李諾，張東杰，張桂芳，張愛武

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，大慶 163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)國家雜糧工程技術(shù)中心；3.黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全重點實驗室）

苦蕎（Tartary buckwheat）是我國主要的小宗糧豆作物之一，被稱為“五谷之王”，它與人們所熟悉的“何首烏、大黃”等同屬蓼科，是我國藥食同源的典型代表?？嗍w多酚、黃酮類化合物是重要的生物活性物質(zhì)，包括蘆丁、槲皮素、綠原酸等多種單體酚成分，賦予了苦蕎良好的抗氧化、抗炎、防癌等功能特性，在改善人體胃腸道功能、防止心腦血管疾病方面具有積極作用[1]。

目前，關(guān)于苦蕎抗氧化活性的探究多集中于多酚、黃酮類提取物的體外抗氧化活性評價，這無法直接預(yù)測苦蕎食品對人體健康發(fā)揮的生物性價值。食品中的營養(yǎng)組分發(fā)揮其功能活性必然要經(jīng)過消化這一關(guān)鍵步驟，且只有營養(yǎng)組分在消化過程中被釋放，才能發(fā)揮其生物學(xué)意義[2]。由此可見，消化對于食品營養(yǎng)組分生物活性的影響具有重要意義。體外消化是利用仿生原理，最大程度地模擬食物在體內(nèi)消化、吸收的過程，有可操作性強、普適性廣等特點，被廣泛應(yīng)用于食品營養(yǎng)成分功能活性研究方面，是評估食物在消化過程中營養(yǎng)成分變化情況的重要技術(shù)手段[3]。因此，試驗以苦蕎為研究對象，借助體外消化模型探究其在口腔、胃、腸消化階段中總多酚、總黃酮釋放量及抗氧化活性變化，探討消化對苦蕎酚類物質(zhì)抗氧化功能特性的影響，并分析總多酚、總黃酮釋放量與抗氧化活性的關(guān)系，以期為更好的評價苦蕎消化過程中的酚類物質(zhì)的功能特性提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

苦蕎（購于大慶市北京華聯(lián)超市）；胃蛋白酶（250 U·mL-1）、胰酶（8 USP）、α-淀粉酶（5 U·mL-1）、膽汁均購于Sigma 公司；1，1-二苯基-2-苦基肼（DPPH，純度≥98%）、2，2'-聯(lián)氮-雙-3（乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）、二銨鹽（ABTS，純度≥98%）均購于上海源葉生物科技有限公司；福林酚、沒食子酸（純度≥98%）、蘆?。兌取?8%）均購于北京索萊寶科技有限公司；亞硝酸鈉、碳酸氫鈉、硝酸鋁等分析純均來自于天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.2 主要儀器與設(shè)備

AdventurerTM電子分析天平（上海奧豪斯儀器有限公司）；FW100 型高速萬能粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；DK-S24 型恒溫水浴鍋（上海森信實驗儀器有限公司）；T6 系列紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；HZQ-Q 全溫震蕩器（哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司）；H1850R 臺式高速冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 原料預(yù)處理

挑選顆粒飽滿，色澤均勻的苦蕎籽粒，清洗后低溫烘干，用萬能粉碎機粉碎，過60 目篩[4]，得到苦蕎粉樣品，在4 ℃下密封保存。

1.3.2 體外消化方法

體外消化方法參考姚軼俊等[5]方法略作修改?？谇幌悍Q取2 g 苦蕎粉加入10 mL 蒸餾水溶解，加熱沸騰熟化，隨后冷卻至室溫用蒸餾水定容至10 mL，加入口腔消化液，即含有10 mg α-淀粉酶的10mLCaCl（21mmol·L-1，pH7.0）溶液，放置在37 ℃恒溫水浴搖床中，以70 r·min-1的速度消化10min。在消化0 min 時記為初始消化，在消化0、5、10 min取樣待測。胃消化：用6 mol·L-1的HCl 溶液將完成口腔消化的消化液pH 調(diào)節(jié)至2.0，然后加入胃消化液，即10 mL 含有0.5 g 胃蛋白酶的0.1 mol·L-1的HCl溶液，在37 ℃恒溫水浴搖床中，以100 r·min-1的振蕩速度消化120 min，在消化60、120 min 取樣待測。腸消化：向胃消化結(jié)束的溶液中逐滴加入1 mol·L-1的NaHCO3，使溶液的pH 值為7.0，隨后加入腸消化液，即10 mL 含有0.25 g 胰酶、0.7 g 膽汁的0.5mol·L-1NaHCO3溶液，在37℃恒溫水浴搖床中，以100r·min-1的振蕩速度消化120min，在消化60、120 min 取樣待測。

