yōu)缺點(diǎn)及適用情況進(jìn)行了闡述，以期為實(shí)際工作中蔗糖含量檢測(cè)技術(shù)的選用提供一定參考。

1 基于氧化還原反應(yīng)的經(jīng)典化學(xué)方法

蔗糖本身不具有還原特性，但一分子蔗糖在酸或蔗糖酶的作用下，可以水解為一分子D-葡萄糖和一分子D-果糖，兩者均為還原性糖。蔗糖的水解產(chǎn)物與3，5-二硝基水楊酸[5]、間苯二酚[6，7]或斐林試劑[8]等在一定條件下能夠發(fā)生氧化還原反應(yīng)，產(chǎn)生顏色或沉淀?？苫诖嗽?，利用比色法或滴定法對(duì)蔗糖含量進(jìn)行測(cè)定。

這類方法成本較低，但操作步驟繁瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，精密度和靈敏度均不佳，且易受到多種因素的干擾，如其他還原性糖類、色素、蛋白質(zhì)等的存在均可能導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果不準(zhǔn)確，因而不適合用于檢測(cè)蔗糖含量較低、基質(zhì)復(fù)雜的樣品。

2 旋光法

蔗糖具有旋光性，可以采用旋光法測(cè)定。2020年版 《中國藥典》 四部藥用輔料蔗糖的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[9]中，比旋度被作為性狀項(xiàng)列出。楊燁等[10]開發(fā)了一種基于旋光法的蔗糖含量測(cè)定方法，用于定量測(cè)定b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗中的蔗糖。該方法在蔗糖濃度為2～10 mg·mL-1的范圍內(nèi)與旋光度具有良好的線性關(guān)系（r=0.999 9），且準(zhǔn)確性、重復(fù)性均良好。

采用旋光法測(cè)定蔗糖操作簡(jiǎn)單、成本低廉。但專屬性較差，對(duì)蔗糖不具有選擇性，且靈敏度低，不適用于微量蔗糖測(cè)定，在用于測(cè)定規(guī)格較小的疫苗等生物制品時(shí)存在局限性，因此目前應(yīng)用較少。

3 高效液相色譜法

高效液相色譜法（high-performance liquid chromatography，HPLC）的原理是基于不同組分同時(shí)進(jìn)入色譜柱后，在流動(dòng)相及固定相之間的溶解度、吸附作用、滲透作用等均有一定區(qū)別，導(dǎo)致各個(gè)組分的移動(dòng)速度產(chǎn)生區(qū)別，在移動(dòng)一定距離后依次進(jìn)入特定檢測(cè)器，從而實(shí)現(xiàn)不同組分的分離。可根據(jù)色譜峰的保留時(shí)間對(duì)化合物進(jìn)行定性，根據(jù)峰面積對(duì)化合物實(shí)現(xiàn)定量。HPLC 在分離和分析方面具有高度的靈活性和可調(diào)性，除了調(diào)整流動(dòng)相的相關(guān)參數(shù)外，選擇恰當(dāng)?shù)纳V柱和檢測(cè)器同樣可以優(yōu)化分離效果和靈敏度，以滿足特定的分析要求，這使得HPLC 適用于各種復(fù)雜樣品和不同含量的蔗糖定量分析。下文將從目前蔗糖含量測(cè)定常用的檢測(cè)器和色譜柱方面對(duì)HPLC 進(jìn)行介紹。

3.1 檢測(cè)器

HPLC 可根據(jù)待測(cè)物質(zhì)的理化性質(zhì)適配不同的檢測(cè)器。蔗糖本身不具有生色官能團(tuán)，無法直接用紫外檢測(cè)器檢測(cè)。在目前可采用的各類檢測(cè)器中，應(yīng)用最為廣泛的是示差折光檢測(cè)器（refractive index detector，RID）和蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（evaporative light scattering detector，ELSD）。

