陳 雄 ,方宣啟 ,鄭利軍 ,陳同強(qiáng)

(1.中大檢測(cè)(湖南)股份有限公司,長(zhǎng)沙 410000;2.湖南省產(chǎn)商品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院,長(zhǎng)沙 410007)

ε-聚賴(lài)氨酸(ε-PL)作為一類(lèi)天然防腐劑,一般由25～30個(gè)賴(lài)氨酸殘基構(gòu)成。相對(duì)于其他防腐劑,ε-PL具有抗菌譜廣、穩(wěn)定性好等特點(diǎn)[1-4]。在日本,ε-PL 早已進(jìn)入消費(fèi)市場(chǎng),被添加至各類(lèi)市售食品中。在我國(guó),ε-PL 還處于研究階段,應(yīng)用前景良好[5-7]。

2014年,國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員將ε-PL 列為食品添加劑的新品種,添加量為150～250 mg·kg－1[8],涉及的食品包括焙烤食品、熟肉制品以及果蔬汁類(lèi)等。但是,ε-PL 在食品中的應(yīng)用不廣泛,其含量檢測(cè)報(bào)道較少,我國(guó)也尚未制定相關(guān)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。已報(bào)道的方法多是針對(duì)基質(zhì)簡(jiǎn)單的食品,如發(fā)酵液等,檢測(cè)方法包括比色法和高效液相色譜法(HPLC)[9-11]。然而,食品種類(lèi)繁多、基質(zhì)復(fù)雜,比色法很難滿(mǎn)足實(shí)際檢測(cè)需求;以HPLC 檢測(cè)時(shí),ε-PL較難分離,且ε-PL屬于高聚物,其色譜峰寬度普遍較大,測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確度難以保證。有研究人員采用瓊脂擴(kuò)散法[12]測(cè)定食品中ε-PL 的含量,但是該方法存在準(zhǔn)確度不好以及易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果等問(wèn)題。我國(guó)目前還未允許將ε-PL 添加至醬油中,為了解市售醬油的添加情況,本工作以醬油為待測(cè)對(duì)象,采用大孔弱酸型離子交換樹(shù)脂分離純化其中的ε-PL,并將ε-PL水解成賴(lài)氨酸,采用氨基酸分析儀進(jìn)行測(cè)定。該方法具有靈敏度高、重現(xiàn)性好、準(zhǔn)確度高等特點(diǎn),可為ε-PL 在食品工業(yè)領(lǐng)域應(yīng)用的監(jiān)管提供有力技術(shù)支撐。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Biochrom 30＋型全自動(dòng)氨基酸分析儀;BS-100N 型自動(dòng)部分收集器;BT100N 型數(shù)顯恒流泵;玻璃層析柱(20 cm×2.5 cm);UV-Vis-840型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)。

ε-PL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:1.0 g·L－1,稱(chēng)取ε-PL 標(biāo)準(zhǔn)品100 mg,用水溶解并定容至100 mL,搖勻備用。

ε-PL標(biāo)準(zhǔn)溶液系列:取適量ε-PL 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,用水逐級(jí)稀釋,配制成質(zhì)量濃度為1.0,5.0,10,20,50,100,200 mg·L－1的標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。

Amberlite IRC-50 H＋型大孔弱酸型離子交換樹(shù)脂(簡(jiǎn)稱(chēng)IRC-50 樹(shù)脂),體積全交換容量不小于3.0 mol·L－1,填料粒徑280～700μm;ε-PL 標(biāo)準(zhǔn)品純度不小于95%;雙縮脲試劑(A 液是0.1 g·mL－1氫氧化鈉溶液,B 液是0.01 g·mL－1硫酸銅溶液);鹽酸、氫氧化鈉為分析純;其他試劑為色譜純;試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

磺酸型陽(yáng)離子樹(shù)脂色譜柱;檢測(cè)波長(zhǎng)570 nm;流動(dòng)相按照儀器說(shuō)明書(shū)配制或購(gòu)買(mǎi);其他條件參照GB 5009.124－2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸的測(cè)定》。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品的預(yù)處理

