吳幗秀，徐有權(quán)，石 聰，李 陽，李嚴(yán)曼，崔丹丹，李勝利

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院 鄭州 450046；2.河南省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全和綠色食品發(fā)展中心 鄭州 450002）

種子引發(fā)（seed priming）又稱滲透調(diào)節(jié)，最早是由Heydecker 教授在1973 年提出的，通過控制供水條件，使種子慢慢吸收水分，并逐步恢復(fù)干燥的種子預(yù)處理技術(shù)[1]。目前常見的引發(fā)技術(shù)有滲透引發(fā)、固體基質(zhì)引發(fā)、水引發(fā)、膜引發(fā)和生物引發(fā)等[2]。其中固體基質(zhì)引發(fā)作為一項高效、簡易、低成本的引發(fā)技術(shù)，在生產(chǎn)上具有重要的意義，常用的基質(zhì)有蛭石、珍珠巖、沙等。方萍萍等[3]利用蛭石、珍珠巖、椰糠對老化的黃瓜種子進(jìn)行引發(fā)，發(fā)現(xiàn)蛭石和珍珠巖引發(fā)處理均可不同程度地提高老化種子的萌發(fā)率和萌發(fā)速度，而椰糠處理的種子萌發(fā)特性與對照差異不顯著。為了縮短胚根突破種皮的時間，不同作物的種子引發(fā)均需要適宜的溫度和時間，引發(fā)溫度和時間控制不當(dāng)會造成種子吸脹傷害[4]。經(jīng)過引發(fā)處理后的種子，能夠加快種子的發(fā)芽速率，促進(jìn)幼苗健壯生長，同時還能夠調(diào)節(jié)種子內(nèi)的水解酶、呼吸酶活性等，進(jìn)一步強(qiáng)化種子的發(fā)芽能力和幼苗的抗逆性[5-6]。Cao 等[7]采用褪黑素對糯玉米種子進(jìn)行引發(fā)處理，發(fā)現(xiàn)其可以通過調(diào)節(jié)抗氧化系統(tǒng)及淀粉代謝促進(jìn)低溫下的種子萌發(fā)，同時褪黑素對甜菜種子、黃瓜種子也具有一定的引發(fā)作用[8-9]。

番茄（Solanum lycopersicumL.）由于口感佳、營養(yǎng)價值豐富，深受人們的喜愛。作為主要的設(shè)施栽培作物之一，番茄已實現(xiàn)了周年生產(chǎn)供應(yīng)，因此造成重茬現(xiàn)象逐年增多，導(dǎo)致連作障礙嚴(yán)重，土壤退化，疫病、枯萎病等土傳病害和土壤栽培生理問題頻發(fā)。目前嫁接是克服連作障礙、提高植株抗病性、防止土傳病害的最有效措施[10]，但番茄砧木種子本身存在發(fā)芽率低、出苗不整齊等問題。因此，提高番茄砧木種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢對降低嫁接成本、提高生產(chǎn)效率具有重要意義。種子引發(fā)作為一種有效手段，通過滲透調(diào)節(jié)作用于種子內(nèi)部并發(fā)生各種生理和生化變化，從而修復(fù)和保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)免受破壞，使細(xì)胞維持其正常的生理活性，有效提升植物的抗逆性。但目前的引發(fā)技術(shù)較為雜亂，缺乏針對性，且影響引發(fā)的因素復(fù)雜多樣，因此，筆者旨在研究不同溫度下蛭石引發(fā)對砧木種子發(fā)芽、幼苗生長與耐冷性的影響，為番茄砧木開發(fā)低成本的引發(fā)介質(zhì)、探索最適的引發(fā)條件，從而達(dá)到促進(jìn)砧木種子萌發(fā)，提高嫁接苗抗逆性的效果。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于2020 年3－6 月在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院工廠化育苗實驗室完成。供試砧木品種為雜交種金棚砧木一號（JZM-1）番茄，根系發(fā)達(dá)，耐寒性強(qiáng)，由西安金鵬種苗有限公司培育與提供。固體基質(zhì)引發(fā)材料為蛭石，粒徑為0.4～1.0 mm，蛭石容重為0.23 g·cm-3，在試驗前對蛭石進(jìn)行充分干燥與消毒處理。

