丁榮榮，史應(yīng)武，劉志中，王國平，王海娟

（1.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第七師農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，新疆維吾爾自治區(qū) 奎屯 833200；2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所，新疆維吾爾自治區(qū) 烏魯木齊 830091）

2021 年我國棉花種植面積302.81×104hm2，棉花總產(chǎn)量573.1×104t，新疆地區(qū)棉花種植面積為250.61×104hm2，產(chǎn)量為512.9×104t，占全國棉花總產(chǎn)量的89.50%[1]。黃萎?。╒erticillium dahliaKleb.）已成為新疆棉花生產(chǎn)中最重要的病害之一，嚴(yán)重阻礙新疆棉花產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[2]。棉花黃萎病屬土傳性病害，缺乏有效的藥劑防治，在植物根際（根表面、根內(nèi)部、根際土壤）生活著大量微生物，包括藻類和原生動(dòng)物、細(xì)菌、放線菌、真菌等，它們參與植物生長全過程，推動(dòng)土壤生態(tài)系統(tǒng)中的物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)，參與土壤中N、P、C、S 等元素的循環(huán)和有機(jī)質(zhì)的分解，可作為土壤肥力的指標(biāo)之一。不同植物有特定的根際微生物群落，定殖在植物的根際，與植物相互作用，直接或間接地影響植物的生長發(fā)育。因此，根際微生物群落構(gòu)成了植物的第二基因組。

植物根際促生菌（plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）是一類生活在土壤或附生于植物根系，促進(jìn)植物營養(yǎng)吸收與生長，并能夠抑制有害生物的有益微生物。PGPR 是微生物肥料重要的種質(zhì)資源，在綠色有機(jī)食品生產(chǎn)、生態(tài)保護(hù)以及農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展中都發(fā)揮著重要作用。根際促生菌的種類及其功能較多，其主要種類包括芽孢桿菌屬（Bacillus）和假單胞菌屬（Pseudomonas）等能合成生長素、赤霉素等，促進(jìn)植物細(xì)胞生長、分裂分化、調(diào)節(jié)生根等，對(duì)植物生長發(fā)育有直接作用功能的物質(zhì)，還可以改變土壤中磷、鉀等元素的形態(tài)，使之有效化且利于植物吸收。研究還發(fā)現(xiàn)接種特定菌株于植物并種植，能產(chǎn)生吲哚乙酸（IAA）并含鐵細(xì)胞等物質(zhì)，植物的葉片數(shù)、根鮮質(zhì)量、莖鮮質(zhì)量、根干質(zhì)量、莖干質(zhì)量、根長、總生物量均有不同程度的增加。根際促生菌（PGPR）能夠幫助植物獲得營養(yǎng)物質(zhì)、調(diào)節(jié)激素水平并抵抗病原微生物侵襲。近年來，關(guān)于微生物肥料的研究我國呈現(xiàn)出增長趨勢(shì)，但是北方土壤中根際促生菌（PGPR）的研究較少。在環(huán)境污染日趨嚴(yán)重、生物多樣性受到嚴(yán)峻威脅、眾多科學(xué)家致力于發(fā)展生態(tài)農(nóng)業(yè)的今天，棉花根際微生物與內(nèi)生菌對(duì)棉花病害和產(chǎn)量的促進(jìn)增產(chǎn)突顯重要意義。

1 WJP-7搖瓶工藝研究

選用項(xiàng)目前期從新疆棉田分離出的一株高效無機(jī)磷分解菌Pseudomonas taiwanensis WJP-7，本試驗(yàn)擬通過正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)探究菌株WJP-7培養(yǎng)基對(duì)發(fā)酵效果的影響，挖掘臺(tái)灣假單胞菌WJP-7的施用價(jià)值。

