鄧云烜,丁威威,劉寶晨,楊 超,解廷斌

南京大學醫(yī)學院附屬金陵醫(yī)院(東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院)普通外科研究所,南京 210000

腹腔感染(intra-abdominal infection,IAI)是腹部創(chuàng)傷治療中的關鍵問題,其挑戰(zhàn)性來源于病原體的多樣性、耐藥性增加以及患者的復雜生理反應[1]。據(jù)統(tǒng)計,IAI是腹部創(chuàng)傷患者晚期死亡的主要原因[2],因此早期診斷與干預有助于改善患者預后。

IAI患者通常會接受預防性或治療性的抗生素使用,腹腔及血液樣本中的病原體數(shù)量往往偏低,因此直接涂片鏡檢不適用;其次,由于許多病原體的抗原存在變異,缺乏特異性的檢測抗體對其進行識別,血清學檢測方法應用有限[3];而分子生物學診斷方法雖然可從基因水平上對病原體進行鑒定,但由于腹腔感染的病原體種類繁多且構成不確定,預設感染病原體進行驗證性診斷無法確保診斷的全面性,因此適用性不強[4]。現(xiàn)階段,臨床應用最為廣泛的仍然是微生物培養(yǎng)方法,也是感染診斷的金標準,培養(yǎng)得到的菌株可以進行生化反應、藥敏試驗等進一步分析,為臨床提供有價值的信息,但培養(yǎng)方法的周期長,且受限于樣本質量(微生物數(shù)量及類別),陽性率往往偏低。因此,亟需一種不依賴于微生物表型的檢驗技術以提高病原體診斷效率。

近年來,宏基因組二代測序(meta-genomic next-generation sequencing,mNGS)作為新興的微生物鑒定和傳染病診斷技術,以其快速、高效、無偏檢測微生物的優(yōu)勢,已廣泛應用于臨床感染性疾病的診療[5]。在符合推薦適應證的情況下,mNGS對不同感染性疾病的診斷價值存在差異[6],但其在腹部創(chuàng)傷合并IAI的診療中仍具有較大潛在價值。因此,本研究旨在描述mNGS對腹部創(chuàng)傷合并IAI診療的影響并評估其臨床診斷價值。

資料與方法

1 納入與排除標準

本研究回顧分析2020年8月—2022年4月收住南京大學醫(yī)學院附屬金陵醫(yī)院普通外科ICU的腹部創(chuàng)傷疑似合并IAI的患者110例。納入標準:(1)年齡≥18歲的腹部創(chuàng)傷患者,簡明損傷定級標準(abbreviated injury scale,AIS)評分≥3分;(2)根據(jù)臨床表現(xiàn)、影像學及實驗室檢查診斷為疑似/存在IAI,且病情較危重,符合《宏基因組高通量測序技術應用于感染性疾病病原檢測中國專家共識》(下文簡稱共識)[7]中所推薦的臨床適應證;(3)樣本:通過局部穿刺、手術或腹腔引流管留取腹腔引流液(peritoneal drainage,PD)樣本,同時留取外周靜脈血樣本;(4)檢測方法:同時進行血液及PD微生物培養(yǎng)與mNGS。排除標準:(1)病例資料缺失;(2)合并嚴重顱腦損傷(頭部AIS評分≥3分)。疑似IAI診斷標準:病史、查體、實驗室檢查、影像學檢查及穿刺等[8]。確診依賴于陽性病原學檢測結果。收集患者的人口學資料及臨床基線參數(shù),包括損傷情況、感染診斷、血液炎癥指標、mNGS和微生物培養(yǎng)的檢測結果以及治療調(diào)整情況。患者均已簽署知情同意書,本研究已通過醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準(2020NZKY-011-01)。

2 樣本檢測

收集的標本在采集后4h內(nèi)送至臨床微生物實驗室進行微生物培養(yǎng)。將同時留取的另一份標本置于干冰保存進行mNGS檢測。使用QIAamp DNA微量試劑盒(凱杰,希爾登,德國)從樣本中提取DNA,然后以QIAseq超低輸入文庫試劑盒(Illumina,加利福尼亞州,美國)構建DNA文庫;使用Qubit(賽默飛世爾,馬薩諸塞州,美國)和安捷倫2100生物分析儀(安捷倫科技,馬薩諸塞州,美國)評估文庫質量,高質量文庫在NextSeq 500平臺(Illumina,加利福尼亞州,美國)上進行循環(huán)測序,每個循環(huán)均設陰性和陽性對照。之后進行數(shù)據(jù)分析,去除較短或低質量的序列,并與人類參考基因數(shù)據(jù)庫(hg38)對比后,進一步過濾人源DNA,最終剩余的序列與美國國家生物信息中心微生物基因組數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes)進行比對。

