王超，趙長(zhǎng)江，唐子涵，陳詩思，張海燕

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院，大慶 163319）

雷帕霉素（Rapamycin，Rap）是一種新型大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，通過阻斷細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，阻滯細(xì)胞有絲分裂進(jìn)程，從而發(fā)揮抑制作用，可能參與延緩卵巢的衰老，調(diào)控原始卵泡的激活和發(fā)育分化[1-2]。已有的研究表明，雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1（mTORC1），具有調(diào)控原始卵泡的激活和發(fā)育分化的作用，并且具有延緩衰老的作用，可以延長(zhǎng)小鼠（Mus musculus）的壽命達(dá)10%～15%[3]。

20 世紀(jì)90 年代初，雷帕霉素的靶標(biāo)（TOR）首先在釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中被發(fā)現(xiàn)[4]。TOR 是磷脂酰肌醇激酶相關(guān)激酶（Pikk）家族中的一種非典型絲氨酸/蘇氨酸激酶，存在于兩個(gè)保守的復(fù)合體中，分別稱為TOR 復(fù)合體1（TORC1）和TOR 復(fù)合體2（TORC2）[5]，它能促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖[6]，是真核生物生長(zhǎng)的主要調(diào)節(jié)因子，被認(rèn)為是昆蟲體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)信號(hào)通路的主要組成部分。TOR 途徑調(diào)控幾個(gè)重要的生物學(xué)過程，包括mRNA 翻譯[7]、核糖體生物發(fā)生[8]，營(yíng)養(yǎng)代謝和自噬[9-10]。已有研究表明，在黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）的組織發(fā)育、新陳代謝、衰老、攝食行為、自噬和蛋白質(zhì)合成中，TOR 途徑都發(fā)揮重要作用[11-15]。在果蠅中，TOR 途徑的抑制會(huì)導(dǎo)致幼蟲果蠅和成年果蠅的身體尺寸減小，成蟲前發(fā)育延長(zhǎng)[16]。在埃及伊蚊（Aedes aegypti）和美洲大蠊（Periplaneta americana）中，TOR 途徑通過調(diào)節(jié)卵黃發(fā)生和保幼激素合成來促進(jìn)生殖[17-18]。在褐飛虱（Nilaparvata lugens）中，TOR 途徑通過卵黃發(fā)生調(diào)控其繁殖，NlTOR 的沉默會(huì)導(dǎo)致繁殖力下降[19]，近年來一系列的研究表明，TOR 途徑在昆蟲的生殖中具有重要的意義。但關(guān)于赤眼蜂中的TOR 途徑研究還尚未見報(bào)道，甚至與赤眼蜂相關(guān)的信號(hào)通路研究也鮮有報(bào)道。

赤眼蜂是一種廣泛應(yīng)用于生物防治的鱗翅目害蟲卵寄生蜂[20]，雄性由未受精的單倍體卵發(fā)育而來，而雌性由二倍體受精卵發(fā)育而來，這種孤雌生殖方式被稱為產(chǎn)雄孤雌生殖（Arrhenotoky）[21]。一些赤眼蜂品系由于感染了Wolbachia，不經(jīng)過交配產(chǎn)生受精卵就能產(chǎn)生雌性后代，并且雌性后代比率接近100%[22]，例如短管赤眼蜂（Trichogramma pretiosum），這種由Wolbachia 誘導(dǎo)的孤雌產(chǎn)雌生殖被稱為完全孤雌生殖（Thelytoky）[23]。在生物防治應(yīng)用中，完全孤雌生殖品系的赤眼蜂成本更低，防治效果更好，比產(chǎn)雄孤雌生殖具更高的應(yīng)用價(jià)值。

研究以乙醇為助劑采用不同濃度的雷帕霉素連續(xù)飼喂產(chǎn)雌孤雌生殖的短管赤眼蜂3 個(gè)世代，觀察統(tǒng)計(jì)各世代下不同濃度雷帕霉素處理后短管赤眼蜂的繁殖力（寄主卵變黑數(shù)）、羽化率（羽化出蜂的數(shù)量占變黑卵粒數(shù)的比值）、母代蜂存活時(shí)間（羽化后喂食雷帕霉素溶液存活時(shí)間）、發(fā)育周期（喂食雷帕霉素溶液24 h 后到子代羽化的時(shí)間）、子代蜂存活時(shí)間（羽化后不做任何處理的存活時(shí)間）及子代雄蜂比（子代雄蜂占子代總數(shù)的比值），以此來探究雷帕霉素處理導(dǎo)致的TOR 途徑抑制對(duì)短管赤眼蜂的影響，為研究TOR 途徑在短管赤眼蜂中的作用機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試蟲源