取醬油樣品2～3 g,加入1～5 mL 水(視醬油黏稠情況)溶解,超聲提取30 min,以5 000 r·min－1轉(zhuǎn)速離心5 min,收集上清液。按照上述步驟重復(fù)提取1次,合并上清液,用甲酸或乙酸將溶液的酸度調(diào)至中性,待凈化。

1.3.2 IRC-50樹(shù)脂的預(yù)處理

取IRC-50樹(shù)脂,先用水浸泡除去其中破損的樹(shù)脂與雜質(zhì),再依次用10倍樹(shù)脂體積的1 mol·L－1氫氧化鈉溶液、1 mol·L－1鹽酸溶液、1 mol·L－1氫氧化鈉溶液在磁力攪拌條件下依次浸泡樹(shù)脂約5 h。每次浸泡完后,均用水洗滌樹(shù)脂2～3次,除去其中的酸、堿溶液,完成樹(shù)脂的轉(zhuǎn)型[13]。離心,棄去上層液體后,用普通漏斗將IRC-50樹(shù)脂慢慢填充至玻璃層析柱中,填充量約為層析柱體積的3/4。

1.3.3 樣品的凈化

取待凈化液(ε-PL標(biāo)準(zhǔn)溶液取5 mL)過(guò)玻璃層析柱,用0.20 mol·L－1氫氧化鈉溶液洗脫,洗脫流量為1.0 mL·min－1,用30個(gè)試管接收洗脫液,每管收集10 min。參考文獻(xiàn)[14],以考馬斯亮藍(lán)法(檢測(cè)波長(zhǎng)595 nm)示蹤,以管號(hào)為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo)繪制凈化曲線。參照ε-PL 標(biāo)準(zhǔn)溶液的收集情況,將13～21號(hào)管洗脫液合并后置于100 mL容量瓶中,用甲酸或乙酸調(diào)至中性,用水定容至刻度,待水解。

1.3.4ε-PL的水解和測(cè)定

取待水解液2.0 mL,參照GB 5009.124－2016中5.3節(jié)方法進(jìn)行水解和調(diào)節(jié)溶液酸度至中性,所得溶液用水定容至1.0 mL,按照儀器工作條件測(cè)定其水解產(chǎn)物賴(lài)氨酸的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 洗脫條件的選擇

由于樹(shù)脂的解吸率與洗脫時(shí)間相關(guān),而洗脫時(shí)間和洗脫劑氫氧化鈉溶液濃度有關(guān)。為保證ε-PL解吸完全,將最長(zhǎng)洗脫時(shí)間設(shè)定為5 h,考察了氫氧化鈉溶液濃度分別為0.05,0.10,0.15,0.20,0.25,0.30 mol·L－1時(shí)對(duì)洗脫效果的影響,結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 洗脫劑濃度對(duì)ε-PL洗脫效果的影響Tab.1 Effect of eluant concentration on the elution effect ofε-PL

由表1 可知:當(dāng)氫氧化鈉溶液濃度為0.05 mol·L－1和0.10 mol·L－1時(shí),設(shè)定的最長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)ε-PL回收率均較低(低于70.0%),說(shuō)明這兩個(gè)濃度的洗脫劑均不能使ε-PL 解吸完全;當(dāng)氫氧化鈉溶液濃度不低于0.15 mol·L－1時(shí),ε-PL 回收率均較高,且洗脫時(shí)間隨著洗脫劑濃度的升高而縮短,洗脫劑消耗量則隨之增加。洗脫是將吸附在樹(shù)脂內(nèi)部的ε-PL 釋放出來(lái)擴(kuò)散到洗脫劑里,而擴(kuò)散速率與擴(kuò)散界面兩側(cè)氫氧化鈉溶液濃度差成正比,樹(shù)脂外部氫氧化鈉溶液濃度越高,越有利于ε-PL的擴(kuò)散,洗脫時(shí)間越短[15-18]。當(dāng)氫氧化鈉溶液濃度過(guò)高時(shí),將導(dǎo)致Na＋過(guò)載,部分Na＋不能結(jié)合到樹(shù)脂上,導(dǎo)致氫氧化鈉利用率下降,氫氧化鈉消耗量增加。綜合考慮ε-PL 回收率、洗脫時(shí)間及氫氧化鈉消耗量等,試驗(yàn)選擇洗脫劑氫氧化鈉溶液的濃度為0.20 mol·L－1。