以上所有消化階段均設(shè)置不含有消化酶的對照組，各消化階段所取的樣品待測液在4 ℃條件下，以10 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速，離心10 min，收集上清液，于-80 ℃冰箱中保存。

1.3.3 總多酚含量測定方法

根據(jù)福林-酚法進行測定[6]，分別取1 mL 的樣品待測液和沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，依次加入1 mL 福林-酚試劑，2 mL 濃度為150 g·L-1的NaCO3溶液，用蒸餾水定容至10 mL，在760 nm 處測定吸光值，以沒食子酸的不同濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照公式（1）計算，結(jié)果以每g 樣品中沒食子酸當(dāng)量表示。

式中：X 為樣品中總多酚含量（mg·g-1）；C 為總多酚濃度（mg·mL-1）；V 為提取液體積（mL）；n 為稀釋倍數(shù)；m 為樣品質(zhì)量（g）。

1.3.4 總黃酮含量測定方法

參考硝酸鋁顯色法[7]略作調(diào)整，分別取1 mL 不同濃度的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液和樣品待測液，依次加入濃度為50 g·L-1的亞硝酸鈉溶液和100 g·L-1的硝酸鋁溶液各1 mL，再加入2 mL 濃度為40 g·L-1的氫氧化鈉溶液和3 mL 蒸餾水，在510 nm 處記錄其吸光度值，繪制蘆丁濃度為0.2~1.0 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)曲線，參照公式（2）進行計算，結(jié)果以每克樣品中蘆丁當(dāng)量表示。

式中：X 為樣品中總黃酮含量（mg·g-1）；C1為總黃酮濃度（mg·mL-1）；V1為提取液體積（mL）；n 為稀釋倍數(shù)；m1為樣品質(zhì)量（g）。

1.3.5 ABTS 自由基清除率測定方法

參照Park 等[8]的方法略作調(diào)整，將適量的樣品待測液與ABTS 工作液充分混合，于25 ℃避光放置30 min，在734 nm 處測定吸光度，通過公式（3）計算樣品ABTS 自由基的清除率。

式中：Am為樣品與ABTS 工作液吸光值；An為樣品與蒸餾水吸光值；Ak為蒸餾水與ABTS 工作液吸光值。

1.3.6 羥自由基清除率測定方法

參考包怡紅等[9]方法略作調(diào)整，吸取1 mL 樣品待測液于試管中，加入1 mL 6 mmol·L-1的硫酸亞鐵溶液和水楊酸-乙醇溶液，再加入2 mL 6 mmol·L-1雙氧水溶液混勻，反應(yīng)30 min 后，在510 nm 處測定吸光度。結(jié)果按照公式（4）計算。

式中：A1為樣品組吸光值；A2為不含有雙氧水的對照組吸光值；A0為不含樣品的空白對照組吸光值。

1.3.7 DPPH 自由基清除率測定方法

參考Chen 等[10]的方法略作調(diào)整，取一定量的樣品待測液與3.5 mL 濃度為0.1 mmol·L-1的DPPH-乙醇溶液混合，25 ℃避光反應(yīng)30 min，在517 nm 處測定吸光值。按照公式（5）計算DPPH 自由基清除率。

式中：Ai為樣品與DPPH-乙醇溶液吸光值；Aj為樣品與乙醇吸光值；A0為DPPH-乙醇溶液吸光值。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 20.0 軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析和選擇鄧-肯多重比較進行差異顯著性分析，使用Excel 進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 總多酚釋放量