1.1 材料

1.1.1 供試菌種

WJP-7（Pseudomonas taiwanensis）從新疆棉田自行篩選的菌劑。

1.1.2 供試培養(yǎng)基

初始種子培養(yǎng)基：蛋白胨5 g/L、氯化鎂5 g/L、硫酸鉀0.75 g/L，pH值自然，121℃，20 min。

1.1.3 試驗(yàn)試劑

試驗(yàn)試劑及其生產(chǎn)廠家見表1。

表1 試驗(yàn)試劑情況Tab.1 Test reagent status

1.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器

超速離心機(jī)（Eppendorf 5417R）、恒溫水浴鍋（CS501-SP）、微波爐（HR-7751MS）、高壓蒸汽滅菌鍋（MLS-3020）、超凈工作臺(tái)（BHC-1300A/B3）、恒溫培養(yǎng)箱（LRH-150-G，LRH-250A）、恒溫?fù)u床（ZHW211B）、pH 儀(pB-10)、精密電子天平（BS210S，BS4000S）、分光光度計(jì)（752N）、生化培養(yǎng)箱（LRH-250A）、移液器（eppendorf）等儀器設(shè)備由新疆農(nóng)科院微生物應(yīng)用研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 菌種的活化

將斜面保藏菌種在活化培養(yǎng)基斜面上劃線后，于35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，連續(xù)活化3代。

1.2.2 菌株種子培養(yǎng)液的制備

用接種環(huán)挑取完全培養(yǎng)基上的菌體與5 mL 無菌水制成菌懸液，接種于裝有50 mL 種子培養(yǎng)基的250 mL 三角瓶中，置于35℃、180 r/min 的往復(fù)式搖床振蕩培養(yǎng)，使其達(dá)到對(duì)數(shù)生長期。

1.2.3 菌株增菌培養(yǎng)液的制備

將培養(yǎng)好的種子液以1%的接種量轉(zhuǎn)入裝有50 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，于35℃、180 r/min培養(yǎng)36 h。

以蛋白胨、氯化鎂、硫酸鉀為單因素，采用三因素三水平L9（33）的正交試驗(yàn)方法，對(duì)其培養(yǎng)基的重要組分進(jìn)行考察，分析硫酸鉀、氯化鎂、蛋白胨對(duì)菌株生長的影響。三因素水平見表2，三因素三水平正交見表3。

表2 三因素水平表Tab.21 Three factor level table

表3 三因素三水平正交表Tab.3 Three-factor and three-level orthogonal table

1.2.4 菌體生長測(cè)定

取1 mL 增菌培養(yǎng)液，搖勻，用UV-2550 型分光光度計(jì)，1 cm光程600 nm測(cè)定OD值。

1.3 結(jié)果

微生物的一切生命活動(dòng)都離不開其生長的環(huán)境。微生物從培養(yǎng)基中吸取各種營養(yǎng)物質(zhì)，用于合成細(xì)胞物質(zhì)、維持新陳代謝和產(chǎn)生代謝產(chǎn)物。增菌培養(yǎng)的目的是為了使菌體大量擴(kuò)增，以獲得足夠數(shù)目、生長活力強(qiáng)的菌體。

在這3 種因素中，顯著性結(jié)果為：蛋白胨>氯化鎂>硫酸鉀，其中蛋白胨高度顯著。經(jīng)試驗(yàn)后確定各因素的最優(yōu)水平為A3B3C2，硫酸鉀、蛋白胨、氯化鎂的用量對(duì)應(yīng)分別為1.4 g/L、20 g/L、15 g/L。也就是說A3B3C2 即為培養(yǎng)WJP-7 菌株的最佳培養(yǎng)基配方。優(yōu)化后活菌數(shù)可達(dá)3.6×109CFU。

1.4 大田試驗(yàn)

1.4.1 試驗(yàn)地概況

2021 年4 月—9 月在奎屯墾區(qū)胡楊河市130 團(tuán)8 連的試驗(yàn)地開展。試驗(yàn)地面積約9 hm2。4 月28 日播種，種植不抗病的新陸早16號(hào)，檢驗(yàn)菌肥的效果。試驗(yàn)區(qū)田間管理等與對(duì)照相同。4 月28 日播種，4 月29 日滴出苗水。全生育期澆水10 次，6 月6 日滴頭水，每隔7~10 d 滴1 次水。其他栽培管理同大田生產(chǎn)相同。