孤雌產(chǎn)雌品系短管赤眼蜂（Trichogramma pretiosum）由沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物研究室提供，在黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)養(yǎng)蟲室恒溫恒濕溫箱中使用殺胚米蛾卵連續(xù)飼養(yǎng)多代，寄主米蛾在養(yǎng)蟲室內(nèi)用面粉、玉米粉、黃豆粉和麥麩繁育多代。研究所需的供試?yán)ハx種群均在25±1 ℃，相對(duì)濕度70%±5%，光周期16 L∶8 D條件下連代飼養(yǎng)。

1.1.2 試驗(yàn)試劑

雷帕霉素（北京索萊寶科技有限公司），無水乙醇（遼寧泉瑞試劑有限公司），D-果糖（北京蘭杰柯科技有限公司），葡萄糖（遼寧泉瑞試劑有限公司），蒸餾水。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)處理

收集24 h 內(nèi)新鮮米蛾卵，使用60% 的阿拉伯樹膠將米蛾卵粘在濾紙上制成米蛾卵卡。

試驗(yàn)開始前，根據(jù)說明使用無水乙醇溶解雷帕霉素，并添加用蒸餾水配置的40% 果糖加40% 葡萄糖溶液，配置成濃度為200、400、600、800、1 000 和2 000 μmol·L-1的雷帕霉素溶液，并以相同濃度梯度配置乙醇溶液（以下稱乙醇對(duì)照組）。

試驗(yàn)分為13 組，每個(gè)處理取20 頭新羽化的短管赤眼蜂（F0代），引入用牙簽蘸取少量不同濃度雷帕霉素、乙醇溶液的指型管中，供赤眼蜂取食24 h 后接入殺胚15 min 的新鮮米蛾卵卡（約200 粒），24 h后將卵卡取出置于新的指型管中，放入25±1 ℃，相對(duì)濕度70%±5%，光周期16 L∶8 D 條件下連代飼養(yǎng)，待羽化后挑取未交配雌蜂，以同樣方法繼續(xù)飼喂200~2 000 μmol·L-1的雷帕霉素及乙醇溶液，進(jìn)行F1和F2代的處理，以取食40%果糖加40%葡萄糖溶液為對(duì)照，試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.2 觀察方法

處理后每8 h 觀察一次短管赤眼蜂存活情況，記錄存活時(shí)間。處理6 d 后，統(tǒng)計(jì)各指型管中變黑的卵粒數(shù)。每個(gè)處理隨機(jī)選擇10 個(gè)指型管，挑取20 個(gè)變黑卵粒置于新的指型管中，每隔8 h 觀察一次統(tǒng)計(jì)羽化時(shí)間，羽化后每隔4 h 觀察一次統(tǒng)計(jì)子代蜂壽命，挑取30 個(gè)變黑卵粒置于新的指型管中，羽化后統(tǒng)計(jì)單卵出蜂數(shù)及羽化率。其余10 個(gè)指型管待短管赤眼蜂全部死亡后使用體式顯微鏡根據(jù)觸角形態(tài)和外生殖器觀察鑒定雌性個(gè)體數(shù)。連續(xù)觀察三代。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

運(yùn)用Excel 2019 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，利用SPSS 26.0進(jìn)行方差分析，方差分析使用Duncan 新復(fù)極差法。

2 結(jié)果與分析

2.1 雷帕霉素和處理世代對(duì)寄生量的影響

與糖溶液對(duì)照組相比，各世代中不同濃度雷帕霉素處理的攜帶Wolbachia 的短管赤眼蜂繁殖力均有不同程度降低，并且隨著處理世代的增加降低程度逐漸加強(qiáng)（圖1）。F0～F2代中各濃度雷帕霉素對(duì)雌短管赤眼蜂寄生力均存在抑制作用，但隨著處理中雷帕霉素濃度的升高，對(duì)攜帶Wolbachia 的雌蜂寄生力的抑制作用逐漸減弱。與對(duì)照組相比，F(xiàn)0和F1代中雌蜂在200～2 000 μmol·L-1的雷帕霉素處理后的寄生力均低于糖溶液對(duì)照組的寄生力，但寄生力差異不顯著，分別為25.67～31.15 ?！ゎ^-1和24.89～30.78 ?！ゎ^-1。F2代中雌蜂在200～2 000 μmol·L-1的雷帕霉素處理后的寄生力均低糖溶液對(duì)照處理后的寄生力，23.00～26.58 ?！ゎ^-1，且在400 μmol·L-1時(shí)差異顯著，為23.00 ?！ゎ^-1，也是3 代中寄生力最低的雷帕霉素處理組。