試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化了洗脫流量,結(jié)果顯示,以不同流量(0.1～2.0 mL·min－1)洗脫時(shí),ε-PL回收率均大于95.0%,且隨著洗脫流量的上升,洗脫時(shí)間縮短,洗脫劑消耗量增加。綜合考慮,試驗(yàn)選擇的洗脫流量為1.0 mL·min－1。

分取1.0 g·L－1ε-PL 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液5 mL,按照試驗(yàn)條件凈化,收集了30管溶液,1～30管內(nèi)洗脫液595 nm 處的吸光度見(jiàn)圖1。

圖1 ε-PL標(biāo)準(zhǔn)溶液的凈化曲線Fig.1 Purification curve ofε-PL standard solution

由圖1可知,洗脫液中ε-PL 主要集中在14～20號(hào)管,為充分收集目標(biāo)物,試驗(yàn)選擇使用13～21號(hào)的溶液進(jìn)行后續(xù)分析。

2.2 色譜行為

取2.0 mL 水解液,加入1 mL 雙縮脲試劑(A液0.5 mL,B液0.5 mL),于60 ℃反應(yīng)10 min后,水解液不變色,說(shuō)明ε-PL 已水解完全,其水解液的色譜圖見(jiàn)圖2。

由圖2可知,ε-PL的水解產(chǎn)物賴(lài)氨酸色譜峰為單一對(duì)稱(chēng)峰,溶液中其他成分均不干擾賴(lài)氨酸的測(cè)定。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和測(cè)定下限

按照試驗(yàn)方法處理并測(cè)定ε-PL 標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,以ε-PL的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),其對(duì)應(yīng)的水解產(chǎn)物賴(lài)氨酸的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示:ε-PL 標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍為1.0～200 mg·L－1,線性回歸方程為y＝4.503×104x－1.040×102,相關(guān)系數(shù)為0.999 2。

以3,10倍信噪比(S/N)計(jì)算檢出限(3S/N)和測(cè)定下限(10S/N),結(jié)果分別為0.02,0.06 g·kg－1。

2.4 精密度和回收試驗(yàn)

取18份陰性醬油樣品2.0 g,添加適量ε-PL標(biāo)準(zhǔn)溶液,加標(biāo)濃度水平分別為0.1,0.2,1.0 g·kg－1,每個(gè)濃度水平均做6份平行樣,按照試驗(yàn)方法測(cè)定,計(jì)算回收率和測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。結(jié)果顯示,3 個(gè)加標(biāo)濃度水平下的回收率分別為83.9%～93.4%,83.9%～97.6%和88.2%～105%,測(cè)定值的RSD 為4.0%～6.8%。

2.5 樣品分析

按照試驗(yàn)方法分析10種不同類(lèi)型市售醬油,在2種醬油中檢出了ε-PL,檢出率為20%,檢出量分別為0.3,0.5 g·kg－1,說(shuō)明市售醬油有ε-PL 添加情況,需要引起相關(guān)監(jiān)測(cè)部門(mén)重視。

本工作采用一種大孔弱酸型離子交換樹(shù)脂凈化醬油樣品,分離得到的ε-PL 水解為賴(lài)氨酸后用氨基酸分析儀測(cè)定。該方法具有靈敏、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好等特點(diǎn),可為保障我國(guó)食品質(zhì)量安全、打擊違規(guī)添加提供一定技術(shù)保障。