3.1.1 示差折光檢測(cè)器 示差折光檢測(cè)器是通過連續(xù)監(jiān)測(cè)參比池和測(cè)量池中溶液的折射率之差來測(cè)定試樣濃度的檢測(cè)器。由于每種物質(zhì)都具有專屬的折射率，因而RID 屬于通用型檢測(cè)器，適用于蔗糖的檢測(cè)。雒麗紅等[11]采用HPLC-RID 法同時(shí)測(cè)定了乙型腦炎減毒活疫苗等4 種生物制品中的蔗糖和乳糖含量，該方法能將兩種糖完全分離，特異性較好，在0.50～20.00 mg·mL-1范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)r2均達(dá)到0.999 9 以上，蔗糖的最低檢測(cè)限和定量限分別為0.01 mg·mL-1和0.10 mg·mL-1。強(qiáng)鵬俠等[12]采用HPLC-RID 法測(cè)定凍干b 型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗中的蔗糖含量，方法準(zhǔn)確度、重現(xiàn)性及專屬性均較好，系統(tǒng)適用性驗(yàn)證表明葡萄糖的存在對(duì)蔗糖出峰無干擾（圖1）。蔗糖在2.5～40.0 mg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r2＞0.999）。

圖1 HPLC-RID 法測(cè)定凍干b 型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗中蔗糖含量的典型色譜圖[12]

RID 對(duì)外界環(huán)境的變化十分敏感，溫度、壓力、濃度、流速、pH 值的變化都會(huì)引起待測(cè)物質(zhì)密度變化，從而導(dǎo)致折射率的改變，進(jìn)而影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此不能使用梯度洗脫，可能導(dǎo)致分離時(shí)間較長，不利于分離一些成分復(fù)雜的樣品。同時(shí)，RID 的操作原理和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)使其對(duì)流動(dòng)相及溶劑的純度要求較高，并容易受到污染物的影響，故在耐用性方面存在一定不足，且相對(duì)其他檢測(cè)器而言靈敏度較低。

3.1.2 蒸發(fā)光散射檢測(cè)器 蒸發(fā)光散射檢測(cè)器也屬于通用型檢測(cè)器，同樣適用于沒有紫外吸收的組分測(cè)定，其工作原理包括霧化、流動(dòng)相蒸發(fā)和激光束檢測(cè)三個(gè)過程。樣品從色譜柱后流出，進(jìn)入霧化器形成微小液滴，與通入的氣體（通常是氮?dú)?，有時(shí)也可用空氣）混勻，隨后經(jīng)過加熱的漂移管，蒸發(fā)除去流動(dòng)相，使樣品組分形成氣溶膠。最后利用強(qiáng)光或激光照射氣溶膠，產(chǎn)生光散射，并通過光電二極管檢測(cè)散射光的強(qiáng)度。吳國真等[13]采用HPLC-ELSD 法同時(shí)測(cè)定天麻中活性成分天麻素及風(fēng)味物質(zhì)果糖、葡萄糖和蔗糖的含量。該方法分析時(shí)間較短，能夠?qū)崿F(xiàn)各成分的基線分離，其中蔗糖在0.12～1.50 mg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r2≥0.999），定量限和檢測(cè)限分別為0.45 μg 和0.15 μg。陳夢(mèng)等[14]采用HPLC-ELSD法同時(shí)測(cè)定微膠囊中阿拉伯糖、果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的含量，其中蔗糖在0.32～5.00 mg·mL-1的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r2＞0.999），檢出限為0.02 mg·mL-1。在方法摸索過程中發(fā)現(xiàn)在流動(dòng)相中添加適量的氨水能夠顯著提高分離度并改善峰形，因此選取1%氨水和乙腈作為流動(dòng)相。由于等度模式難以將色譜柱上保留的成分完全洗脫，因此實(shí)驗(yàn)中采用了梯度模式，實(shí)現(xiàn)了各成分的完全洗脫和有效分離（圖2）。

圖2 HPLC-ELSD 法測(cè)定微膠囊中6 種糖含量的典型色譜圖[14]