圖1 不同濃度雷帕霉素對(duì)短管赤眼蜂寄生力的影響Fig.1 Effects of different concentrations of rapamycin on parasitism of Trichogramma pretiosum

2.2 雷帕霉素和處理世代對(duì)壽命的影響

對(duì)于雷帕霉素處理組，與糖溶液對(duì)照組相比，各世代中不同濃度雷帕霉素處理對(duì)雌蜂壽命的影響均偏向縮短攜帶Wolbachia 的短管赤眼蜂壽命，F(xiàn)0代中雌蜂在200～2 000 μmol·L-1的雷帕霉素處理后雌蜂的壽命除2 000 μmol·L-1外均低對(duì)照組雌蜂壽命，為198.29～237.55 h，但差異不顯著；F1代中雌蜂在200～2 000 μmol·L-1的雷帕霉素處理后雌蜂的壽命除200 μmol·L-1外均低對(duì)照組雌蜂壽命，為131.63～193.89 h，且在400、600、800、2 000 μmol·L-1時(shí)差異顯著，分別為145.20、143.47、131.63、163.82 h；F2代中雌蜂在200～2 000 μmol·L-1的雷帕霉素處理后雌蜂的壽命除200 μmol·L-1外均低對(duì)照組雌蜂壽命，為184.20～214.20 h，但差異均不顯著（圖2）。

圖2 不同濃度雷帕霉素對(duì)短管赤眼蜂母代蜂壽命的影響Fig.2 Effects of different concentrations of rapamycin on the longevity of female generation of Trichogramma pretiosum

2.3 雷帕霉素和處理世代對(duì)發(fā)育歷期的影響

與糖溶液對(duì)照組相比，各世代中不同濃度雷帕霉素處理對(duì)子代發(fā)育歷期的影響均不顯著（圖3），F(xiàn)0代中，200～2 000 μmol·L-1的雷帕霉素處理后短管赤眼蜂子代發(fā)育歷期為231.60～234.00 h，差異不顯著；F1代中，200～2 000 μmol·L-1的雷帕霉素處理后短管赤眼蜂子代發(fā)育歷期為237.60～245.70 h，差異不顯著；F2代中，200～2 000 μmol·L-1的雷帕霉素處理后短管赤眼蜂子代發(fā)育歷期為233.63～238.74 h，差異不顯著。在不同濃度雷帕霉素對(duì)短管赤眼蜂子代發(fā)育歷期的影響中糖溶液對(duì)照組在3 代間是存在顯著差異的，短管赤眼蜂發(fā)育歷期本身存在波動(dòng)性。

圖3 不同濃度雷帕霉素對(duì)短管赤眼蜂子代發(fā)育歷期的影響Fig.3 Effects of different concentrations of rapamycin on the development duration of offspring of Trichogramma pretiosum

2.4 雷帕霉素和處理世代對(duì)子代羽化率的影響

與糖溶液對(duì)照組相比，各世代中不同濃度雷帕霉素處理對(duì)攜帶Wolbachia 的短管赤眼蜂羽化率的影響具有很大的波動(dòng)性（圖4），在F1代中，400～1 000 μmol·L-1的雷帕霉素降低羽化率，其它濃度處理下羽化率均不低于對(duì)照組，但差異不顯著；在F2代中，只有400 和2 000 μmol·L-1的雷帕霉素降低羽化率，其它濃度處理下羽化率均不低于對(duì)照組，但差異不顯著；在F3代中，200～2 000 μmol·L-1的雷帕霉素均降低羽化率，且在400～800 μmol·L-1時(shí)差異顯著，為80.00%、80.00%、85.00%。

圖4 不同濃度雷帕霉素對(duì)短管赤眼蜂子代羽化率的影響Fig.4 Effects of different concentrations of rapamycin on eclosion rate of offspring of Trichogramma pretiosum