3 感染性病原體的定義

感染性病原體為文獻報道的具有致病性的微生物,并且致病特點與臨床癥狀相符,并排除污染。由于病毒和支原體不是常見的IAI病原體,本研究不包括mNGS檢測到的病毒和支原體。如果測定細菌或真菌滿足以下mNGS閾值之一,則判定為陽性:(1)細菌或真菌的相對豐度>30%;(2)組織病理學檢查和(或)微生物培養(yǎng)陽性;(3)血液及PD均檢測到符合致病特點的病原體;(4)單種細菌>50個特異序列,單種真菌>1個特異序列。

4 統(tǒng)計學分析

結 果

1 患者納入及臨床資料

根據(jù)納入標準,共有43例嚴重腹部創(chuàng)傷存在/疑似合并IAI患者納入研究,其中4例因臨床資料不完整被排除,2例因存在嚴重顱腦損傷被排除,最終納入37例。根據(jù)微生物培養(yǎng)以及mNGS檢測結果,最終確診IAI患者32例,非IAI患者5例(圖1)?；颊叩娜丝趯W及臨床資料比較見表 1。IAI組中,患者的損傷嚴重程度較高,ISS為19(14,27)分,取檢時間為13(7,24)d,感染原因的前三位依次為腸瘺(n=11)、腹腔殘余感染(n=10)及胰腺周圍組織感染(n=7)。IAI組與非IAI組相比,取檢時間更長,APACHE II評分更高,ICU住院時間更長,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

SICU:外科重癥監(jiān)護室;AIS:簡明損傷定級標準;PD:腹腔引流液;IAI:腹腔感染

表1 納入患者的人口學及臨床資料比較[M(P25,P75),n]

2 不同檢測方法的診斷效能比較

筆者對四種檢測方法的診斷性能進行評估,包括PD微生物培養(yǎng)、PD mNGS、血液微生物培養(yǎng)及血液mNGS。對于陽性結果報告時間,mNGS較微生物培養(yǎng)顯著縮短(22.0hvs.61.5h,P<0.05),見圖2。在診斷IAI方面,PD mNGS顯示出較高的靈敏度及陰性預測值(均為1.000),微生物培養(yǎng)僅為0.343及0.192,但PD mNGS特異度(0.600)及陽性預測值(0.941)低于PD微生物培養(yǎng),特異度差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,表2),兩種方法診斷IAI的受試者工作曲線(receiver operating curve,ROC)的曲線下面積(area under curve,AUC)分別為0.800及0.672(P<0.05),見圖3。血液微生物培養(yǎng)的陽性預測值及特異度均為1.000,陰性預測值為0.147,靈敏度為0.094。血液mNGS的陽性預測值為0.964,診斷特異度為0.800,與血液微生物培養(yǎng)無明顯差異(P>0.05);陰性預測值為0.444,靈敏度為0.843,均高于血液微生物培養(yǎng)方法,其中靈敏度差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),兩種方法診斷IAI的ROC的AUC分別為0.822及0.547(P<0.05)。

mNGS:宏基因組二代測序;****P<0.001

PD:腹腔引流液;mNGS:宏基因組二代測序;IAI:腹腔感染;ROC:受試者工作曲線

表2 不同檢測方法對IAI診斷效能的比較(95%CI)

3 IAI患者的病原學結果分析

對32例確診IAI患者的微生物培養(yǎng)及mNGS檢出病原體進行分析,血液及PD mNGS病原體的檢出率分別為75.0%(24/32)及90.6%(29/32),均顯著高于微生物培養(yǎng)。且檢出病原體類別多于微生物培養(yǎng),去除對IAI意義不明的病毒以及支原體后,共檢出革蘭氏陰性菌36種,革蘭氏陽性菌11種,真菌10種,檢出率前三的革蘭氏陰性菌依次為肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌及大腸埃希菌,檢出率最高的革蘭氏陽性菌為腸球菌屬,真菌為念珠菌屬。在兩種樣本中,mNGS對各病原體的檢出率均高于或等于培養(yǎng)方法,血液樣本中,肺炎克雷伯菌差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),PD樣本中,肺炎克雷伯菌和鮑曼不動桿菌差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖4。