相較于RID，ELSD 靈敏度更高，對(duì)流動(dòng)相系統(tǒng)及溫度變化不敏感，可以進(jìn)行梯度洗脫，且不必嚴(yán)格控制環(huán)境溫度。由于流動(dòng)相及其中的揮發(fā)性成分在蒸發(fā)器內(nèi)揮發(fā)氣化，因此消除了前溶劑峰的干擾，可以使基線更平穩(wěn)，分離時(shí)間更短，定量精度更高，不受溶劑成分影響。但蒸發(fā)光散射檢測(cè)器要求組成流動(dòng)相的各組分必須具有揮發(fā)性，不能使用磷酸鹽等非揮發(fā)性物質(zhì)。

3.1.3 電噴霧檢測(cè)器 電噴霧檢測(cè)器（charged aerosol detector，CAD）是一種新型的通用型檢測(cè)器，可用于蔗糖含量檢測(cè)。與HPLC 聯(lián)用時(shí)，HPLC 的洗脫液在霧化器中霧化形成含有待測(cè)物的較小液滴，經(jīng)過蒸發(fā)管干燥后與帶電氮?dú)馀鲎?，使得待測(cè)物質(zhì)顆粒表面帶上正電荷，最后通過高靈敏度的靜電檢測(cè)計(jì)測(cè)量待測(cè)物質(zhì)的電荷量并形成電信號(hào)，該信號(hào)強(qiáng)度與待測(cè)物質(zhì)的質(zhì)量成正比。近年來，CAD 在藥物分析領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛，國外藥典已收載多個(gè)采用CAD 的液相色譜分析方法[15]。孫亞靈等[16]建立了測(cè)定蔗糖含量的HPLC-CAD 方法，并對(duì)色譜柱、流動(dòng)相和檢測(cè)器參數(shù)的優(yōu)化過程進(jìn)行了討論。所建立的方法專屬性強(qiáng)，分離效果好，受環(huán)境影響小（圖3），在質(zhì)量濃度為4.95～99.10 μg·mL-1的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r ＞0.999）。張素紅等[17]建立了利用HPLC-CAD 同時(shí)測(cè)定白茅根樣品中果糖、葡萄糖和蔗糖的方法，在建立的液相色譜條件下，上述3個(gè)糖類成分分離完全，其中蔗糖進(jìn)樣量在5.274～31.650 μg 范圍內(nèi)線性良好（r=0.999 6），檢測(cè)下限為5.285 μg·mL-1。

圖3 HPLC-CAD 法測(cè)定蔗糖含量的系統(tǒng)適用性溶液（A）和空白溶劑（B）典型色譜圖[16]

CAD 在原理和特征上與ELSD 有相似之處，均無需嚴(yán)格控制環(huán)境溫度，但流動(dòng)相不可使用非揮發(fā)性成分。CAD 對(duì)于高鹽濃度的樣品也有一定的限制，可能需要進(jìn)行前處理或使用低鹽流動(dòng)相。與ELSD 相比，CAD 具有更高的檢測(cè)靈敏度、更好的重復(fù)性和更寬的線性范圍，通?？蛇_(dá)3～4 個(gè)數(shù)量級(jí)。此外，CAD 的測(cè)定參數(shù)基本已在出廠時(shí)設(shè)定好，每次分析的條件相對(duì)固定，因此重現(xiàn)性較好[18]。