2.5 雷帕霉素和處理世代對(duì)單卵出蜂數(shù)的影響

不同世代的糖溶液對(duì)照組子代單卵出蜂數(shù)在0.95～1.00 ?！ゎ^-1之間，無顯著差異。各世代中不同濃度雷帕霉素處理對(duì)子代單卵出蜂數(shù)的影響均不顯著（圖5）。對(duì)于雷帕霉素處理組，F(xiàn)1～F3代取食雷帕霉素溶液的赤眼蜂寄生的米蛾卵單卵出蜂數(shù)在0.80～1.05 ?！ゎ^-1之間，F(xiàn)2代400 μmol·L-1時(shí)單卵出蜂數(shù)最少，為0.80 ?！ゎ^-1，F(xiàn)1代2 000 μmol·L-1時(shí)單卵出蜂數(shù)最多，為1.05 ?！ゎ^-1，但與對(duì)糖溶液照組相比差異均不顯著（圖5）。

圖5 不同濃度雷帕霉素對(duì)短管赤眼蜂單卵出蜂數(shù)的影響Fig.5 Effects of different concentrations of rapamycin on the number of Trichogramma pretiosum emerging from a single egg

2.6 雷帕霉素和處理世代對(duì)子代存活時(shí)間的影響

不同世代的糖溶液對(duì)照組子代平均存活時(shí)間在18.67～22.42 h 之間，無顯著差異。對(duì)于雷帕霉素處理組，F(xiàn)0～F2代取食雷帕霉素溶液的赤眼蜂子代平均存活時(shí)間分別在20.59～25.00 h、16.74～19.55 h、18.75～21.67 h 之間，與糖溶液對(duì)照組相比差異均不顯著。但值得注意的是，在F2代中，400、600、800 μmol·L-1相比于F1代短管赤眼蜂子代的存活時(shí)間顯著縮短（圖6）。

圖6 不同濃度雷帕霉素對(duì)短管赤眼蜂子代存活時(shí)間的影響Fig.6 Effects of different concentrations of rapamycin on survival time of offspring of Trichogramma pretiosum

2.7 雷帕霉素和處理世代對(duì)短管赤眼蜂子代性別的影響

結(jié)果表明，雷帕霉素對(duì)短管赤眼蜂子代性別無影響，各世代中200～2 000 μmol·L-1濃度的雷帕霉素處理和相應(yīng)濃度的乙醇處理短管赤眼蜂子代雌蜂占比均為100%，不存在雄蜂。

2.8 無水乙醇和處理世代對(duì)短管赤眼蜂壽命的影響

隨著處理世代的增加，乙醇對(duì)短管赤眼蜂母代蜂壽命的影響呈現(xiàn)出縮短的趨勢(shì)。與對(duì)照組相比，F(xiàn)0代各濃度乙醇處理下短管赤眼蜂母代蜂壽命為197.05～258.95 h，無顯著差異；F1代各濃度乙醇處理下短管赤眼蜂母代蜂壽命為153.00～234.00 h，在200和2 000 μmol·L-1時(shí)差異顯著；F2代各濃度乙醇處理下短管赤眼蜂母代蜂壽命為157.89～199.20 h，在600、800 和2 000 μmol·L-1時(shí)差異顯著（圖7）。

圖7 不同濃度乙醇對(duì)短管赤眼蜂母代蜂壽命的影響Fig.7 Effects of different concentrations of ethanol on the life span of Trichogramma pretiosum

3 討論

研究通過雷帕霉素處理的方式對(duì)短管赤眼蜂的TOR 進(jìn)行抑制，探究雷帕霉素處理導(dǎo)致的TOR 途徑抑制對(duì)短管赤眼蜂的影響，為研究TOR 途徑在短管赤眼蜂中的作用機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。因?yàn)槔着撩顾貥O微溶于水，但溶解于有機(jī)溶劑，而雷帕霉素的常用溶劑二甲基亞砜（DMSO）經(jīng)實(shí)驗(yàn)室前期研究證明，并不適合在赤眼蜂喂食相關(guān)試驗(yàn)中作為高濃度雷帕霉素的助劑，所以研究采用對(duì)短管赤眼蜂影響較小的乙醇作為助劑。