苦蕎在體外消化過程中總多酚釋放量變化如圖1 所示。消化組總多酚釋放量顯著大于對照組（P＜0.05）。與初始消化階段相比，口腔、胃、腸消化階段后多酚釋放增加量略有不同，口腔消化后，苦蕎總多酚釋放量略有上升，最終釋放量是初始消化的1.11 倍。胃消化階段的苦蕎總多酚在消化60 min 內(nèi)釋放量顯著增加，而后下降，最終釋放量是初始消化的1.27 倍。在腸消化階段，苦蕎總多酚釋放量持續(xù)增加，且消化釋放增加量最大，是初始消化的1.92 倍。林棟等[11]研究表明，薏米體外胃消化60 min 后與腸消化240 min 后多酚釋放量呈下降趨勢，與試驗結(jié)果一致，推測原因是隨著時間延長，導(dǎo)致其消化過度?？傊?，在體外消化條件的酸、堿以及生物酶的作用下，促進了苦蕎多酚的釋放，釋放量整體變化規(guī)律為腸消化＞胃消化＞口腔消化＞初始消化，這與文獻報道的糙米體外消化后總多酚釋放量增加研究結(jié)果具有一致性[12]。

圖1 苦蕎消化過程中的總多酚釋放量Fig.1 Total polyphenol release from tartary buckwheat during digestion

2.2 總黃酮釋放量

苦蕎在體外消化過程中總黃酮釋放量變化與總多酚釋放量變化規(guī)律相似，如圖2 所示?？嗍w在體外消化過程中，消化組的總黃酮釋放量顯著大于對照組（P＜0.05）。在各消化階段，苦蕎黃酮被不同程度的釋放。在口腔消化過程中，苦蕎總黃酮釋放量少量增加，是初始消化的1.22 倍，在胃消化階段，苦蕎總黃酮釋放量呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢，具體表現(xiàn)在消化60 min 內(nèi)顯著升高，在消化60 min 后釋放量雖所下降，但顯著大于初始消化階段，最終釋放量是初始消化的1.33 倍，在腸消化階段，苦蕎總黃酮釋放增加量最大，是初始消化的3.30 倍。由此表明，整體來看體外消化使得苦蕎黃酮的總釋放量顯著增加，各消化階段釋放量由大到小為腸消化＞胃消化＞口腔消化＞初始消化。對于在胃消化過程中出現(xiàn)釋放量下降的變化趨勢，這與苦蕎米飯在胃消化90 min后，其黃酮釋放量降低變化趨勢相符，這可能是隨著消化時間的延長，苦蕎黃酮被消化過度，也可能是由于消化酶及酸、堿極端環(huán)境的影響下，黃酮類物質(zhì)由結(jié)合態(tài)被水解為不穩(wěn)定的游離態(tài)，這極大地增加了與淀粉、蛋白、多糖等成分的結(jié)合幾率，減少了暴露在消化液環(huán)境中的官能團，導(dǎo)致其含量呈下降趨勢[13]。

圖2 苦蕎消化過程中的總黃酮釋放量Fig.2 Total flavonoids release from tartary buckwheat during digestion

2.3 體外抗氧化活性分析

2.3.1 ABTS 自由基清除率

圖3 呈現(xiàn)了在體外消化過程中，苦蕎ABTS 自由基清除率的變化規(guī)律。與對照組相比，消化組具有更強的ABTS 自由基清除能力（P＜0.05）。與初始消化相比，口腔消化10 min 內(nèi)，苦蕎ABTS 自由基清除率略有升高，是初始消化的1.33 倍，在胃消化階段的前60 min 內(nèi)ABTS 自由基清除率上升，而后雖有下降，但也顯著高于初始消化和口腔消化，分別是初始消化和口腔消化的1.79 倍和1.34 倍。在腸消化后ABTS 自由基清除率數(shù)值最大，相比于初始消化增強了1.71 倍。因此，體外消化增強了苦蕎對ABTS 自由基的清除能力，使其擁有更強的體外抗氧化活性，抗氧化活性由強到弱具體表現(xiàn)為腸消化＞胃消化＞口腔消化＞初始消化，這也說明苦蕎消化后更有利于人體抗氧化損傷。

圖3 苦蕎消化過程中的ABTS 自由基清除率Fig.3 ABTS radical scavenging rate during buckwheat digestion