3.1.4 離子色譜-脈沖安培檢測(cè)器 離子色譜法（ion chromatography，IC）是高效液相色譜法的一種，應(yīng)用于蔗糖含量測(cè)定時(shí)一般采用脈沖安培檢測(cè)器（pulsed amperometric detector，PAD），故本文將IC-PAD 法列入檢測(cè)器方面進(jìn)行介紹。該方法的原理是根據(jù)不同的離子態(tài)物質(zhì)在離子交換柱上具有不同的遷移速率，將物質(zhì)進(jìn)行分離，隨后離子態(tài)物質(zhì)在PAD 的工作電極表面發(fā)生氧化還原反應(yīng)，引起電流變化而被自動(dòng)檢測(cè)[19]。由于中性糖類化合物的酸離解常數(shù)在12～14 之間，在強(qiáng)堿淋洗液中可部分或全部解離成陰離子形式，從而在陰離子交換柱上被保留并分離[20]。陰離子態(tài)的蔗糖在脈沖安培檢測(cè)器的金電極上發(fā)生氧化反應(yīng)而產(chǎn)生電流信號(hào)，因此可以采用離子色譜法對(duì)樣品中的蔗糖進(jìn)行分離分析。

郭雅娟等[21]建立IC-PAD 法同時(shí)對(duì)甘露醇中的葡萄糖、甘露糖、蔗糖和果糖含量進(jìn)行測(cè)定。該方法采用CarboPacPA20 分析柱（3.0mm×150mm）與CarboPac PA20 保護(hù)柱（3.0mm×30mm），以100mmol·L-1氫氧化鈉溶液作為淋洗液，進(jìn)行梯度洗脫。結(jié)果表明，在0.025～2.500 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)，各成分峰面積均分別與質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r 均大于0.999。

李曉東等[3]以口服輪狀病毒疫苗中蔗糖組分為分析對(duì)象，分別采用旋光法、HPLC-RID 法、IC-PAD法進(jìn)行測(cè)定和對(duì)比（圖4）。其中HPLC-RID 法檢測(cè)蔗糖的最小檢出限為5 mg·L-1，而IC-PAD 法的最小檢出限為6 μg·L-1，最小定量限為30 μg·L-1。上述結(jié)果表明，在靈敏度方面，IC-PAD 法是HPLC-RID法的將近1000 倍。

圖4 HPLC-RID 法（A）和IC-PAD 法（B）測(cè)定疫苗制品中蔗糖含量的典型色譜圖[3]

IC-PAD 法的分析時(shí)間短、專屬性強(qiáng)、靈敏度高、樣品無需衍生化。但由于流動(dòng)相為強(qiáng)堿介質(zhì)，可能造成樣品中某些組分降解，因此在選擇和優(yōu)化分析條件時(shí)需要特別注意，以避免可能的降解影響。此外，離子色譜儀價(jià)格相對(duì)昂貴，分析條件較為苛刻，對(duì)實(shí)驗(yàn)室要求較高。

3.1.5 質(zhì)譜檢測(cè)器 質(zhì)譜檢測(cè)器（mass spectrometry detector，MS）具有高靈敏度和高專屬性的特點(diǎn)。樣品經(jīng)過色譜分離后，首先在接口中被電離，生成的氣相離子通過質(zhì)量分析器按m/z 的大小順序分離，并通過離子檢測(cè)器將離子信號(hào)轉(zhuǎn)化為電信號(hào)。MS常用的離子源主要為電噴霧離子源（electrospray ionization source，ESI）和大氣壓化學(xué)離子源（atmospheric pressure chemical ionization source，APCI）。目前在生物代謝研究中已較為廣泛地利用高效液相色譜或氣相色譜聯(lián)用質(zhì)譜檢測(cè)器測(cè)定生物樣品中的蔗糖，但在藥品及生物制品領(lǐng)域仍應(yīng)用較少?？蓪⒃撍悸愤w移至藥品及生物制品領(lǐng)域的蔗糖含量測(cè)定，以滿足更高的靈敏度需求。

GEORGELIS N 等[22]采用ESI 負(fù)離子模式下的選擇離子監(jiān)測(cè)（selected ion monitoring，SIM），可同時(shí)快速測(cè)定植物組織中葡萄糖、果糖和蔗糖。經(jīng)驗(yàn)證，該方法測(cè)定蔗糖的檢測(cè)限為0.05 ng，定量限為0.10 ng。MIAH MK 等[23]采用ESI 負(fù)離子模式下的多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）進(jìn)行三重四級(jí)桿質(zhì)譜分析，可用于測(cè)定腦、血漿和血液中穩(wěn)定同位素修飾的[13C12]蔗糖。結(jié)果表明，蔗糖在1.0～200.0 ng·mL-1的濃度范圍內(nèi)線性良好（r2≥0.99），方法定量限達(dá)到柱上注射0.5 pg。

