王 蓉 邢連翔 黃克亮 李 欣
(1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院黃浦分院檢驗(yàn)科,上海 200011;2.上海市臨床檢驗(yàn)中心,上海 200016)
世界癌癥研究基金會(huì)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,乳腺癌是全球女性癌癥相關(guān)死亡的第二大原因,全球每年有超過45萬例與乳腺癌相關(guān)的死亡病例[1]。盡管臨床目前已廣泛采用根治性手術(shù)和輔助化療對乳腺癌進(jìn)行治療,但遠(yuǎn)隔轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)仍是乳腺癌預(yù)后不良的主要原因[3]。因此,了解乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的病理機(jī)制,并確定具體靶點(diǎn),有助于準(zhǔn)確診斷乳腺癌,并提供有效的治療策略。
微小RNA(microRNA,miRNA)參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展,作為腫瘤抑制因子或癌基因發(fā)揮作用,miRNA的異常表達(dá)已在許多不同類型的惡性腫瘤中得到證實(shí),且與腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)[3]。有研究結(jié)果表明,乳腺癌組織中miR-374表達(dá)顯著升高,可作為乳腺癌的診斷標(biāo)志物[4]。miR-374是否通過介導(dǎo)靶基因發(fā)揮作用尚不清楚。三基序蛋白35(tripartite motifcontaining protein 35,TRIM35;又稱MAIR或Hls5)是包含三聯(lián)基序的單蛋白E3連接酶家族成員,具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的活性[5]。此外,TRIM35已被確認(rèn)為一種腫瘤抑制因子,可抑制各種惡性腫瘤(如肝細(xì)胞肝癌)細(xì)胞的增殖、克隆形成和致瘤性[6]。目前,關(guān)于miR-374功能的潛在機(jī)制尚不明確,本研究團(tuán)隊(duì)前期通過生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)miR-374可能的靶點(diǎn)為TRIM37,但miR-374是否通過靶向TRIM35發(fā)揮作用尚不清楚。本研究擬通過檢測乳腺癌組織中miR-374和TRIM35的表達(dá),并探討miR-374對MCF-7細(xì)胞增殖和侵襲的影響,分析miR-374與TRIM35之間的關(guān)系,及其在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。
選取2020年1月—2021年12月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院黃浦分院確診的乳腺癌患者42例,年齡45~66歲。所有患者均符合中國抗癌協(xié)會(huì)乳腺癌專業(yè)委員會(huì)發(fā)布的《中國抗癌協(xié)會(huì)乳腺癌診治指南與規(guī)范(2021年版)》[7],術(shù)前未接受抗腫瘤治療,無其他惡性腫瘤病史。收集術(shù)中切除的乳腺癌組織和距腫瘤切緣2 cm以上的癌旁組織(經(jīng)病理檢查確認(rèn))。收集所有患者的臨床資料。本研究經(jīng)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院黃浦分院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2019-001號),所有患者均自愿參加本研究并簽署書面知情同意書。
將乳腺癌細(xì)胞系MCF-7(中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏中心細(xì)胞庫)置于含10%胎牛血清(fetal bovine serum,F(xiàn)BS)和1%青霉素-鏈霉素(美國Sigma-Aldrich公司)的RPMI-1640培養(yǎng)基中,在37 ℃ 5%CO2條件下培養(yǎng)。于細(xì)胞匯合度為80%~90%時(shí)傳代,取對數(shù)生長期的細(xì)胞,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
將MCF-7細(xì)胞根據(jù)不同處理方法分為3組:對照組(未作任何處理)、干擾組(加入100 nmol/L miR-374抑制劑10 μL,與細(xì)胞共孵育48 h)和空載體組(加入100 nmol/L隨機(jī)序列10 μL,與細(xì)胞共孵育48 h)。miR-374抑制劑和隨機(jī)序列均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。
將各組細(xì)胞以1×105個(gè)/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板中,分別培養(yǎng)24、48、72 h。采用MTT試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)測定細(xì)胞的增殖情況,嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行操作。簡要步驟:將10 μL MTT試劑(5 mg/mL)添加到每個(gè)孔中,37 ℃溫育4 h,棄去培養(yǎng)基,加入150 μL二甲基亞砜,在振動(dòng)器上震動(dòng)10 min,然后采用DNM-9602酶標(biāo)儀(北京普朗新技術(shù)有限公司)測量490 nm處的吸光度(A)值。