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 引發(fā)處理 引發(fā)基質(zhì)含水量及引發(fā)時間由預(yù)試驗確定。引發(fā)處理按照種子干質(zhì)量∶蛭石干質(zhì)量為1∶10 的比例，引發(fā)時調(diào)整基質(zhì)含水量為40%。將蛭石、水和種子均勻混合后放于培養(yǎng)皿中，然后隨機(jī)置于不同溫度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行引發(fā)試驗，溫度設(shè)置如表1 所示（恒溫處理包括5、10、15、20、25 ℃，變溫處理包括5 ℃/20 ℃、10 ℃/20 ℃、15 ℃/20 ℃，時間設(shè)定為12 h/12 h）。每天測定培養(yǎng)皿質(zhì)量，按照首次質(zhì)量確定加水量，保持蛭石含水量40%。引發(fā)9 d 后，將各處理的種子和固體基質(zhì)全部倒出，使用分樣篩將番茄砧木種子篩出。在室溫且通風(fēng)的環(huán)境條件下回干至種子原始含水量，即測定質(zhì)量為恒質(zhì)量時停止，將種子保存起來備用。

表1 蛭石引發(fā)溫度設(shè)置Table 1 Vermiculite priming temperature setting℃

1.2.2 發(fā)芽試驗 以未進(jìn)行引發(fā)處理、常溫保存的種子為對照（CK），將各處理的種子先用50～55 ℃熱水進(jìn)行溫湯浸種，然后在蒸餾水中浸泡8 h。浸種后取2 層濾紙平放在直徑為9 cm 的一次性塑料培養(yǎng)皿中，用水噴濕濾紙，將種子均勻置于濾紙上，在MGC-250 智能光照培養(yǎng)箱內(nèi)25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)，每天觀察種子的發(fā)芽個數(shù)（以胚芽突破種皮1 mm 作為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn))，按照《農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程》[11]的檢驗方法，在發(fā)芽試驗第2 天統(tǒng)計發(fā)芽勢，第7 天統(tǒng)計發(fā)芽率。每個處理3 次重復(fù)，每個重復(fù)100 粒番茄砧木種子。

1.2.3 幼苗耐冷性試驗 通過上一步試驗，篩選出T（10）、T（15）、T（25）和T（5/20）4 個處理和CK 進(jìn)行對比試驗。試驗使用72 孔育苗穴盤，每個處理育2 盤，3 次重復(fù)。當(dāng)3 葉1 心時，移入MGC-250型智能光照培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行低溫處理（晝/夜溫度為10 ℃/5 ℃，光周期為晝/夜=12 h/12 h）。

1.3 項目測定方法

1.3.1 種子發(fā)芽特性 發(fā)芽勢/%=2 d 內(nèi)發(fā)芽種子

1.3.2 幼苗生長量 當(dāng)幼苗3 葉1 心時，分別選取不同處理幼苗10 棵，3 次重復(fù)，用直尺測定株高，游標(biāo)卡尺測定莖粗，電子天平測定干鮮質(zhì)量，并計算壯苗指數(shù)[12]。

1.3.3 生理指標(biāo)測定 將3 葉1 心幼苗的根系洗凈擦干，剪成1 cm 的均勻小段并稱取0.2 g 至試管中，采用TTC 法測定根系活力[13]。參考Zhao 等[14]的方法在低溫處理1、3、5 d 時取樣測定幼苗冷害指數(shù)。在低溫0、5 d 時，取3 株幼苗的第2 片葉，參照趙世杰等[15]的方法進(jìn)行電解質(zhì)滲漏率（electrolyte leakage，EL）的測定和計算；參照王愛國等[16]的方法測定超氧陰離子O2·-含量。采用蒽酮比色法測定可溶性糖含量[13]；采用考馬斯亮藍(lán)染色法測定可溶性蛋白質(zhì)含量[14]。采用氮藍(lán)四唑（NBT）還原法測定超氧化物歧化酶（SOD）活性，以反應(yīng)被抑制50%時的酶液用量作為1 個酶活性單位[17]；采用愈創(chuàng)木酚法測定過氧化物酶（POD）活性[18]；采用紫外吸收法測定過氧化氫酶（CAT）活性[19]；參照Nakano[20]方法測定抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性，以1 min 內(nèi)290 nm 吸光度值的變化值表示酶活性。采用丙酮和乙醇1∶1（體積比）浸泡法提取葉綠素，用紫外分光光度計U-5100 測定葉綠素含量[21]。