質(zhì)譜檢測(cè)器在靈敏度和專屬性方面存在顯著優(yōu)勢(shì)，可以在不必實(shí)現(xiàn)色譜峰完全分離的情況下檢測(cè)待測(cè)物質(zhì)，大大縮短了分析時(shí)間，也降低了液相方法的開發(fā)難度。但在聯(lián)用質(zhì)譜檢測(cè)器時(shí)，需注意流動(dòng)相中不能存在鹽和表面活性劑等非揮發(fā)性的物質(zhì)。此外，質(zhì)譜檢測(cè)器使用和維護(hù)的成本較高，對(duì)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境也存在一定要求。

3.2 色譜柱

色譜柱是HPLC 分離過程的核心部件，決定著分離的效果和效率。由于蔗糖極性較高，若不經(jīng)過衍生，在C18柱等普通反相色譜柱上難以獲得較好的保留效果，故應(yīng)用較少。根據(jù)分離原理的不同，常用于蔗糖分析的色譜柱包括氨基柱、陰離子交換柱、分子排阻色譜柱、親水作用色譜柱等。

3.2.1 氨基柱 氨基柱全稱為氨丙基鍵合硅膠色譜柱，既可以用于正相，也可以用于反相，還可以作為弱陰離子交換柱應(yīng)用于離子交換色譜。在分析碳水化合物時(shí)，氨基柱采用的是親水的反相分離模式，可用于分離同時(shí)含有單糖、二糖、三糖等不同聚合度的混合糖分子的樣品。氨基柱的價(jià)格相對(duì)較低，但其鍵合相氨丙基易水解，尤其是在反相色譜條件下，所以使用過程中需注意保護(hù)。酸性或高比例水相條件會(huì)加速氨丙基水解，因此氨基柱應(yīng)盡量避免在酸性或者高水相的流動(dòng)相中使用，建議流動(dòng)相中水相比例不超過40%。當(dāng)樣品顯酸性時(shí)，可通過調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH 來提高氨基柱柱效和延長使用壽命。

3.2.2 陰離子交換柱 用于糖類離子色譜分析的陰離子交換柱也稱糖分析柱、糖柱，常見的有戴安CarboPac PA 系列和瑞士萬通的Metrosep Carb 系列。一般采用苯乙烯-二乙烯基苯共聚物為基質(zhì)，金屬離子對(duì)為官能團(tuán)，二者通過磺酸基鍵合形成填料。糖分析柱的分離原理是基于配體交換反應(yīng)，糖分子上每一個(gè)羥基都帶有一個(gè)非常弱的負(fù)電荷，而端基異構(gòu)碳上所帶的羥基可被去質(zhì)子化，從而帶上一個(gè)很強(qiáng)的負(fù)電荷。糖分子上的這些負(fù)電荷與樹脂表面上的金屬離子正電荷之間的相互作用使糖被保留，從而達(dá)到分離目的。

3.2.3 分子排阻色譜柱 分子排阻色譜柱的固定相采用多孔凝膠，也被稱為凝膠色譜柱、空間排阻色譜柱。其原理是根據(jù)凝膠孔隙大小與樣品分子尺寸之間的相對(duì)關(guān)系而對(duì)待測(cè)組分進(jìn)行分離，尤其適用于分離生物制品中的大分子與蔗糖。張理火等[24]建立分子排阻色譜法測(cè)定豬凝血酶中的蔗糖含量，以親水硅膠高效體積排阻色譜柱PL aquagel-OH 20（7.5 mm×30 cm，5 μm）進(jìn)行分離，采用示差折光檢測(cè)器測(cè)定蔗糖含量。豬凝血酶分子尺寸較大，較蔗糖早出峰，從而實(shí)現(xiàn)分離，專屬性較好。