1.4.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用小區(qū)試驗(yàn)隨機(jī)排列，共設(shè)3個(gè)處理，處理1（T1）：滴施35×108CFU/mL WJP7 水劑5.0 kg/667 m2；處理2（T2）：滴施70×108CFU/mL 芽孢桿菌可濕性粉劑2.0 kg/667 m2；處理3（CK）：對(duì)照，滴施清水。每個(gè)處理面積1 hm2，重復(fù)3次。

1.4.3 調(diào)查項(xiàng)目及方法

采用五點(diǎn)取樣法，選擇試驗(yàn)小區(qū)具有代表性5 個(gè)取樣點(diǎn)，每個(gè)取樣點(diǎn)連續(xù)調(diào)查30 株棉花，在花期、吐絮期去調(diào)查棉花黃萎病發(fā)病株數(shù)。黃萎病病情分級(jí)參照國家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 22101.5-2009）中分級(jí)法，計(jì)算病株率和病情指數(shù)。棉花黃萎病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[3-6]：0級(jí)，健株；1級(jí)，病株葉片有25%以下葉片顯癥；2 級(jí)，病株葉片有25%~50%表現(xiàn)病狀；3 級(jí)，病株葉片有50%以上葉片顯癥；4 級(jí)，全株葉片發(fā)病，干枯脫落成光稈或急性萎蔫死亡。

病情指數(shù)=∑（級(jí)值×株數(shù)）/（最高級(jí)值×總株數(shù)）×100%；防治效果=（對(duì)照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/對(duì)照病情指數(shù)×100%。每個(gè)處理選擇有代表性的樣點(diǎn)5個(gè)，每點(diǎn)標(biāo)記棉株20株，測(cè)定棉花平均單鈴質(zhì)量，計(jì)算產(chǎn)量。

1.4.4 菌劑田間試驗(yàn)不同處理對(duì)棉花黃萎病的防治效果

不同處理黃萎病的病情指數(shù)分別是2.25、1.02 和4.83，其中施用70×108CFU/g 枯草芽胞桿菌可濕性粉劑處理的棉花，黃萎病病情指數(shù)最低，35×108CFU/mL WJP-7 水劑和70×108CFU/g 枯草芽胞桿菌可濕性粉劑處理對(duì)花期黃萎病防效分別為43.22%和72.21%，絮期防治效果分別為50.23%和60.12%。

2 發(fā)酵罐工藝研究

2.1 材料與方法

2.1.1 供試菌種

WJP-7（Pseudomonas taiwanensis）。

2.1.2 供試培養(yǎng)基

菌體發(fā)酵培養(yǎng)基采用已優(yōu)化的培養(yǎng)基。

2.1.3 主要試劑與設(shè)備

主要試劑見1.1.3；設(shè)備：10 L 自控發(fā)酵罐，德國貝朗，發(fā)酵液溶氧自動(dòng)指示，溫度自動(dòng)控制，pH值自動(dòng)控制。

2.1.4 菌體干質(zhì)量與OD600關(guān)系

將洗凈且烘干的離心管稱質(zhì)量，得離心管的空質(zhì)量為W0。取10 mL 不同吸光度值的發(fā)酵液置于離心管內(nèi)，于轉(zhuǎn)速10 000 r/min 離心15 min，棄去上清液，所得濕菌體用生理鹽水洗滌兩次。將離心收集到的菌體于80℃烘干至恒質(zhì)量，稱量后得菌體及離心管質(zhì)量，記為W1，兩者質(zhì)量之差（W1-W0）即為菌體干質(zhì)量。按此方法測(cè)定菌體干質(zhì)量，以吸光值OD600為橫坐標(biāo)，菌體干質(zhì)量為縱坐標(biāo)繪制吸光度與菌體干質(zhì)量間的關(guān)系曲線?；貧w方程為Y=15.808X-0.409 1，R2=0.9987，說明線性回歸比非常顯著，故可用OD600的大小表示菌體的生長情況。

圖1 吸光度與菌體干質(zhì)量間的關(guān)系Fig.1 The relationship between absorbance and dry mass of bacteria