2.3.2 羥自由基清除率

苦蕎在體外消化過程中的羥自由基清除率變化如圖4 所示，苦蕎消化組的羥自由基清除率明顯大于對照組（P＜0.05）。比較不同消化階段的羥自由基清除率發(fā)現(xiàn)，腸消化后的苦蕎清除羥自由基能力最強，清除率為是初始消化階段的3.92 倍；其次是胃消化后的苦蕎清除羥自由基能力，是初始消化階段的1.88 倍；然后是口腔消化后苦蕎清除羥自由基能力，是初始消化階段的1.60 倍。由此體現(xiàn)出苦蕎在各消化階段的羥自由基的清除能力呈逐漸增強變化趨勢，這與前文苦蕎消化后對ABTS 自由基清除的變化規(guī)律一致。苦蕎通過體外消化提高了其羥自由基清除能力，體現(xiàn)出更強的體外抗氧化活性，這為苦蕎抗氧化功能性食品的開發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

圖4 苦蕎消化過程中的羥自由基清除率Fig.4 Hydroxyl radical scavenging rate during buckwheat digestion

2.3.3 DPPH 自由基清除率

苦蕎體外消化過程中DPPH 自由基清除率的變化如圖5 所示，苦蕎消化組的DPPH 自由基清除率明顯高于對照組（P＜0.05）。分析不同消化時段的自由基清除率發(fā)現(xiàn)，口腔消化階段苦蕎DPPH 自由基清除率顯著上升，在胃消化階段清除率呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢；在腸消化階段，隨著消化過程的進行，DPPH 自由基清除率持續(xù)上升。整體來看，體外消化增強了苦蕎DPPH 自由基清除能力，對DPPH 自由基清除能力由強到弱的順序為腸消化＞胃消化＞口腔消化＞初始消化，結(jié)果與前兩種抗氧化評價模型試驗結(jié)果相符。與之略有不同的是體外消化后苦蕎DPPH 自由基清除率由44.10%增加至64.37%，清除 率增加量的變化幅度略小于其它兩種評價模型。

圖5 苦蕎消化過程中的DPPH 自由基清除率Fig.5 DPPH radical scavenging rate during buckwheat digestion

2.4 總多酚、總黃酮釋放量與體外抗氧化活性的相關(guān)性分析

羥自由基清除率、ABTS 自由基清除率、DPPH 自由基清除率，是考察植物多酚體外抗氧化活性的常用指標(biāo)。在試驗中，苦蕎經(jīng)體外消化后，羥自由基、ABTS 自由基、DPPH 自由基清除率顯著增加，且苦蕎消化后總多酚、總黃酮釋放量也呈顯著增加趨勢。推測苦蕎消化后抗氧化活性的增強，可能與其總多酚、總黃酮釋放量的增加有關(guān)。

分析苦蕎體外消化過程抗氧化活性的變化與總多酚、總黃酮釋放量的相關(guān)性，結(jié)果如表1 所示。在口腔消化階段，總多酚、總黃酮釋放量與羥自由基、ABTS 自由基、DPPH 自由基清除之間的相關(guān)性系數(shù)為R2=0.852-0.997；在胃消化階段，總多酚、總黃酮釋放量與羥自由基、DPPH 自由基和ABTS 自由基清除率之間的相關(guān)性系數(shù)為R2=0.792-0.904；在腸消化階段，總多酚、總黃酮釋放量與羥自由基、DPPH 自由基和ABTS 自由基清除率之間相關(guān)性系數(shù)為R2=0.971-0.989，表明在口腔、胃、腸消化階段苦蕎的抗氧化活性與總多酚、總黃酮釋放量具有較強相關(guān)性。由此可見，苦蕎在消化過程中總多酚、總黃酮的釋放對抗氧化活性具有重要作用。這與馬藝超等[14]研究表明的苦蕎面包在體外消化中黃酮釋放量增加與抗氧化活性增強呈顯著相關(guān)具有一致性。

表1 苦蕎消化過程中總多酚、總黃酮釋放量與體外抗氧化活性的相關(guān)性分析Table 1 Correlation analysis among the release of total polyphenols，total flavonoids and antioxidant activity in vitro during tartary buckwheat digestion