3.2.4 親水作用色譜柱 親水作用色譜（hydrophilic-interaction chromatography，HILIC）柱類似于正相色譜柱的變體，填料為極性固定相，采用高有機(jī)相的含水流動(dòng)相體系，有機(jī)相比例約占60%～95%。HILIC 在分析極性和親水性物質(zhì)方面具有極大的優(yōu)勢(shì)[25]。孫亞靈等[16]比較了3 種HILIC 色譜柱，最終選擇分離效果最佳的Waters XBridge Amide（4.6 mm×250 mm，3.5 μm）酰胺鍵合的雜化硅膠色譜柱測(cè)定蔗糖及其有關(guān)物質(zhì)的含量，解決了硅膠氨基柱存在的柱流失嚴(yán)重、方法不耐用等缺點(diǎn)。

總的來說，與經(jīng)典化學(xué)方法和旋光法相比，HPLC 具有較好的專屬性、準(zhǔn)確度和靈敏度，也提升了檢驗(yàn)的便捷性。HPLC 可以適配多種檢測(cè)器，以滿足不同的靈敏度需求。同時(shí)，通過選擇不同的色譜柱或調(diào)節(jié)流動(dòng)相的組成、pH 值、溫度、流速等條件，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)不同化合物的選擇性分離，因而能夠有效排除樣品中其他化合物對(duì)蔗糖測(cè)定的干擾。因此，目前HPLC 在蔗糖含量測(cè)定領(lǐng)域中的應(yīng)用最為廣泛。

4 氣相色譜法

由于蔗糖極性較大，沸點(diǎn)高達(dá)697.1℃，因此不適宜直接采用氣相色譜法（gas chromatography，GC）分析，可通過衍生反應(yīng)取代蔗糖的極性基團(tuán)羥基以增加其揮發(fā)性，從而實(shí)現(xiàn)氣相色譜法檢測(cè)。用于碳水化合物衍生的試劑主要包括甲醚、乙酸鹽、三氟乙酸酯和硅醚化試劑等。其中，三甲基硅醚衍生產(chǎn)物具有良好的揮發(fā)性和穩(wěn)定性，非常適用于氣相色譜法分析，因而應(yīng)用最廣[26]。衍生反應(yīng)完成后，可根據(jù)待測(cè)樣品中的蔗糖含量選用氫火焰離子化檢測(cè)器（flame ionization detector，F(xiàn)ID）或質(zhì)譜檢測(cè)器，以滿足不同的靈敏度要求。FID 的電信號(hào)來源于有機(jī)物在氫火焰中燃燒產(chǎn)生的離子流，該信號(hào)與有機(jī)物的量成正比。目前藥品和生物制品領(lǐng)域較少采用氣相色譜法測(cè)定蔗糖含量，下文列舉本方法在煙草、植物中的部分應(yīng)用，可為藥品和生物制品中的蔗糖含量測(cè)定提供一定參考。

張峻松等[27]建立了以三甲基氯硅烷為衍生化試劑，利用GC-FID 法定量分析煙草中葡萄糖、果糖和蔗糖含量的方法。該方法線性、重復(fù)性、加標(biāo)回收率均良好。但相較而言，質(zhì)譜檢測(cè)器的靈敏度更高。GOMEZ-GONZALEZ S 等[28]建立GC-MS/MS 法對(duì)橄欖果實(shí)、葉和莖中的糖進(jìn)行了定性定量分析。通過超聲輔助將待測(cè)組分提取至二氯甲烷-甲醇（2∶1）后，利用N，O-雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺和三甲基氯硅烷進(jìn)行衍生，最后采用質(zhì)譜Full Scan模式測(cè)定。本研究用該方法測(cè)定了50 種糖類組分，其中蔗糖的檢測(cè)限為0.015 μg·mL-1，定量限為0.050 μg·mL-1。