2.1.5 培養(yǎng)條件

建立從搖瓶到10 L 發(fā)酵罐的二級(jí)發(fā)酵工藝。將搖瓶種子液按10%的接種量接入10 L 發(fā)酵罐中，裝液量6 L，pH 值為7.2，溫度為35℃，初始轉(zhuǎn)速400 r/min。

2.2 試驗(yàn)結(jié)果

本課題對(duì)WJP-7 在10 L 全自動(dòng)發(fā)酵罐發(fā)酵過程進(jìn)行了研究。分析了攪拌轉(zhuǎn)速和pH對(duì)菌體量的影響。

2.2.1 攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)WJP-7增菌發(fā)酵的影響

在發(fā)酵罐試驗(yàn)中通過保證通風(fēng)量和罐壓不變的情況下，分別在不同轉(zhuǎn)速條件下，觀察了菌體的生長、溶氧變化的影響。

通過對(duì)WJP-7在10 L全自動(dòng)發(fā)酵罐中300 r/min、500 r/min和700 r/min的不同轉(zhuǎn)速條件下分批發(fā)酵試驗(yàn)，得出WJP-7在10 L罐中WJP-7溶氧變化趨勢(shì)、菌體生長曲線。

不同轉(zhuǎn)速的發(fā)酵過程中，溶氧變化趨勢(shì)相似。發(fā)酵初期，屬于菌體生長階段，對(duì)氧需求量較大，溶氧下降較快，轉(zhuǎn)速越小，溶氧下降速率越快；發(fā)酵中期，溶氧只用來維持菌體正常生理需求，其保持相對(duì)穩(wěn)定；發(fā)酵后期，隨著營養(yǎng)物質(zhì)的耗盡，菌體開始逐漸死亡，耗氧量下降，溶氧回升。

在不同轉(zhuǎn)速條件下，菌體生長量都能達(dá)到一個(gè)相同的飽和值，但菌體的生長速度不一樣，且轉(zhuǎn)速為500 r/min時(shí)，菌體的生長速率最快，32 h 達(dá)到飽和值，而過高的轉(zhuǎn)速導(dǎo)致溶氧過高，反而對(duì)菌體生長相對(duì)緩慢，600 r/min 時(shí)達(dá)到飽和濃度的時(shí)間為34 h，轉(zhuǎn)速為400 r/min 時(shí)44 h 菌體生長達(dá)到飽和值。提高攪拌轉(zhuǎn)速能明顯提高細(xì)胞生長速度。

2.2.2 pH值對(duì)WJP-7增菌發(fā)酵的影響

根據(jù)搖瓶過程中pH 值的變化情況，在發(fā)酵過程中通過用濃氨水自動(dòng)調(diào)節(jié)pH 值分別為7.0、7.2、7.5。在發(fā)酵過程中pH 值對(duì)許多酶的催化過程和許多細(xì)胞之間的特性傳遞過程有很大的影響，pH 值的變化能改變體系的酶環(huán)境和營養(yǎng)物質(zhì)的代謝流，使得誘導(dǎo)物和生長因子在活性和非活性之間變化。結(jié)果表明，pH 值對(duì)菌體生長量的影響不大，pH 值分別為7.0、7.1、7.2 對(duì)應(yīng)細(xì)胞干質(zhì)量分別為13.28 g/L、13.69 g/L、12.91 g/L。因此，實(shí)驗(yàn)確定發(fā)酵過程中控制最適pH值為7.2。

3 結(jié)語

在搖瓶種子培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，對(duì)WJP-7進(jìn)行了10 L發(fā)酵罐工藝研究，確定10 L 種子罐最佳工藝參數(shù)為：裝液量為6 L，轉(zhuǎn)速500 r/min，pH 值為7.0~7.2，35℃，調(diào)整轉(zhuǎn)速使溶氧維持在30%以上，菌齡32 h。WJP-7 水劑2 種處理對(duì)棉花黃萎病防治效果分別為50.23%，60.12%，比對(duì)照清水防效顯著。