3 討論

體外消化是考察植物多酚生物活性的有效技術(shù)手段，在消化酶的作用下，酚類物質(zhì)發(fā)生著一系列的變化[15]。例如，α-淀粉酶通過作用于糖苷鍵使其斷裂，從而將原本與樣品中多酚、黃酮類物質(zhì)發(fā)生復(fù)合，不易被釋放的多糖分離和淀粉酶解，胃蛋白酶和胰蛋白酶會促使羧基斷裂，胰脂肪酶能水解酯鍵，進而使得結(jié)合態(tài)多酚失去束縛被釋放，增加其釋放量[16-18]。在試驗中，消化組總多酚、總黃酮釋放量顯著大于對照組，可能是由于消化組添加α-淀粉酶、胃蛋白酶、胰酶后，消化酶水解結(jié)合態(tài)多酚中與淀粉、多糖相連的糖苷鍵，破壞與纖維素、木質(zhì)素相連的酯鍵，從而使結(jié)合態(tài)多酚變成游離態(tài)多酚而被檢測到，表現(xiàn)為消化組總多酚、總黃酮釋放量顯著增加的變化趨勢，這與藜麥體外消化后結(jié)合型多酚被顯著釋放的研究結(jié)果相符[19]。

自由基清除率的測定是用于評價體外抗氧化特性的常用方法。試驗結(jié)果表明，DPPH 自由基、ABTS自由基和羥自由基清除率3 種評價指標(biāo)均顯示，體外消化能夠提高苦蕎的抗氧化活性。多酚、黃酮類物質(zhì)作為發(fā)揮抗氧化活性的主要功能成分[20]，體外消化過程中苦蕎多酚、黃酮類物質(zhì)的釋放，使體外抗氧化活性明顯增強，這與Masisi 等[21]總結(jié)的小麥、大米等多種常見谷物體外消化及抗氧化特性，發(fā)現(xiàn)胃、腸消化后，抗氧化能力的提高與總多酚含量顯著相關(guān)的實驗結(jié)果相符。盛雪飛[22]研究表明，當(dāng)黃酮單體蘆丁與黃酮單體槲皮素組合時，具有一定的協(xié)同抗氧化作用。另外，在消化酶的作用下，苦蕎中的蛋白質(zhì)和多糖可被酶解成具有抗氧化活性的多肽和低分子寡糖等抗氧化物，多酚—多糖[23]、多酚—蛋白[24-25]的相互作用可增加多酚的生物利用率，使多酚表現(xiàn)出更強的生物活性。綜上所述，苦蕎消化后抗氧化活性的增強與抗氧化物的釋放及其相互作用有關(guān)。

多篇文獻報道表明，多酚、黃酮類物質(zhì)與抗氧化活性存在相關(guān)性[26-29]。在試驗中，將苦蕎消化總多酚、總黃酮釋放量與DPPH 自由基、ABTS 自由基、羥自由基的清除率進行分析，相關(guān)性系數(shù)在0.792~0.997之間，說明總多酚、總黃酮釋放量與抗氧化具有較強相關(guān)性。陸俊等[30]研究體外胃、腸消化對6 種黑色食品多酚、黃酮釋放量及抗氧化活性的影響，結(jié)果顯示體外消化增加了多酚、黃酮釋放量，增強了其體外抗氧化活性，相關(guān)性系數(shù)為0.716~0.999，存在強相關(guān)性。林棟等[11]研究證實，薏米在胃、腸消化能夠增強其體外抗氧化活性與多酚、黃酮釋放量的增加具有強相關(guān)性。試驗結(jié)果與上述研究結(jié)果一致，證明苦蕎消化后抗氧化活性的增強與總多酚、總黃酮釋放量的增加存在較強相關(guān)性。

4 結(jié)論

體外模擬口腔、胃、腸消化與初始消化相比較，顯著增加了苦蕎多酚、黃酮類物質(zhì)的釋放（P＜0.05），總多酚、總黃酮釋放量在不同消化階段的變化規(guī)律為腸消化＞胃消化＞口腔消化＞初始消化。此外，體外消化各階段與初始消化相比，苦蕎ABTS 自由基、羥自由基、DPPH 自由基清除率顯著增強（P＜0.05），經(jīng)相關(guān)性分析表明，苦蕎的抗氧化活性與消化液總多酚、總黃酮釋放量具有強相關(guān)性，證明體外消化可以提高苦蕎的抗氧化特性。體外模擬消化是探究攝入物在消化作用影響下是否能夠發(fā)揮功能活性的重要技術(shù)手段，是連接體內(nèi)試驗與體外營養(yǎng)評價的重要橋梁，試驗意義在于借助體外消化考察苦蕎多酚、黃酮類物質(zhì)的抗氧化活性，以期為更深入全面的探究苦蕎生物利用價值及其功能性食品開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。