氣相色譜法測(cè)定糖類的主要優(yōu)點(diǎn)是能在相對(duì)短的分析時(shí)間內(nèi)獲得良好的分離度，適用于多種糖類組分的分離和基質(zhì)復(fù)雜的樣品。但該方法通常需要經(jīng)過衍生化反應(yīng)，不僅耗時(shí)較長，而且衍生化的復(fù)雜操作也可能影響測(cè)定的準(zhǔn)確度。

5 近紅外光譜法

近紅外光（near infrared，NIR）是介于可見光和中紅外光間的電磁波，波長通常介于780～2526nm范圍內(nèi)。由于物質(zhì)的含量與近紅外區(qū)內(nèi)多個(gè)不同的波長點(diǎn)吸收峰呈線性關(guān)系，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)的多元校正技術(shù)，可利用待測(cè)組分結(jié)構(gòu)中含氫基團(tuán)X-H（X=C、N、O）振動(dòng)的合頻和倍頻吸收信息，對(duì)待測(cè)組分進(jìn)行定性和定量分析。蔗糖結(jié)構(gòu)中含有在近紅外區(qū)域具有特征吸收的含氫基團(tuán)，因此可利用近紅外光譜法快速定量分析。近紅外光譜法測(cè)定物質(zhì)含量的過程一般包括以下步驟：首先收集足夠數(shù)量的樣品，分為校正集和驗(yàn)證集兩組，采用可靠的分析方法獲得所有樣品的待測(cè)組分含量數(shù)據(jù)；接著采集校正集樣品的圖譜，經(jīng)過圖譜預(yù)處理后，利用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法提取數(shù)據(jù)并建立預(yù)測(cè)模型；隨后通過該模型獲得驗(yàn)證集樣品的預(yù)測(cè)值，與實(shí)測(cè)值比較，確定模型可行；最后進(jìn)行樣品分析。

郝遠(yuǎn)等[29]采用近紅外光譜法結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)快速測(cè)定葉酸片中輔料蔗糖的含量。剔除異常樣本后，選擇樣品化學(xué)信息隨濃度變化顯著的5901～5862 cm-1和8327～8284 cm-1為建模區(qū)間建立偏最小二乘模型，隨后利用該模型預(yù)測(cè)5 個(gè)未知樣品，預(yù)測(cè)值和參考值誤差均小于5%，證明利用近紅外光譜定量測(cè)定葉酸片中蔗糖含量的方法可行。值得注意的是，選擇具有代表性的樣本是建模成功的前提和關(guān)鍵，因此用偏最小二乘法建立定量模型前，必須選擇合適的校正集和驗(yàn)證集。目前常用的樣品集劃分方法有Ranksel 法、SPXY 法、Kennard-Stone法、Randsel 法、Duplex 法等。

近紅外光譜法具有快速、準(zhǔn)確、高效、廉價(jià)等優(yōu)點(diǎn)[30]，且無破壞性，屬于無損檢測(cè)技術(shù)，可用于樣品快速分析和原位在線分析，特別適用于含蔗糖藥品及生物制品的生產(chǎn)控制和快速檢驗(yàn)。但本方法前期需要收集大量樣品用以建立和驗(yàn)證模型，且檢測(cè)準(zhǔn)確度受建模所用樣品的數(shù)量及代表性影響較大。

6 毛細(xì)管電泳法

毛細(xì)管電泳（capillary electrophoresis，CE）是一種由經(jīng)典電泳技術(shù)和現(xiàn)代微柱分離相結(jié)合的分析方法。其基本原理是以高壓電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，以毛細(xì)管為分離通道，根據(jù)樣品中各組分在和分配行為上的差異而實(shí)現(xiàn)分離。CE 有多種分離模式，其中毛細(xì)管區(qū)帶電泳法最為基礎(chǔ)，也是糖類分析中應(yīng)用最廣泛的一種模式。由于蔗糖結(jié)構(gòu)本身不含有共軛基團(tuán)，因此無法直接采用紫外檢測(cè)，目前常用的分析方法包括將毛細(xì)管電泳聯(lián)用安培檢測(cè)器、質(zhì)譜檢測(cè)器等，或采用間接紫外檢測(cè)法。因安培檢測(cè)器和質(zhì)譜檢測(cè)器前文均有提及，故此處主要介紹紫外間接檢測(cè)法。