1.3.4 隸屬函數(shù)值 利用模糊數(shù)學(xué)中隸屬函數(shù)的方法，計算參試材料耐冷性指標(biāo)的隸屬函數(shù)值，對各項指標(biāo)進(jìn)行間接的耐冷性評價，并累加比較不同品種的耐冷性[22]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 統(tǒng)計軟件進(jìn)行方差分析，采用LSD法進(jìn)行差異顯著性分析；采用Microsoft Office 2016作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同引發(fā)溫度對番茄砧木種子發(fā)芽特性的影響

由表2 可知，8 個引發(fā)處理的發(fā)芽指標(biāo)均顯著高于CK，其中在恒溫引發(fā)各處理中，T（15）處理發(fā)芽情況最好，發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)最高，發(fā)芽率僅低于T（10）處理，二者差異不顯著，發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)分別是CK 的1.62 倍和4.35 倍。在變溫引發(fā)各處理中，T（5/20）的發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)最高；T（10/20）處理的發(fā)芽率最高，是CK 的1.77 倍。

2.2 不同引發(fā)溫度對番茄砧木幼苗形態(tài)指標(biāo)的影響

在上一步試驗研究的基礎(chǔ)上，選T（10）、T（15）、T（25）和T（5/20）4 個處理，進(jìn)行后續(xù)研究。

由表3 可看出，不同溫度的種子引發(fā)對幼苗的生長量具有一定的影響。T（10）、T（15）、T（25）和T（5/20）的莖粗、地下部鮮質(zhì)量、壯苗指數(shù)均顯著高于CK；地上部鮮質(zhì)量除T（15）處理顯著高于CK 外，其他處理與CK 差異不顯著；T（15）處理的地上部及地下部鮮質(zhì)量均顯著高于其他處理，且比CK 分別高了48.36%和78.12%；T（5/20）處理的株高顯著低于CK 和其他處理，但壯苗指數(shù)顯著高于CK 和其他處理，是CK 的2.43 倍；其次為T（15）和T（25）處理，壯苗指數(shù)分別是CK 的2.14 倍和2.00 倍。

2.3 不同引發(fā)溫度對番茄砧木幼苗耐冷性的影響

2.3.1 不同引發(fā)溫度對低溫脅迫下番茄幼苗根系活力的影響 嫁接生產(chǎn)中主要保留的是砧木苗的根系與莖段部分，因此砧木根系活力與幼苗嫁接之后的植株生長情況密切相關(guān)。由圖1 可知，各處理的幼苗在低溫脅迫下根系活力均顯著高于CK，其中T（5/20）處理的根系活力最高，是CK 的5.19 倍，其次是T（10）處理，是CK 的4.97 倍，T（15）、T（25）處理的根系活力分別是CK 的4.13 倍和2.10 倍。

圖1 不同引發(fā)溫度對低溫脅迫下番茄砧木幼苗根系活力的影響Fig.1 Effects of different priming temperatures on root activity of tomato rootstock seedlings under chilling stress

2.3.2 不同引發(fā)溫度對低溫脅迫下番茄幼苗冷害指數(shù)的影響 冷害指數(shù)能夠從植物外部形態(tài)上直觀反映出植株受冷害程度。由表4 可以看出，隨著低溫脅迫時間的延長，各處理的冷害指數(shù)逐漸增大，說明受冷害程度加重。在低溫第1 天時，CK 就表現(xiàn)出一定的冷害癥狀，T（5/20）和T（25）處理的冷害癥狀極輕，T（10）和T（15）處理無任何癥狀。在低溫第3 天時，CK 受冷害程度顯著高于其他處理，T（5/20）和T（10）處理有輕微癥狀，T（15）處理無冷害癥狀。脅迫5 d 后，CK 的幼苗冷害程度最為嚴(yán)重，其次是T（25）處理，T（10）、T（15）和T（5/20）處理的幼苗耐冷性均較強(qiáng)，受害程度較輕，其中T（5/20）處理的冷害指數(shù)最小，顯著低于其他處理。