采用TRIzol試劑(美國ThermoFisher Scientific公司)從各組細(xì)胞或癌組織、癌旁組織中提取總RNA,嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行操作。將RNA用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶[天根生化科技(北京)有限公司]逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用SYBR Premix ExTaq試劑盒(日本TaKaRa公司)在ABI 7300實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)上進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增。miR-374和TRIM35引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成,引物序列見表1。反應(yīng)條件:94 ℃3 min;94 ℃ 30 s,62 ℃ 30 s,74 ℃ 30 s,36個(gè)循環(huán);74 ℃延長3 min。TRIM35的內(nèi)參為GAPDH,miR-374的內(nèi)參為U6。采用2-ΔΔCt計(jì)算miR-374和TRIM35的相對表達(dá)量。
表1 引物序列
通過Targetscan7.2在線數(shù)據(jù)庫(http://www.targetscan.org/vert_72/)確認(rèn)TRIM35的3'-非編碼區(qū)(untranslated region,UTR),包含預(yù)測的miR-374特異性結(jié)合位點(diǎn),采用PCR從基因組DNA中擴(kuò)增TRIM35的3'-UTR基因片段。反應(yīng)條件:95 ℃ 3 min;95 ℃ 20 s,60 ℃30 s,72 ℃ 30 s,45個(gè)循環(huán)。正向引物序列為5'-CATCGCCAAGCACAATCAGG-3',反向引物序列為5'-GCGTTTTCGGCTCTTGTGTT-3'。將擴(kuò)增出的基因片段插入到pMIR-REPORT熒光素酶報(bào)告載體中,獲得野生型熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒p-TRIM35-wt,將其與pGL3-對照質(zhì)粒的螢火蟲熒光素酶基因融合,限制性內(nèi)切酶為KpnⅠ和XhoⅠ。使用快速定點(diǎn)突變試劑盒(美國New England Biolabs公司)將2個(gè)位點(diǎn)突變(3'-UTR-965A/G和3'-UTR-969T/C)引入WT-TRIM35-3'-UTR,構(gòu)建突變體(MUT)TRIM35-3'-UTR。將TRIM35報(bào)告基因質(zhì)粒野生型(p-TRIM35-wt)或突變型(p-TRIM35-mut)分別與miR-374共轉(zhuǎn)染人胚胎腎細(xì)胞系HEK-293T(中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心),miR-NC采用隨機(jī)序列作為miRNA陰性對照。細(xì)胞在含10% FBS(以色列Biological Industries公司)的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(Dulbecco's modified Eagle medium,DMEM)(美國ThermoFisher Scientific公司)中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染24 h后,采用雙熒光素酶報(bào)告分析系統(tǒng)(美國Promega公司)測定熒光素酶活性。
試驗(yàn)前48 h將MCF-7細(xì)胞接種到10 cm培養(yǎng)皿中,每個(gè)端口2×105個(gè)細(xì)胞。試驗(yàn)前16 h更換無血清培養(yǎng)基。將Matrigel添加到Transwell小室(美國Corning公司)的上室。將3.5×104個(gè)細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞小室中,在Transwell小室的下室中加入0.8 mL含10%血清的培養(yǎng)基。常規(guī)培養(yǎng)24 h后,用75%乙醇固定,1.2%結(jié)晶紫染色。在ECLIPSE Ci光學(xué)顯微鏡(日本尼康公司)(×100)下隨機(jī)選取3個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。
采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。呈正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示,2個(gè)組之間比較采用t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用Tukey法。計(jì)數(shù)資料以例或率表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Pearson相關(guān)分析評估m(xù)iR-374與TRIM35的相關(guān)性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
癌組織miR-374相對表達(dá)量(7.21±1.14)顯著高于癌旁組織(3.83±0.81)(P<0.001),TRIM35相對表達(dá)量(9.23±1.26)顯著低于癌旁組織(9.98±0.92)(P<0.001)。Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示,miR-374與TRIM35呈負(fù)相關(guān)(r=-0.114,P<0.01)。見圖1。
圖1 癌組織和癌旁組織miR-374、TRIM35相對表達(dá)量比較和兩者之間的相關(guān)性
不同腫瘤大小和有無淋巴轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)隔轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者之間miR-374相對表達(dá)量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。不同年齡和TNM分期的乳腺癌患者之間miR-374相對表達(dá)量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。
表2 不同臨床病理特征乳腺癌患者miR-374相對表達(dá)量比較