蔗糖本身不帶電荷，在電泳條件下不具備遷移能力，但可利用強(qiáng)堿性緩沖液（pH ＞11）或硼酸鹽緩沖液使蔗糖解離[31]，使其能夠在電泳條件下向陽極遷移。同時(shí)由于蔗糖無法用紫外直接定量，可將蔗糖置換為具有強(qiáng)紫外吸收的背景電解質(zhì)溶液從而獲得負(fù)峰，常見的背景電解質(zhì)如2，6-吡啶二羧酸、2，6-二甲基苯酚[32]等。通常需要在背景電解質(zhì)溶液中加入十六烷基三甲基溴化銨，使電滲流方向向陽極反轉(zhuǎn)，縮短分析時(shí)間。吳克等[33]建立了毛細(xì)管電泳-紫外間接檢測(cè)法，用于定量測(cè)定四價(jià)輪狀病毒減毒活疫苗原液中的蔗糖含量。背景電解質(zhì)為含0.3 mmol·L-1CTAB 的60 mmol·L-1PDC 溶液，分離電壓為-12×103V，壓力進(jìn)樣50 mbar×6 s，柱溫25℃，檢測(cè)波長和參比波長分別為350 nm 和275 nm。該方法專屬性良好（圖5），蔗糖的遷移時(shí)間約為18.0 min，在2.0～10.0 mg·mL-1范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線r=0.999 9，檢測(cè)限為0.2 mg·mL-1，定量限為1.0 mg·mL-1。

圖5 CE 法測(cè)定四價(jià)輪狀病毒減毒活疫苗原液中蔗糖含量的典型色譜圖[33]

毛細(xì)管電泳法采用毛細(xì)管作為分離載體，相較高效液相色譜柱而言分離效能更高，且成本低廉，可以在發(fā)生吸附污染后舍棄，尤其適用于分析病毒原液等成分復(fù)雜、易污染色譜柱的樣品。

7 小 結(jié)

本文對(duì)目前在藥品及生物制品領(lǐng)域常用的各種蔗糖含量測(cè)定方法進(jìn)行了歸納。綜上所述，當(dāng)待測(cè)樣品中蔗糖含量相對(duì)較高，且不存在其他干擾物質(zhì)時(shí)，可采用基于氧化還原反應(yīng)的經(jīng)典化學(xué)方法或旋光法測(cè)定。當(dāng)待測(cè)樣品中蔗糖含量相對(duì)較低或存在其他干擾物質(zhì)時(shí)，可采用HPLC 法、GC 法或CE法，通過選用恰當(dāng)?shù)纳V柱和檢測(cè)器以達(dá)到檢測(cè)目的。其中，HPLC 法應(yīng)用最為廣泛，各類常用的檢測(cè)器按照靈敏度由低到高排序一般為：示差折光檢測(cè)器、蒸發(fā)光散射檢測(cè)器、電噴霧檢測(cè)器、離子色譜-脈沖安培檢測(cè)器、質(zhì)譜檢測(cè)器，其中質(zhì)譜檢測(cè)器可以達(dá)到10-12級(jí)靈敏度；GC 法通常需要柱前衍生化，操作相對(duì)較為繁瑣；CE 法適用于分析成分復(fù)雜、易污染色譜柱的生物制品。此外，針對(duì)大批量樣品中蔗糖的快速定量分析需求，可考慮采用近紅外光譜法結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)，通過建立適當(dāng)模型來預(yù)測(cè)未知樣品中的蔗糖含量。