PD:腹腔引流液;mNGS:宏基因組二代測序

根據(jù)陽性病原體的診斷標準對檢測結果進行分析,確定可能的致病微生物構成,mNGS對革蘭氏陽性菌的檢出率為46.9%(15/32),對真菌的檢出率為43.8%(14/32),對多病原體的混合感染檢出率為84.4%(27/32),均顯著高于微生物培養(yǎng)方法(28.1%,P<0.05)。見圖5。

mNGS:宏基因組二代測序;*P<0.05,***P=0.001

4 mNGS代表性病例

在病例3中,患者PD呈現(xiàn)明顯膿性,mNGS結果中星座鏈球菌未達陽性標準,棲牙普雷沃菌為口腔定植菌,無引起IAI相關報道。因此,PD微生物培養(yǎng)更符合患者病史及臨床表現(xiàn),mNGS出現(xiàn)假陽性結果可能與取檢不規(guī)范或不一致有關。在病例32中,患者存在發(fā)熱及腹腔積液,PD及血液mNGS均檢出大量厭氧菌,并非IAI常見致病菌,同時,正常人血液中含有少量厭氧菌核酸,因此判斷患者并非IAI。在病例37中,PD mNGS顯示存在多種病原體,其中只有銅綠假單胞菌相對豐度>30.0%,血液mNGS檢出的鳥腸球菌特異序列數(shù)偏低,同時由于患者胰周感染嚴重,因此認為銅綠假單胞菌及屎腸球菌為責任微生物。

在病例15中,患者腹部術后反復高熱,且存在高位脊柱損傷,自主呼吸無力,疑似感染源為腹腔及呼吸系統(tǒng),進行血液及PD mNGS檢測發(fā)現(xiàn),血液中存在鮑曼不動桿菌,PD中存在序列數(shù)較少的腸道細菌,后續(xù)肺泡灌洗液微生物培養(yǎng)也提示存在大量鮑曼不動桿菌,因此排除IAI,針對肺部感染強化治療。在病例18中,患者為腹部受擊后不明原因引起的腹膜后膿腫,術中PD及外周血mNGS提示存在大量魚腥味錐形桿菌,查閱資料知該菌為口腔致病菌,產(chǎn)硫化氫,與術中膿腔大量惡臭膿液相符,進一步檢查患者口腔發(fā)現(xiàn)存在較多齲齒且入院前一周有過高熱,因此推斷患者為免疫低下致血行感染而繼發(fā)后腹膜血腫感染。見表3。

表3 部分代表性病例病原學信息

討 論

嚴重創(chuàng)傷導致機體生理功能紊亂和免疫機能下降,隨著病原體暴露風險的增加,感染發(fā)生率較高[9]。據(jù)統(tǒng)計,腹部創(chuàng)傷患者晚期死亡的主要原因為IAI[1]。因此,對感染早期識別與針對性治療,對改善患者的預后至關重要,同時凸顯了病原體鑒定技術在感染診療中的關鍵作用。

在目前臨床常用的微生物檢測方法中,血清學檢驗存在交叉反應和抗原變異的問題,熒光定量聚合酶鏈式反應(quantitative polymerase chain reaction,qPCR)需要預設病原體類別進行篩選,涂片鏡檢則缺乏特異性。因此,微生物培養(yǎng)仍然是IAI臨床診療中應用最廣泛的微生物分離鑒定技術,但存在陽性率低、時效性差等問題[10],限制了抗生素的合理使用。

本研究顯示,與微生物培養(yǎng)相比,mNGS的結果反饋時間短,診斷時效性更強。同時,mNGS受預先抗生素使用的影響較小,對IAI的識別能力顯著優(yōu)于微生物培養(yǎng)。此外,mNGS識別病原體的種類及數(shù)目顯著多于微生物培養(yǎng),與本研究結果一致,其無偏檢測病原體的特性使其對混合感染的識別能力較強[5],其中真菌、革蘭氏陽性菌等類別病原體的檢出對指導抗生素使用具有重要價值。