2.3.3 不同引發(fā)溫度對低溫脅迫下番茄幼苗電解質(zhì)滲漏率及超氧陰離子含量的影響 由圖2-A 可知，低溫脅迫后CK、T（15）和T（5/20）處理的電解質(zhì)滲漏率均呈現(xiàn)不同程度的升高，其中CK 較低溫前升高了29.76%，T（15）和T（5/20）處理分別升高23.21%和5.52%，而T（10）和T（25）2 個處理與低溫前相比，電解質(zhì)滲漏率分別下降13.55%和9.78%。低溫后各處理的電解質(zhì)滲漏率均顯著低于CK，在引發(fā)處理中，T（15）處理的電解質(zhì)滲漏率高于其他3個處理，與T（25）和T（5/20）處理呈顯著差異。

圖2 不同引發(fā)溫度對低溫脅迫下番茄砧木幼苗電解質(zhì)滲漏率及超氧陰離子含量的影響Fig.2 Effects of different priming temperatures on electrolyte leakage rate and superoxide anion content of tomato rootstock seedlings under chilling stress

從圖2-B 可看出，低溫前各處理的超氧陰離子含量均處于較低水平，且T（10）處理的超氧陰離子溫脅迫5 d 后，僅T（5/20）處理的葉綠素含量升高，其他處理均不同程度下降，且T（5/20）處理比CK顯著提高32.03%，但其他3 個處理與CK 差異不顯著。由圖3-B 可知，低溫前后，T（10）的可溶性蛋白質(zhì)含量均顯著高于CK 及其他處理；低溫5 d 后，T（10）、T（15）、T（25）、T（5/20）的可溶性蛋白質(zhì)含量分別是CK 的1.84 倍、1.26 倍、1.65 倍、1.47 倍，與CK 呈顯著差異。由圖3-C 可看出，低溫前，T（25）處理的可溶性糖含量顯著高于CK 及其他處理，而T（10）處理的可溶性糖含量則顯著低于CK 及其他處理；低溫脅迫后，T（10）和T（5/20）處理的可溶性糖含量急劇增加，分別是低溫前的3.09 倍和1.46倍；而CK 和T（25）處理分別比低溫前降低了69.18%和71.13%；低溫脅迫后，T（10）、T（15）、T（5/20）處理的可溶性糖含量均顯著高于CK，分別是CK 的2.14 倍、3.18 倍、4.04 倍。含量顯著低于CK 及其他處理；低溫5 d 后，各處理的超氧陰離子含量急劇上升，其中T（10）處理的超氧陰離子含量與CK 差異不顯著，T（15）、T（25）、T（5/20）處理的超氧陰離子含量則均顯著低于CK 和T（10）處理，且各處理中以T（5/20）的超氧陰離子含量最低，顯著低于其他處理。

圖3 不同引發(fā)溫度對低溫脅迫下番茄砧木幼苗葉綠素、可溶性蛋白質(zhì)和可溶性糖含量的影響Fig.3 Effects of different priming temperatures on chlorophyll,soluble protein and soluble sugar content of tomato rootstock seedlings under chilling stress

2.3.4 不同引發(fā)溫度對低溫脅迫下番茄幼苗葉綠素、可溶性蛋白質(zhì)和可溶性糖含量的影響 由圖3-A 可看出，低溫脅迫前，T（10）、T（15）、T（25）處理的葉綠素含量均顯著高于CK，其中T（10）處理葉綠素含量最高，T（5/20）處理與CK 差異不顯著；低