在果蠅的卵巢中，TOR 對(duì)生殖干細(xì)胞（GSC）和早期囊腫的增殖、維持和生長(zhǎng)是必需的[24]，TOR 通路和InR 促進(jìn)卵巢體細(xì)胞和生殖細(xì)胞系的增殖，而研究從繁殖力統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，TOR 的抑制會(huì)導(dǎo)致攜帶Wolbachia 的短管赤眼蜂雌蜂繁殖能力的降低。鄧瑤[25]研究發(fā)現(xiàn)，TOR 基因的表達(dá)被抑制后，通過解剖并觀察卵巢的發(fā)育發(fā)現(xiàn)，注射dsTOR 的白背飛虱（Sogatella furcifera）由于TOR 調(diào)控昆蟲VG 和FOXO的表達(dá)，雌蟲卵巢內(nèi)不能形成卵，從而導(dǎo)致產(chǎn)卵被抑制；宋小平[26]研究表明，較高濃度的雷帕霉素會(huì)對(duì)瑪雅臂尾輪蟲（Brachionus urceus）的生殖產(chǎn)生不利影響，顯著減少瑪雅臂尾輪蟲的子代數(shù)目，這種不利影響源自于高濃度的雷帕霉素會(huì)對(duì)TORC2 產(chǎn)生抑制性影響，這種影響會(huì)對(duì)生物體健康產(chǎn)生負(fù)面作用，研究中的結(jié)果均與之相符。

雖然研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TOR 的抑制會(huì)導(dǎo)致寄生力的降低，但是不能確定TOR 是唯一的因素，因前人使用抗生素處理攜帶Wolbachia 的短管赤眼蜂的研究中認(rèn)為是抗生素去除了Wolbachia 或Wolbachia 滴度降低導(dǎo)致的寄生力下降。研究中高濃度抗生素并未去除攜帶Wolbachia 的短管赤眼蜂體內(nèi)的Wolbachia，卻得到相同結(jié)果（降低寄生力），所以認(rèn)為除了TOR的影響外，在生殖力降低的效果中，抗生素本身引起的副作用是一個(gè)不可忽視的重要原因。并且對(duì)于第3代之后攜帶Wolbachia 的短管赤眼蜂雌蜂繁殖能力是否會(huì)繼續(xù)降低，需要進(jìn)一步證實(shí)。雷帕霉素引起的TOR 抑制對(duì)攜帶Wolbachia 的短管赤眼蜂子代羽化率影響具有代際間的波動(dòng)性，且2 000 μmol·L-1以下各個(gè)濃度的乙醇都會(huì)對(duì)攜帶Wolbachia 的短管赤眼蜂子代的羽化和壽命造成影響。

在雷帕霉素剛被發(fā)現(xiàn)時(shí)，研究人員主要關(guān)注點(diǎn)是其作為免疫抑制劑的潛力[27]，在mTOR 途徑被發(fā)現(xiàn)是酵母和線蟲（Caenorhabditis elegans）的重要衰老調(diào)節(jié)因子后，才開始研究雷帕霉素的抗衰老能力[28-29]。研究是首次針對(duì)赤眼蜂壽命進(jìn)行研究。雷帕霉素對(duì)于細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)是通過影響mTOR 通路實(shí)現(xiàn)，雷帕霉素可通過抑制TOR 誘導(dǎo)和促進(jìn)細(xì)胞自噬并消除各種衰老蛋白來延長(zhǎng)生物體的壽命，這在果蠅和蠕蟲中已經(jīng)得到證實(shí)[30-31]。但研究發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素對(duì)攜帶Wolbachia 的短管赤眼蜂不具有延長(zhǎng)壽命的效果，甚至在F1代的400、600、800、2 000 μmol·L-1時(shí)顯著縮短短管赤眼蜂壽命，通過乙醇對(duì)照組對(duì)短管赤眼蜂壽命的影響，推測(cè)這是乙醇助劑引起的負(fù)面反應(yīng)，排除助劑的影響，雷帕霉素應(yīng)該具有延長(zhǎng)攜帶Wolbachia 的短管赤眼蜂的作用。

研究中雷帕霉素處理后與攜帶Wolbachia 的短管赤眼蜂子代相關(guān)的各個(gè)指標(biāo)，其中寄生力、羽化率和壽命影響較明顯，其它指標(biāo)包括子代發(fā)育歷期、子代存活時(shí)間、性比和單卵出蜂數(shù)等，與助劑對(duì)照組相比均無顯著差異，研究結(jié)果證明了雷帕霉素引起的TOR 抑制效果并不會(huì)遺傳給子代。

4 結(jié)論

雷帕霉素對(duì)短管赤眼蜂具有降低寄生力、延長(zhǎng)壽命、降低羽化率的作用；雷帕霉素對(duì)短管赤眼蜂發(fā)育歷期影響不顯著，并且不會(huì)改變孤雌產(chǎn)雌短管赤眼蜂的生殖方式；雷帕霉素對(duì)短管赤眼蜂母代蜂的影響不會(huì)遺傳給子代。