既往研究顯示,臨床血液微生物培養(yǎng)陽性百分比呈下降趨勢,陽性率最低至9.9%[11],本研究中血液微生物培養(yǎng)陽性率僅為9.4%(3/32),這可能是由于大部分患者已預先使用廣譜抗生素,降低了血液中病原體的數(shù)量。Miao等[12]發(fā)現(xiàn)抗生素使用對mNGS結果影響較小,表明致病微生物的核酸可在患者血液中留存更長的時間。在本研究中,血液mNGS顯示出更高的陽性率(28/32,87.5%)和較好的診斷性能,在預先抗生素使用的情況下,即便是常規(guī)容易微生物培養(yǎng)的病原體,mNGS仍然具有更強的檢測能力。因此,對于抗生素使用時間較長的感染患者,mNGS是一種較為理想的選擇。

雖然PD和血液mNGS均顯示出較高的診斷靈敏度,但mNGS的結果解讀仍然存在困難[7]。在IAI中,多病原體及罕見病原體的檢出十分普遍,如何判斷它們對感染的貢獻是目前該技術臨床應用的一大難點[5,7]。2021年一項多中心回顧性隊列研究顯示,82例血液mNGS陽性率雖達到61%,但僅在7.3%的病例中產(chǎn)生了積極影響。說明當檢出結果不足以對現(xiàn)有治療產(chǎn)生影響,以及無法完全明確檢出結果是否疾病驅動因素時,該技術的臨床價值有限[6]。2021年初發(fā)布的中國專家共識也指出了這一問題,并對相關概念、適應證及檢測流程進行了規(guī)范,但因實驗室及疾病差異,并未對陽性閾值做出明確推薦[7],因此仍需要更多元的研究進一步積累相關數(shù)據(jù)。共識也指出,對于核酸提取破壁困難的如真菌(如曲霉菌、毛霉菌、隱球菌等),即使特異序列數(shù)較少也應當考慮為致病菌,并進行三方驗證[7]。本研究中對于多病原體同時存在的情況,依據(jù)文獻中較多使用的標準對相對豐度低(<30%)、特異序列數(shù)少(<50個)、臨床致病性不明確及潛在污染病原體(如表皮葡萄球菌、部分單胞菌屬等)予以去除[13],同時針對本中心患者病程特點,將真菌陽性標準進行了放寬(>1個特異序列數(shù))。目前有部分研究通過微生物引起的特異性免疫反應與細胞因子變化,或是代謝物分析、生物信息學分析和微生物組分析來探究致病微生物所引起的特異性改變,以區(qū)分致病與定植、污染微生物,提高診斷準確性,但尚需要相關的臨床研究來表明其實際區(qū)分能力[14-15]。

由于病情及評價標準的差異,目前對mNGS臨床獲益的研究結果不一[6,16]。在本研究中,將病原體檢測結果進行評估篩選后,對現(xiàn)有抗生素抗菌譜覆蓋不足的病例進行了調(diào)整;但對于檢出窄譜病原體的病例,考慮到治療風險,在患者感染源及感染癥狀未充分控制前,并未進行相應的調(diào)整。而對于醫(yī)院常見病原體的檢出,在綜合患者病史、臨床表現(xiàn)及抗感染治療反應等信息后,筆者對細菌耐藥性進行了推斷,并在此基礎上進行不同抗菌活性抗生素的調(diào)整。雖然目前部分mNGS報告中增加了對耐藥基因信息的描述,但基因定位和表型存在等問題尚未完全解決,因此僅能作為參考,具體推斷仍需結合臨床。

本研究也存在一些不足。首先,微生物培養(yǎng)和mNGS都缺乏客觀的標準來確定檢測到的致病微生物是來自感染、定殖還是污染,而是依賴于臨床醫(yī)師的主觀判斷,這在結果解釋性上存在不足。其次,研究沒有在基因水平上用額外的分子方法進行驗證。第三,研究為單中心回顧性研究,數(shù)據(jù)有限且積累不受研究者控制而存在偏倚。

本研究顯示,對于腹部創(chuàng)傷合并IAI的患者,mNGS的總體診斷性能優(yōu)于微生物培養(yǎng)方法,且在診斷混合感染及罕見病原體感染方面具有獨特的優(yōu)勢,隨著技術的成熟與成本的降低,有望改變現(xiàn)有IAI的診療范式,促進個體化的精準治療。未來需進一步的前瞻性研究表明mNGS的臨床價值。

作者貢獻聲明：鄧云烜:研究構思及設計、文獻調(diào)研;數(shù)據(jù)收集、整理、分析及文章撰寫;丁威威、劉寶晨:研究構思及設計;楊超:文章修改和審查;解廷斌:結果解釋