2.3.5 不同引發(fā)溫度對低溫脅迫下番茄幼苗抗氧化酶活性的影響 由圖4-A 可知，低溫脅迫前，T（25）處理的SOD 活性最高，顯著高于CK 和其他處理；低溫5 d 后，除CK 外，各處理的SOD 活性均升高，T（10）、T（15）、T（25）、T（5/20）處理分別比低溫前升高了74.41%、50.52%、8.43%、33.33%，且低溫后的SOD 活性分別是CK 的1.95 倍、1.93 倍、1.80倍和1.52 倍，均顯著高于CK。由圖3-B 可看出，低溫前T（25）和T（5/20）處理的POD 活性較高，與CK 和其他2 個處理呈顯著差異；低溫脅迫后，除T（15）處理的POD 活性升高外，其他各處理的均不同程度降低，其中CK 的降低幅度最大，較低溫前降低75.44%，T（10）、T（25）與T（5/20）處理的POD 活性則分別較低溫前降低17.69%、10.97%、44.48%，且均顯著高于CK。由圖3-C 可知，低溫后各處理CAT 活性均有所升高，其中低溫前T（25）處理的活性較高；低溫脅迫后，T（10）處理的CAT 活性較低溫前提高80.86%，且活性是CK 的2.00 倍，T（25）、T（5/20）處理的CAT 活性也均顯著高于CK。由圖3-D 可看出，低溫前CK 和T（25）處理的APX 活性顯著高于其他處理；低溫脅迫后，T（15）處理的APX活性升高，其他處理的APX 活性均降低，T（10）、T（25）、T（5/20）和CK 的APX 活性較低溫前分別降低了17.33%、45.98%、55.88%和20.43%，T（15）處理的APX 活性是CK 的1.16 倍，顯著高于CK，而其他處理均顯著低于CK。

圖4 不同引發(fā)溫度對低溫脅迫下番茄砧木幼苗抗氧化酶活性的影響Fig.4 Effects of different priming temperatures on autioxidant enzyme activities of tomato rootstock seedlings under chilling stress

2.3.6 不同引發(fā)溫度對低溫脅迫下番茄幼苗耐冷性影響的綜合評價 由表5 可見，各處理耐冷指標(biāo)的隸屬函數(shù)值均高于CK。從整體來看，T（5/20）耐冷指標(biāo)的隸屬函數(shù)值最高，其次是T（10）。在引發(fā)處理中，T（25）處理的隸屬函數(shù)值最低。說明種子引發(fā)可增強(qiáng)幼苗耐冷性，其中5 ℃/20 ℃變溫引發(fā)效果最好，其次是低溫10 ℃恒溫引發(fā)處理，常溫25 ℃引發(fā)幼苗耐冷性最差，但仍高于未引發(fā)處理CK。

3 討論與結(jié)論

種子在萌發(fā)的過程中，由于吸水過快會造成吸脹傷害，為避免這種現(xiàn)象的發(fā)生，需要適當(dāng)控制種子引發(fā)的溫度與時間[4]。前人研究表明，發(fā)芽溫度為25 ℃時，隨著引發(fā)溫度的下降，發(fā)芽效果優(yōu)于對照處理，當(dāng)引發(fā)溫度為15 ℃時，種子發(fā)芽效果最優(yōu)[23]。在本試驗中，筆者分別采用了幾種恒溫和變溫處理進(jìn)行種子引發(fā)，發(fā)現(xiàn)不同溫度引發(fā)均可改善種子發(fā)芽效果，在恒溫處理中，10 ℃和15 ℃引發(fā)后，種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)均較高，隨著引發(fā)溫度增高或降低，發(fā)芽情況均變差；在變溫處理中，5 ℃/20 ℃和10 ℃/20 ℃引發(fā)的效果好于15 ℃/20 ℃，說明在一定范圍內(nèi)晝夜溫差越大，處理效果越好。以上可能是由于低溫預(yù)處理引起種子內(nèi)源激素的變化，從而打破種子休眠，促進(jìn)其萌發(fā)[24]。同時，筆者研究發(fā)現(xiàn)引發(fā)可促進(jìn)幼苗的生長，提高壯苗指數(shù)，這與Askari 等[25]的研究結(jié)果相似，認(rèn)為由于引發(fā)處理，促進(jìn)了種子更好地萌發(fā)，從而使幼苗能夠充分利用周圍的環(huán)境及營養(yǎng)，能更好更快地生長。林多等[26]研究發(fā)現(xiàn)晝夜交替變溫處理對促進(jìn)種子萌發(fā)效果較好，筆者的研究也表明相對于恒溫引發(fā)，T（5/20）晝夜變溫引發(fā)更有利于種子萌發(fā)及幼苗生長，其次是T（15）、T（10）低溫引發(fā)，與武沖等[27]認(rèn)為對種子進(jìn)行適當(dāng)?shù)牡蜏仡A(yù)處理可增強(qiáng)幼苗生長勢具有相似的結(jié)論。而這一現(xiàn)象的產(chǎn)生可能與種子引發(fā)引起的萌發(fā)前代謝有關(guān)，從吸脹到根萌發(fā)的過程中意味著能量代謝、DNA 和膜修復(fù)機(jī)制、儲存轉(zhuǎn)錄物質(zhì)的周轉(zhuǎn)、轉(zhuǎn)錄和翻譯、細(xì)胞延伸的激活等[28]。