干擾組miR-374相對表達(dá)量為0.41±0.05,顯著低于對照組(0.82±0.04)和空載體組(0.81±0.07)(P<0.001)。見圖2。
圖2 干擾組、對照組和空載體組miR-374相對表達(dá)量比較
干擾組培養(yǎng)48、72 h后的MCF-7細(xì)胞增殖率顯著低于空載體組或?qū)φ战M(P<0.001)。見圖3。
圖3 miR-374干擾對MCF-7細(xì)胞增殖的影響
干擾組侵襲細(xì)胞數(shù)顯著低于空載體組和對照組(P<0.001)。見圖4。
圖4 miR-374干擾對MCF-7細(xì)胞侵襲性的影響(×100)
干擾組TRIM35相對表達(dá)量為1.58±0.21,顯著高于空載體組(1.14±0.06)和對照組(1.06±0.03)(P<0.001)。見圖5。
圖5 miR-374干擾對TRIM35相對表達(dá)量的影響
熒光素酶報(bào)告基因檢測結(jié)果顯示,HEK-293T細(xì)胞共轉(zhuǎn)染miR-374和p-TRIM35-wt時(shí),熒光素酶活性被顯著抑制(P<0.001);共轉(zhuǎn)染miR-374和p-TRIM35-mut時(shí),熒光素酶活性未被抑制(P>0.05)。見圖6。
圖6 miR-374對TRIM35轉(zhuǎn)錄調(diào)控的影響
乳腺癌是全球癌癥死亡的第五大原因[8]。盡管隨著手術(shù)、放療、化療、內(nèi)分泌治療、靶向治療等技術(shù)的發(fā)展,乳腺癌患者的死亡率有所下降,但全身治療預(yù)防轉(zhuǎn)移的效果較差[9],腫瘤轉(zhuǎn)移仍是大多數(shù)乳腺癌患者死亡的根本原因[10]。
miRNA是小的單鏈非編碼RNA(18~22個(gè)核苷酸),通過識(shí)別特定靶mRNA導(dǎo)致其靶向降解或翻譯抑制,在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)。miRNA與乳腺癌的進(jìn)展密切相關(guān)[4,11],在診斷和治療中表現(xiàn)出顯著的潛力[12-13]。ZHANG等[14]的研究結(jié)果顯示,乳腺癌患者miR-26b-5p、miR-106b-5p、miR-142-3p、miR-142-5p、miR-185-5p和miR-362-5p表達(dá)上調(diào),可作為乳腺癌診斷和預(yù)后評估的潛在生物標(biāo)志物。miR-374家族成員(包括miR-374a、miR-374b和miR-374c)作為lncRNA FTX的剪接片段,位于人類染色體 Xq13.2的X失活中心[15]。HE等[16]的研究結(jié)果顯示,前列腺癌組織中miR-374表達(dá)降低,可作為前列腺癌無生化復(fù)發(fā)生存的獨(dú)立預(yù)測因子。RAHIMI等[17]的研究結(jié)果顯示,慢性淋巴細(xì)胞白血病患者miRNA-32、miRNA-98和miR-374異常表達(dá)。GAO等[18]的研究發(fā)現(xiàn),miR-374通過靶向GATA3抑制SEMA3B表達(dá),可促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤進(jìn)展。本研究結(jié)果顯示,乳腺癌組織miR-374相對表達(dá)量顯著升高,抑制miR-374表達(dá)可導(dǎo)致MCF-7細(xì)胞的增殖率顯著降低,提示miR-374可能具有致癌基因的作用。
TRIM蛋白家族是E3泛素連接酶RING結(jié)構(gòu)域家族的成員,由1個(gè)RING指結(jié)構(gòu)域、2個(gè)B-box結(jié)構(gòu)域和1個(gè)C-末端結(jié)構(gòu)域組成,充當(dāng)E3泛素連接酶,參與細(xì)胞的各種生理過程[19]。TRIM35是TRIM家族的一員,在腫瘤的惡性進(jìn)展中具有重要作用[20]。TRIM35低表達(dá)可促進(jìn)肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞的惡性增殖[21],而增加TRIM35的表達(dá)可顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲[22]。有研究結(jié)果顯示,TRIM35表達(dá)升高可抑制乳腺癌細(xì)胞的生長、克隆形成和致瘤性,提示TRIM35具有抗腫瘤能力[23]。TRIM35可通過增加丙酮酸脫氫酶激酶1的泛素化使蛋白激酶B(protein kinase B,PKB;又稱Akt)信號失活,從而抑制乳腺癌細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡[12]。WU等[24]的研究結(jié)果顯示,TRIM35通過泛素化調(diào)節(jié)丙酮酸激酶M1/2蛋白四聚體和二聚體的轉(zhuǎn)變,并通過調(diào)節(jié) Warburg效應(yīng),影響乳腺癌的惡性生物學(xué)行為。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示,TRIM35是miR-374的潛在直接靶標(biāo),miR-374或可直接負(fù)向調(diào)節(jié)TRIM35 mRNA的表達(dá)。為了證實(shí)這一假設(shè),本研究采用miR-374抑制劑轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞,結(jié)果顯示,抑制miR-374可誘導(dǎo)TRIM35表達(dá)增強(qiáng),表明miR-374可反向調(diào)節(jié)TRIM35表達(dá);雙熒光素酶報(bào)告基因檢測結(jié)果證實(shí)miR-374可與TRIM35的3'-UTR直接結(jié)合。由此可見,miR-374可通過靶向TRIM35來增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞的增殖活性和侵襲能力。
綜上所述,miR-374可促進(jìn)MCF-7細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移,并通過直接結(jié)合其mRNA轉(zhuǎn)錄本負(fù)調(diào)控TRIM35的表達(dá),提示miR-374可能在乳腺癌的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。