砧木抗性的強(qiáng)弱直接影響著嫁接苗的抗性。低溫脅迫作為番茄設(shè)施栽培中經(jīng)常遭遇的逆境之一，可引起植株活性氧的積累，且細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能被破壞，胞內(nèi)電解質(zhì)外滲，引起植物生理生化紊亂，嚴(yán)重的會導(dǎo)致植物死亡。筆者在本試驗中發(fā)現(xiàn)，與對照相比，種子蛭石引發(fā)處理可適當(dāng)降低低溫脅迫下番茄砧木幼苗的冷害指數(shù)、超氧陰離子含量（10 ℃處理除外）及電解質(zhì)滲漏率，增大可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)含量，同時提高SOD、POD 和CAT活性，從而增強(qiáng)幼苗耐冷性。這與霍文雨[29]關(guān)于蛭石引發(fā)可誘導(dǎo)番茄幼苗耐鹽性研究的結(jié)論類似。決定嫁接苗耐冷性強(qiáng)弱的另一個重要因素是砧木的根系[30]。在筆者的研究中，在低溫脅迫下各處理的幼苗根系活力均顯著高于CK，其中T（5/20）、T（10）處理的最高，其次是T（15）、T（25）處理。根系活力高則有助于吸收更多的礦物質(zhì)和水分，從而供給地上部生長發(fā)育及干物質(zhì)的積累，促進(jìn)壯苗的形成，提高幼苗逆境耐受性。綜合來看，T（5/20）處理的幼苗受低溫傷害最輕，其次是T（10）和T（15）處理，T（25）處理的效果差一些，而在幼苗未遭遇低溫逆境時，低溫引發(fā)的優(yōu)勢則不如常溫引發(fā)的優(yōu)勢明顯。對于高等植物，若在引發(fā)或鍛煉的過程中事先處于生物或非生物脅迫中，會使植物對未來遭遇的逆境更具有抵抗力[31]。這可能與種子引發(fā)過程中關(guān)鍵信號物質(zhì)及轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)水平的變化有關(guān)，這種刺激可能留下一個表觀遺傳標(biāo)記，使該區(qū)域處于“允許”狀態(tài)，促進(jìn)對后續(xù)逆境更快、更有效地反應(yīng)，因此種子時期適當(dāng)?shù)牡蜏鼗蜃儨劐憻捒稍鰪?qiáng)植株的耐冷性。

綜上所述，對種子采取適當(dāng)?shù)囊l(fā)處理可促進(jìn)萌發(fā)，并可提高幼苗的耐低溫能力。5 ℃/20 ℃晝夜變溫引發(fā)對種子發(fā)芽、幼苗生長及耐冷性的正面影響最為明顯，其次為恒溫10 ℃和15 ℃引發(fā)，生產(chǎn)中可根據(jù)生產(chǎn)條件及需求選擇適宜番茄砧木種子引發(fā)的溫度。